本申请涉及脑损伤治疗的靶点和药物。 具体而言， 本申请涉及治疗脑损伤的 TRPC6靶点， 以及通过该靶点治疗脑损伤的方法和药物。 背景技术

神经退行性疾病是大脑和脊髓的细胞神经元丧 失的疾病状态。 大脑和脊髓由神 经元组成， 神经元有不同的功能， 如控制运动， 处理感觉信息， 并作出决策。 大脑和 脊髓的细胞一般是不会再生的， 所以过度的损害可能是毁灭性的， 不可逆转的。 神经 退行性疾病是由神经元或其髓鞘的丧失所致， 随着时间的推移而恶化， 导致功能障 碍。 神经退行性疾病按表型分为两组： 一类影响运动， 如小脑性共济失调； 一类影 响记忆以及相关的痴呆症。 神经退行性疾病通常包括： 阿尔茨海默氏病、 肌肉萎缩性 侧索硬化症、 共济失调毛细血管扩张症、 牛海绵状脑病、 克雅二氏病、 亨廷顿氏病、 小脑萎缩症、 多发性硬化症、 帕金森氏病、 原发性侧索硬化、 和脊髓性肌萎缩症。 因 此，如何保护神经元免受各种伤害而丧失对于 预防和治疗神经退行性疾病是非常重要 的。

脑缺血， 俗称中风， 是一种由于瞬间脑部血液供应不足而引起脑细 胞死亡或者 损伤的病理过程。脑缺血可以分为局灶性脑缺 血和全脑缺血， 前者是由于脑中部分血 管栓塞或者破裂造成的这部分血管相应的供血 区域发生了缺血，多见于脑梗塞或脑溢 血等情况中； 而后者多见于溺水或者心肌梗死等情况下的整 个脑部血液供应不足。

在局灶性脑缺血中， 由栓塞血管直接供血的区域， 其血流量可以降低到 15 %以 下甚至更低， 这部分组织将发生不可逆的病变和细胞死亡， 称为中心梗塞区； 而其间 接供血的区域， 由于还有其他侧支循环供血， 所以血流量下降幅度小于中心区， 一般 降低到 60— 80 %以下， 这部分组织多发生非功能性的损伤或延迟性细 胞死亡， 如果 及时恢复血流供应或及时治疗， 是可以挽救该区域的细胞死亡及组织损伤的； 这样的 区域一般称为半影区。 由于半影区细胞死亡的延迟性及可逆性， 科学研究多集中在这 个领域， 以减少半影区细胞死亡和最终脑梗塞面积为目 的。 二十世纪八十年代后期， 局灶性脑缺血的动物模型的建立为缺血性神经 元死亡机制的研究提供了良好的平台。

脑缺血过程中， 神经元是最敏感且耐受性最低的一类细胞。 怎样保护神经元不

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确认本 受损伤、 不死亡就成了脑缺血研究领域中的一个重要问 题。 近几十 来， 关于缺血性. 神经元死亡机制的研究数不胜数， 主要概述为以下几个方面： 谷氨酸兴奋毒作用， 细 胞凋亡， 炎症反应以及离子浓度失衡引起的细胞损伤等 。针对以上这些神经元死亡机 制， 研究人员开发了很多药物， 以干扰这些破坏型通路的启动或者进行。 然而， 在脑 缺血的临床治疗、 应用方面， 这些策略的效果却不尽如人意。

经典型瞬时受体电势通道 （Transient Receptor Potential channel, 简称 TRPC通 道）是一类近年来发现的通道蛋白家族，从 1995年首次发现至今，人们已经发现 TRPC 通道在神经系统、 免疫系统、 血液循环系统、 肾脏、 肺脏、 脾脏、 卵巢和平滑肌等多 个系统和组织器官中均有表达 （ "TRPC6与肾脏疾病" ， 国际病理科学与临床杂志， 2008年 10月， 第 28卷， 第 5期〕 。 TRPC的家族成员（亚基）包括： TRPC1、 TRPC2、 TRPC3、 TRPC4、 TRPC5、 TRPC6、 TRPC7。 根据其序列相似性， 又可以把 TRPCl , TRPC2, TRPC4、 TRPC5和 TRPC3、 TRPC6、 TRPC7分另 ij归为一组。 功能型的 TRPC 通道分别由这些亚基组成同四聚体或异四聚体 ，它是一类可以通透钙离子的非选择性 阳离子通道。 许多细胞的细胞膜上都有 TRPC通道的分布， 包括神经元上。 近年来的 研究表明， TRPC通道参与了很多重要的生理或病理过程， 比如： 神经轴突生长导向， 神经元突触的发育， 肌肉细胞增殖， 肾脏疾病， 以及小脑颗粒细胞的存活等。 TRPC 通道的激活有两条途径， 其一是膜上 G蛋白耦联受体的激活引起的下游 PLC (磷脂 酵 C ) 的激活所介导的； 其二是膜上酪氨酸激酶受体所引起的 PLC 的激活介导的。 可见， PLC的活化是 TRPC通道开放所必需的。 PLC活化后水解膜上的 PIP2 (磷脂 酰肌醇 4,5-二磷酸） 产生 IP3 (肌醇三磷酸） 和 DAG (二酰甘油） ， 前者引起内钙释 放从而激活膜上的某些 TRPC通道；后者则可以直接作用于膜上的某些 TRPC通道进 而开放通道。

目前可用于临床治疗缺血性脑中风 （局灶性脑缺血） 的药物仅一种： tPA (组织 血纤维蛋白溶酶原活化剂） ， 该药物也仅能用于一小部分病例， 并且伴有脑出血的风 险。 因此， 急需新的药物和理解新的发病机制， 发现新的靶点和开发新的药物。 发明内容

本申请人发现， TRPC6的蛋白水平在缺血后的皮层半影区神经元� ��特异地下调， 这一过程是由 NMDA受体激活引发的钙蛋白酶（ calpain)的蛋白水解作用介导的。 阻 止 TRPC6的下调， 或者上调 TRPC6的蛋白水平对于缺血损伤有保护神经元的� ��用。 这些结果提示， 在局部脑缺血过程中， TRPC6 对于神经元存活起到关键作用； 钙蛋 白酶介导的 TRPC6的下调促进了神经元的死亡， 加重了缺血造成的脑损伤。 因此， 本申请涉及一种分离的多肽， 选自：

( i ) SEQ ID NO: 1或其包含 SLKAAP的片段； 或

( Π)在 （i ) 中的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑 制钙蛋白酶降解 TRPC6的活性的由 （i ) 衍生的多肽。

. 在一个实施例中， .所述多肽选自：

( a) GGSLKAAPGA; 或

( b ) 在 （a) 中的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 抑制钙蛋白酶降解 TRPC6的活性的由 （a) 衍生的多肽。

在一个实施例中， 所述 （b ) 项多肽选自： 在该 （a) 项多肽的 SLKAAP的左右 两侧独立延伸 0、 1、 或 2 个 （a)所示的对应位置上的氨基酸残基的多肽； 和在 SEQ ID NO: 1的基础上， 在其中的 GGSLKAAPGA的左右两侧独立延伸 0、 1、 2、 3、 4、 5或 6个氨基酸残基所得到的多肽。

在一个实施例中， 所述多肽选自：

( 1 ) RRGGSLKAAPGAGTRR; 或

( 2 ) 在 （1 ) 中的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有 抑制钙蛋白酶降解 TRPC6的活性的由 （1 ) 衍生的多肽。 .

本申请的多肽包括 RRGGSLKAAPGAGTRR或其包含 SLKAAP的片段。

在一个实施例中， 所述包含 SLKAAP的片段为 GGSLKAAPGA。

本申请提供一种分离的多肽， 所述多肽含有穿膜因子和本申请所述的多肽。 在 本 申 请 中 ， 穿 膜 因 子 可 选 自 RKKRRQRRR 、

GWTLNS AGYLLGKINLKALAALAKKIL > RQIKIWFQNRRMKWKK、 RR RR、 RRRRRRRRR R RRRRR RRR, GRKKRRQRRRC。 在一个实施例中， 穿膜因子为 GRKKRRQR RC。

在一个实施例中， 本申请的多肽如 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 9或 SEQ ID NO: 10所示。

本申请提供一种药物组合物， 所述组合物含有本申请的多肽以及药学上可接 受 的载体或赋形剂。

本申请的药物组合物中， 本申请的多肽可以是 RRGGSLKAAPGAGTRR或其包 含 SLKAAP的片段， 该多肽可连接于穿膜因子。

在一个实施方式中， 本申请的药物组合物含有 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 9和 / 或 SEQ ID NO: 10。

本申请还提供含有 NMDA受体拮抗剂、 TRPC6表达载体和 /或 TRPC6表达增强 剂的药物组合物。

本申请提供本申请的多肽在制备提高对象 TRPC6表达量用的药物中的用途。 所 述多肽包括与或未与穿膜因子连接的多肽。 穿膜因子 (穿膜肽)是一类能携带大分子物 质进入细胞的短肽。

本申请包括 TRPC6表达载体、 钙蛋白酶的抑制剂、 TRPC6增强剂或 NMDA受 体拮抗剂在制备保护神经元用的药物中的用途 。

在一个实施方式中， 所述增强剂选自 OAG、 或其类似物。

本申请包括 TRPC6表达载体、 钙蛋白酶的抑制剂、 TRPC6增强剂或 NMDA受 体拮抗剂在制备治疗或预防神经退行性疾病中 的用途。

在本申请中， 神经退行性疾病通常包括： 阿尔茨海默氏病、 肌肉萎缩性侧索硬 化症、 共济失调毛细血管扩张症、 牛海绵状脑病、 克雅二氏病、 亨廷顿氏病、 小脑萎 缩症、 多发性硬化症、 帕金森氏病、 原发性侧索硬化、 和脊髓性肌萎缩症。

本申请包括 TRPC6表达载体、 钙蛋白酶的抑制剂、 TRPC6增强剂或 NMDA受 体拮抗剂在制备治疗或预防缺血引起的损伤用 的药物中的用途。

本申请中， 损伤包括缺血引起的脑损伤。

本申请中， 钙蛋白酶的抑制剂包括与或未与穿膜因子连接 的本申请多肽。 在具 体实施方式中， 所述多肽为 RRGGSLKAAPGAGTRR或其包含 SLKAAP的片段， 或 者如 SEQ ID NO: 4和 9所示。

本申请提供一种筛选治疗或预防缺血引起的损 伤用的药物的方法， 所述方法包 括：

( 1 ) 将待测物质加入含有 TRPC6的体系中；

( 2 ) 向步骤 （1 ) 所述的体系中加入钙蛋白酶， 和

( 3 ) 测定所述待测物质是否能抑制钙蛋白酶降解 TRPC6，

其中， 将能够抑制钙蛋白酶降解 TRPC6的物质作为治疗或预防缺血引起的损伤 用的候选药物。

本申请还提供一种筛选 TRPC6表达增强剂的方法， 该方法包括：

( 1 ) 将待测物质加入表达 TRPC6的体系中； 和

( 2) 测定该体系中 TRPC6 的表达量， 其中， 与未加入待测物质的实验相比， 能使 TRPC6的表达量提高的待测物质确定为 TRPC6表达增强剂。

另一方面， 本申请包括用于维持神经细胞的 TRPC6水平以预防或者治疗缺血性 脑损伤或脑神经退行性病变的物质。

所述物质可选自钙蛋白酶抑制剂， 或 TRPC6表达增强剂， 或 NMDA受体拮抗 剂。

所述钙蛋白酶的抑制剂可选自钙蛋白酶特异性 的小干扰 RNA， 或 calpeptin, 或 包含 SLKAAP序列的多肽。

所述多肽的序列可选自 SEQ ID NO: 1或其片段。

本申请中， 所述多肽可与跨膜因子相连接。

在一些实施方式中， 所述多肽的序列如 SEQ ID NO: 4、 SEQ ID NO: 9或 SEQ ID NO: 10所示。

本申请中， 所述钙蛋白酶特异性的小干扰 RNA可选自 SEQ ID NO: 5或 SEQ ID NO: 6。

本申请中， TRPC6表达增强剂可选自 TRPC6表达载体、 OAG或者 OAG的类似 物。 .

本申请中， NMDA受体拮抗剂可选自金刚烷胺、地佐环平、 SEQ ID NO: 7或 SEQ ID NO: 8。

本申请也包括前述物质的用途， 所述用途包括预防或者治疗缺血性脑损伤或脑 神经退行性病变。

本申请也包括前述物质的用途， 所述用途包括制备预防或者治疗缺血性脑损伤 或神经退行性病变的药物或者药物组合。 . 附图说明

图 1显示 TRPC6抗体的特异性。 （a) 显示使用抗 TRPC6的抗体进行的转染了

GFP或 WT-TRPC6构建物的 HEK293细胞中 TRPC6的蛋白免疫印迹。 （b) 显示使 用抗 /w e 表位的抗体进行的转染了 GFP 或 TRPC6- _yc 构建物的 HEK293 细胞中 TRPC6的蛋白免疫印迹。 . （c) 显示与或不与抗原性肽共培育情况下， 使用抗 TRPC6 的抗体进行的大鼠脑裂解物中的 TRPC6的蛋白免疫印迹。 ( d) 显示用抗 TRPC6的 抗体和抗 NeuN的抗体在或不在抗原性肽存在下双染色的� �鼠脑切片的代表性图。刻 度为 50μιη。 （e)显示转染了 TRPC1-HA、 TRPC3-M c、 TRPC4、 TRPC5-Flag或 TRPC6 构建物的 HEK293 细胞的提取物的免疫印迹分析。 TRPC6 的抗体能特异性地识别过 表达的 TRPC6蛋白， 但不能识别过表达的 TRPC1、 3、 4和 5蛋白。

图 2显示脑缺血后神经元中的 TRPC6特异性下调。 （a)显示使用所示抗体， 对 照侧 （C ) 或缺血侧 （I) 皮层 （Sham假手术组： 左侧皮层 （L) 或右侧皮层 （R) ) 提取物的免疫印迹。 微管蛋白 （Tubulin) 作为蛋白上样量的对照。 （a) 的半图显示 归一化 TRPC6蛋白水平的定量分祈 （每个时间点， n = 5-8只大鼠， 与 Sham相比， *p<0.05 , **p<0.01。 （b) 显示脑缺血后， 所示时间点 TRPC6、 3和 4蛋白水平的定 量分析。 在每个时间点， n = 3-5只大鼠， 与 Sham相比， *p<0.05， **p<0.01。 ( c) 显示缺血复灌 24小时后（R24) TRPC和 GluRl的免疫印迹。 右图显示蛋白水平定量 分析， n='5只大鼠，与对照侧相比， **p<0.01。 （d)显示采用 qRT-PCR测定的 TRPC6 mRNA水平， n = 3-5只大鼠。 （e).显示缺血复灌 24小时 （R24 ) 后， 用所示抗体双 染色得到的所示皮层的代表图。 刻度为 50μιη。 右图显示定量分析 （η = 5只大鼠） ； 与对照侧皮层中的荧光强度相比， **ρ<0.01。

图 3显示脑缺血后胶质细胞中 TRPC6未下调。图中显示，缺血复灌 24小时（R24) 后， 用抗 TRPC6和 GFAP的抗体双染色所得的对照侧和缺血侧皮层� �代表图。 右图 是从所示区域得到的放大图。斜向上的两个箭 头显示 GFAP阳性胶质细胞； 水平的两 个箭头显示邻近的神经元。 该图表明， 缺血后神经元中的 TRPC6蛋白特异性下调， 而胶质细胞中的 TRPC6蛋白水平没有变化。

图 4 显示 TRPC6 的下调先于缺血性神经元死亡。 （a) 显示用 TRPC6抗体和 TU EL标记双染色， 缺血复灌 24小时 （R24) 或 48小时 （R48 ) 后所示皮层的代表 图。 Hoechst标记细胞核。 刻度为 50μηι。 （b ) 显示在指定时间缺血侧皮层或假手术 ( Sham ) 中 TRPC6 .蛋白的定量水平和 TUNEL标记的阳性细胞数量； 每种情况下， n = 3只大鼠。 与 Sham相比， *p<0.05， **p<0.01。

图 5显示在模拟缺血实验中神经元中 TRPC6的下调。 ( a) 显示 OGD后用所示 抗体进行的培养的皮层神经元提取物的免疫印 迹。条带下的数值为归一化的蛋白水平 ( n= 3 ) 。 （b) 显示 OGD后在指定时间点神经元中 TRPC1、 3和 6的实时 RT-PCR 定量 mRNA水平。

图 6显示培养的皮层神经元被 OAG刺激后产生的电流 (I _0AG )。 （a)培养的皮层神 经元的全细胞记录 (第一条轨迹)和转染了 TRPC6 RNAi 的皮层神经元的记录 (第二条 轨迹)。 右图为电流密度的定量分析结果 (每组 10个细胞)。 右图插图显示分别转染对 照质粒、随机 RNAi序列 TRPC6 RNAi的皮层神经元中 TRPC6的蛋白水平。 OAG ( 1- 油酰基 -2-油酰基 -sn-甘油） ΙΟΟμΜ; SKF96365, 1 (^M _; NMDG: N-甲基 -D-葡糖胺的无 Ca ²⁺ 溶液。 单星号表示相对对照组而言 p < 0.05 o (b)用斜升电压钳记录的代表性电流 轨迹， 电流轨迹下面的图表示这种记录给电压的方式 ，如图应用了四次从 -100V~+80V 的斜升电压。 ΙΟΟμΜ的 OAG是在第一个斜升电压之后给药的。 （c)未转染的皮层神经 元 (对照组)及转染了 TRPC6 RNAi的神经元， OAG刺激电流的 I-V曲线。

图 7显示 OAG刺激对培养的皮层神经元的胞内钙信号的影 响。（a) A R/R描述的 由 F340/F380 定义的胞内钙升高及其标准化的基线。 图中直线代表给药时间。 SS 即 HPSS 缓冲液作为对照， 零钙胞外液的成分为： SS +2mM EGTA。 OAG ΙΟΟμΜ, SKF1(^M。右图为曲线下面积定量分析， 每组 15-25个细胞的数据。双星号表示相对 于 SS组或 OAG 组 p < 0.01。 （b)显性抑制型 TRPC6对 OAG引起的胞内钙升高的影 响。 用 Ι ΟΟμΜ OAG剌激转染了对照质粒或显性抑制型 TRPC6质粒的皮层神经元， 检测其钙升高。 图中直线代表 OAG给药时间。 右图为每组曲线下面积定暈分析， 每 组 20个细胞的数据。 双星号表示相对对照组 < 0.01。

图 8显示氧糖剥夺特异地抑制神经元中 OAG刺激的电流。左图为相应刺激的电 流密度定量分析结果， 右图为在对照或氧糖剥夺的处理下 OAG刺激的反转电位统计 结果。 单星号表示相对对照组而言 p < 0.05。

图 9显示下调 TRPC6会加剧氧糖剥夺导致的神经元死亡。 转染了相应质粒的培 养皮层神经元， 经氧糖剥夺处理后复灌 24小时， 定量统计细胞死亡 (3次试验)。 单星 号表示相对 GFP组或对照 RNAi组而言 p < 0.05, 双星号表示 p < 0.01。

图 10显示药理学方法影响 TRPC6对缺血损伤的作用。（a)PI染色显示的对照 组， OAG(lOO M)处理组及 SKF96365(10 M)处理组， 对氧糖剥夺处理引起的细胞死亡的 影响。 统计数据代表三次独立的实验， 单星号表示相对对照组而言 p < 0.05， 双星号 表示 p < 0.01。（b,c)大鼠脑缺血复灌 24小时后， 脑片的 TTC ( 2,3,5—氯化三苯基四 氮唑） 染色区域 （照片） ， 及量化的脑梗塞体积 （柱状图） ： （b)R2、4 或假手术： 对 照 （veh, DMSO 5μΜ/5μ1) 或 OAG 100ηιΜ/5μ1 , 每组 8-1 1只大鼠的数据。 双星号表 示 p < 0.01。 （c)R24或假手术： 对照 ( veh, DMSO 5μΜ/5μ1)或 SKF96365 20πιΜ/5μ1， 每组 8-1 1只大鼠的数据。 双星号表示 ρ < 0.01。

图 1 1显示过表达 TRPC6特异地保护氧糖剥夺处理的神经元。 （a)转染了野生型 TRPC6的培养皮层神经元的代表图及转染效率的� ��量分析。 用 TRPC6的抗体对转染 GFP 或野生型 T PC6 的神经元裂解物进行免疫杂交印记的结果。 （b) TRPC6 而非 TRPC3 对氧糖剥夺处理的神经元有保护作用。 用氧糖剥夺处理转染了相应质粒的神 经元之后， 用 PI (碘化丙啶） 染色显示神经元死亡。 插图为过表达 TRPC3的免疫杂 交印记图。统计分析的数据由三次不同的实验 得来。双星号表示相对于 GFP p < 0.01。

图 12显示环磷酸腺苷反应元件结合蛋白 (CREB)是 TRPC6的下游信号分子。 （a) 用图示相应的抗体对转染 GFP或野生型 TRPC6的神经元进行免疫杂交印记分析。（b) 氧糖剥夺处理转染了相应质粒的神经元后， PI染色统计的细胞死亡情况的结果。其中 KCREB 为显性抑制型 CREB， 每组统计是三次独立的实验数据， 双星号表示相对于 GFP p < 0.01。

图 13显示 TRPC6被钙离子依赖的蛋白酶降解。 （a)将大鼠脑裂解物与钙离子及 如图相应的抑制剂共孵育后， 用相应抗体做免疫杂交印记。 Calpeptin: 20 μ M; 亮抑 蛋白酶： 100 μ Μ; PMSF: 100 l M; EGTA: 5mM。 右图为三次独立实验的 TRPC6 蛋白水平的统计结果。 双星号表示相对于对照 p < 0.01。 （b)左图为大鼠脑裂解物与 I mM钙离子 37摄氏度下共孵育的 TRPC6蛋白降解的时间曲线， 右图为 30分钟内大 鼠脑裂解物与相应浓度钙离子 37摄氏度下共孵育的 TRPC6蛋白降解的剂量曲线。 (c) 将大鼠脑裂解物与钙离子及如图相应的抑制剂 或对照组共孵育后， 用 TRPC6 或 α -spectrin 抗体做免疫杂交印记的结果。 Calpeptin: 20 μ M; 亮抑蛋白酶： ΙΟΟ μ Μ; MDL28170 (钙蛋白酶抑制剂 3): 60 μ M; cpm-VAD-CHO: 20 μ M; Lactacystin (蛋 白酶体抑制剂） ： ΙΟ μ Μ; 和 EGTA: 5mM。

图 14显示 TRPC6蛋白的 K16及 A17氨基酸之间被钙蛋白酶切割。 (a)在 HEK293 细胞中过表达 N-flag-second loop-HA-C-myc蛋白（如示意图所示）后将细胞裂� �物与 相应浓度的 μ -钙蛋白酶共孵育， 用相应的标签抗体进行免疫杂交印记分析。 （b)纯化 后的 NUS标签的 TRPC6前 203个氨基酸的产物用钙蛋白酶消化后， 跑 SDS-PAGE 胶分离后的考马斯亮蓝染色图。 箭头所示为钙蛋白酶切割下来的 22kD小片段， 右图 显示为用 Edman N端测序法，对此片段测序得到的钙蛋白酶在 TRPC6上的切割位点。 其下为依据此位点合成的带有 TAT穿膜序列， 且包含此位点的肽段 TAT-C6序列， 再下为大鼠脑裂解物在 30分钟内与 ImM钙离子及相应浓度的 TAT-C6共孵育后，用 相应抗体做免疫杂交印记分析。

图 15显示 NMDA受体介导细胞缺血模型中钙蛋白酶对 TRPC6的降解。 (a)左图： 在对照 （Veh.), calpeptin (20 μ M) 或 MDL28170 (MDL, 60 μ M)共孵育下，进行氧糖剥 夺处理的皮层神经元裂解物， 用 TRPC6抗体对其进行免疫杂交印记分析。 中图： 三 次独立实验的 TRPC6蛋白水平统计。单星号表示相对对照组而� �� p < 0.05， 双星号表 示 p < 0.01。 右图： 以上三种处理的氧糖剥夺导致细胞死亡统计， 三次独立实验， 双 星号表示 p < 0.01。(b)对转染了对照无义 siRNA及转染两种钙蛋白酶的 RNAi (CAPN i— 1, CAPN i— 2)进行钙蛋白酶蛋白的免疫印记分析。 下方图为三次实验的钙蛋白酶蛋 白水平统计图。 双星号表示 p < 0.01。 右图： 两段钙蛋白酶的 RNAi都可以阻断氧糖 剥夺导致的 TRPC6蛋白降解， 下图为 TRPC6蛋白水平统计， 三次独立实验， 双星号 表示 p < 0.01。（c)在共孵育对照或 lOuM地佐环平后对培养的皮层神经元进行氧糖� � 夺处理。 细胞裂解物用 TRPC6 抗体进行免疫杂交印记分析。 （d)对转染了对照无义 siRNA及转染两种 NMDA受体 NR1亚基的 RNAi (NRl i_l, NRl i_2) 进行 NTU蛋白 的免疫印记分析。 下方图为三次实验的 NR1蛋白水平统计图。 双星号表示 p < 0.01。 右图：两段 NRl的 RNAi都可以阻断氧糖剥夺导致的 TRPC6蛋白降解，下图为 TRPC6 蛋白水平统计， 三次独立实验， 双星号表示 p < 0.01。 （e)免疫杂交印记实验显示， 钙 蛋白酶的抑制剂 calpeptin 及 NMDA 受体的抑制剂金刚烷胺都可以阻断缺血导致的 TRPC6蛋白降解，下图为 TRPC6蛋白水平统计，三次独立实验，双星号表� �� p < 0.01。

图 16显示 TRPC6转基因小鼠中 TRPC6蛋白水平在前脑中特异地上调。（a)用图 示相应的抗体对转基因小鼠 (tg)或野生型小鼠 (wt)的皮层提取物进行免疫杂交印记分 析。 下方图为相应小鼠的基因型鉴定， 右图为 TRPC6蛋白水平定量分析。 每种基因 型三只小鼠， 双星号表示 相对于野生型 p < 0.01。 （b)分别用 TRPC6, 3, 4, 5， NR2A,GluR2/3及 PSD95的抗体对来自 3个独立的转基因建成系的转基因小鼠 (tg)或 同窝的野生型小鼠 (wt)的皮层提取物进行免疫杂交印记分析。 右图为相应蛋白水平定 量分析。 每种基因型三只小鼠， 单星号表示 相对于野生型 p < 0.05。 （c)用 TRPC6抗 体对转基因小鼠 (tg)或野生型小鼠 (wt)的脑冰冻切片进行免疫组织化学分析。下� �图为 不同脑区。 CTX皮层， HIP海马， CBM小脑。 比例尺为 200微米。

图 17显示提高 TRPC6蛋白水平可降低小鼠脑缺血损伤。 左图： 对相应基因型 小鼠进行局灶脑缺血后的 TTC染色脑片照片及脑梗塞体积统计 (柱状图），每种基因型 14只小鼠， 双星号表示 相对于野生型 p < 0.01。 右图： 脑缺血后转基因及野生型小 鼠的生存率。 每种基因型 14只小鼠。

图 18显示转基因及野生型小鼠的脑血管情况代表� ��化图。 转基因及野生型小鼠 脑的冠状切片， 用血管内皮细胞特异的蛋白 CD31的抗体做组化， Hoechst染细胞核。 比例尺为 50微米。 右图为缺血后转基因及野生型小鼠的脑血流量 分析。 双星号表示 相对于缺血 0分钟时 p < 0.01。

图 19显示 TRPC6蛋白量与缺血造成的细胞死亡负相关。 左图： 用 TRPC6抗体 及 TUNEL染色对缺血侧皮层半影区进行的免疫组化� ��标代表图。 Hoechst染细胞核。 比例尺 50微米。 右图： TRPC6的免疫荧光强度及 TUNEL标记的阳性细胞数的统计 结果， 每组三只小鼠的数据， 双星号表示相对于野生型 p < 0.01。

图 20显示， （a)用 TRPC6的抗体对缺血或假手术的小鼠皮层提取物� ��行免疫杂 交印记实验， 右图为统计结果， 每组 6只小鼠， 双星号表示相对于假手术（转基因型） p < 0.01。 （b,c)缺血或假手术后的野生型或转基因型小� �的皮层提取物， 分别用 p-CREB, CREB, p-CaMKII α， CaMKII α及 NOSl的抗体进行免疫杂交印记分析。右图 为 p-CREB/CREB, p-CaMKII a /CaMKII α的蛋白水平比值，及 NOS l的相对蛋白水平。 单星号表示 p < 0.05， 双星号表示 相对于相应组 p < 0.01。

图 21 显示抑制钙蛋白酶对 TRPC6的降解可降低大鼠脑缺血损伤。 对侧脑室注 射对照肽或 TAT-C6 的大鼠进行局灶脑缺血或假手术， 左图： 用 TRPC6及 spectrin 抗体对其脑组织提取物进行免疫杂交印记实验 ，下方图为 T PC6蛋白水平统计分析， 每组三只大鼠， 单星号表示相对于对照 < 0.05。 右图： TTC染色脑片照片及脑梗塞 体积 （柱状图） 。 缺血前大鼠侧脑室注射对照 (Veh) 对照 TAT-肽 （TAT-ctd) 或 TAT-C6 肽 (TAT-C6)。 单星号表示 相对于对照 p < 0.05。

： 图 22 显示 TTC 染色脑片及损伤体积 （柱状图） 。 恻脑室注射对照 TAT-肽 (TAT-empty)或 TAT-C6-2肽 (TAT-C6-2)。 单星号表示相对于对照 p<0.05。

图 23 显示 TTC 染色脑片照片及损伤体积 （柱状图） 。 侧脑室注射对照 TAT- 肽 (TAT-empty)或 TAT-C6-3肽 (TAT-C6-3)。 单星号表示相对于对照 p < 0.05。

图 24显示腹腔注射 TAT-C6改善老年性痴呆模型老鼠的学习和记忆能 力。

附图中， " control '，和" ctd "指对照， " Tubulin"指微管蛋白， "No inh.(No Ca ²⁺ )" 指 "无抑制剂 （无 Ca ²⁺ ) " ， "No inh. "指 "无抑制剂" ， " Veh. "指 "载体" （例 如蒸馏水） 。 " TAT-empty" 指的是 TAT, " naive" 指 "未经实验的" ， " scramble RNAi " 为 "对照无义 RNAi " 。 具体实施方式

如本说明书中和权利要求中使用的， 单数形式 "一" 、 "一个" 、 "该" 包括 复数参考， 除非内容明显说明。 因此， "一多肽"的应用包括两个或多个多肽的混合 物等。

文中使用了下列氨基酸缩写：

丙氨酸： Ala(A) 精氨酸： Arg(R)

天冬酰胺： Asn(N) 天冬氨酸： Asp(D) 半胱氨酸： Cys(C) 谷氨酰胺： Gln(Q) 谷氨酸： Glu(E) 甘氨酸： Gln(Q)

组氨酸： His(H) 异亮氨酸： Ue(I) 亮氨酸： Leu(L) 赖氨酸： Lys(K)

甲硫氨酸： Met(M) 苯丙氨酸： Phe(F) 脯氨酸： Pro(P) 丝氨酸： Ser(S)

苏氨酸： Thr(T) 色氨酸： Trp(W) 酪氨酸： Tyr(Y) 缬氨酸： Val(V)

术语 "多肽" 和 "蛋白质"指氨基酸残基的聚合物， 并不限于产物的最小长度。 因此， 肽、 寡肽、 二聚物、 多聚物等都包括在该定义中。 全长的蛋白质及其片段包括 在该定义中。 该术语还包括多肽的表达后修饰， 例如糖基化、 乙酰化、 磷酸化等。 另 夕卜， 为了本申请的目的， "多肽 "指包括天然序列的修饰， 例如缺失、 添加和取代 (通 常性质保守)， 只要蛋白质维持所需活性。 这些修饰可以通过定点诱变设计， 或可以 是偶然的， 例如通过产生蛋白质的宿主突变， 或由于 PCR扩增引起的错误。

术语 "类似物" 指具有天然多肽序列和结构， 以及相对于天然分子的一个或多 个氨基酸添加、 取代 (通常性质保守)和 /或缺失的化合物， 只要修饰不破坏衍生该类似 物的原始多肽的活性。制备多肽类似物和突变 蛋白的方法是本领域已知的， 如下进一 步所述。

特别优选的类似物包括性质上保守的取代， 即这些取代发生在与它们的侧链有 关的一类氨基酸中。 具体而言， 氨基酸一般被分成四类： （1) 酸性一一天冬氨酸和谷 氨酸； （2) 碱性一一赖氨酸、 精氨酸、 组氨酸； （3) 非极性一一丙氨酸、 缬氨酸、 亮 氨酸、 异亮氨酸、 脯氨酸、 苯丙氨酸、 甲硫氨酸、 色氨酸； （4) 无电荷的极性一一甘 氨酸、 天冬酰胺、 谷氨酰胺、 半胱氨酸、 丝氨酸、 苏氨酸、 酪氨酸。 有时将苯丙氨酸、 色氨酸和酪氨酸归为芳族氨基酸。 例如， 有理由预测： 单独用异亮氨酸或缬氨酸取代 亮氨酸、 用谷氨酸取代天冬氨酸、 用丝氨酸取代苏氨酸， 或者用结构上相关的氨基酸 取代类似的保守的氨基酸， 这样的取代将不会对生物活性有重要影响。 例如， 感兴趣 的多肽可包括多达约 2-6个保守的或不保守的氨基酸取代， 甚至多达约 5-10个保守 的或不保守的氨基酸取代， 或 2-10之间任何整数， 只要该分子的所需功能仍维持完 整。 本领域的熟练技术人员可结合本领域熟知的 Hopp/Woods和 Kyte-Doolittle 曲线 图， 容易地测定感兴趣的分子中可耐受改变的区域 。

可用 "相同性" 或 "同源性" 来限定本申请的多肽或核苷酸序列。 "相同性" 或"同源性 "指两条多核苷酸或多肽序列上准确的核苷酸� �核苷酸或者氨基酸对氨基 酸对应。通过排列两个分子的序列直接比较它 们的序列信息， 计算两条排列的序列间 匹配的准确数量， 将其除以最短序列的长度， 然后乘以 100， 从而可得到相同性百分 数。

在同源性和相同性分析中可辅助使用易于获得 的计算机程序， 如 ALIGH、

Dayhoff、 M.O. (Atlas of Protein Sequence and Structure, M.O.Dayhoff编辑， 5 Suppl. , 3： 353-358 , National Biomedical Research Foundation , Washington, DC), 它适用于 Smith和 Waterman分析肽用的局部同源性算法 (Advances in Appl. Math. , 2： 482-489, 1981)。可从 Wisconsin Sequence Analysis Package (第 8版，从 Genetics Computer Group, Madison, WI获得)获得测定核苷酸序列同源性的程序， 例如， BESTFIT、 FASTA和 GAP程序， 这些程序也依赖于 Smith和 Waterman算法。 使用制造者建议的和上述 Wisconsin Sequence Analysis Package所述的默认参数可容易地使用这些程序� � 例如， N2010/002044 可使用 Smith和 Warerman的同源性算法的默认计分表和 6个核苷酸位置的间隔罚分 (gap penalty)测定的核苷酸序列与参比序列的同源性� ��分数。

本申请建立同源性百分数的另一方法是使用版 权属于爱丁堡大学、 由 John F. Collins和 Shane S. Sturrok开发、 由 IntelliGenetics, Inc.(Mountain View, CA)发行的 MPSRCH程序包。 Smith-Waterman算法可在这套程序包中使用， 其中， 在计分表中 使用默认参数 (例如， 间隔开放罚分 =12， 间隔延伸罚分 =1， 间隔 =6)。 从这批数据产 生的 "匹配 "值反映出 "序列同源性" 。 计算序列间的相同性百分数或相似性百分数 的其它合适的程序在本领域中一般都是已知的 ， 例如， 另一种排列程序是 BLAST, 使用默认参数。 例如， 可使用下述默认参数的 BLASTN和 BLASTP : 基因编码=标 准； 过滤 =无； 链=两； 截留 =60; 期望值 =10; 矩阵 = BLOSUM62 _; 描述 =50个序列； 排序 = HIGH SCORE;数据库 =无冗余， GenBank+ EMBL+ DDBJ+ PDB+ GenBank CDS 翻译 + Swiss蛋白 + Spupdate+ PIR。在 http:AVww.ncbi.nim.gov/cgi-bin/BLAST网址上 可查到这些程序的详细描述。

或者， 在同源区域之间形成稳定的双链的条件下进行 多核苷酸杂交， 接着用单 链特异性核酸酶消化， 然后测定消化的片段的大小， 从而测出同源性。 在如 (对具体 的体系所定义的)严格条件下进行的 Southern杂交试验中，可鉴别基本同源的 DNA序 列。 确定适当的杂交条件在本领域熟练技术人员所 掌握的知识之内。 例如， 参见 Sambrook等， 同上； DNA Cloning, 同上； Nucleic Acid Hybridization, 同上。

本申请优选与本申请多肽具有 90 %以上、 95 %以上、 96 %以上、 98 %以上或者 99 %以上序列相同性、：并保留本文所述治疗或� �防活性或者保留抑制钙蛋白酶降解 TRPC6的活性的多肽。

可采用各种方法制备本申请的多肽。 例如， 可采用常规的化学合成法或者重组 表达法制备。

本申请分离的多肽序列以 MSQSPRFVTRRGGSLKAAPGAGTRRNESQD ( SEQ ID NO. 1， 见图 14b ) 为基础， 包括此序列及其含有 SLKAAP 的片段。 术语 "含有 SLKAAP的片段" 是指在 SEQ ID NO: 1的氨基酸序列的左右两侧独立截短任意数量 的氨基酸、 但仍保留 SLKAAP序列所得的序列。 所述片段仍保留抑制钙蛋白酶降解 TRPC6的活性。 所述任意数量对于左侧而言指 1一 13间的整数， 而对于右侧而言指 1 一 1 1 之间的整数， 其中， 最短的片段可为 SLKAAP。 本申请也包括上述多肽及其片 段的保守性取代产物，尤其是上述多肽或片段 中的一个或几个氨基酸残基被性质上相 周的氨基酸残基所取代（见前文所述） ， 同时保守取代所得的氨基酸序列仍保留了抑 制钙蛋白酶降解 TRPC6的活性。 本申请分离的多肽可选自： （a) GGSLKAAPGA; 或 （b ) 在 （a) 中的氨基酸 序列经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制钙蛋 白酶降解 TRPC6的活 性的由 （a) 衍生的多肽。

上述 （b) 项的多肽包括但不限于在上述 （a) 的 SLKAAP的左右两侧独立地延 伸 0、 1或 2个 （a) 所示的对应位置上的氨基酸残基的多肽， 和在 SEQ ID NO: 1的 基础上， 在其中的 GGSLKAAPGA的左右两侧独立延伸 0、 1、 2、 3、 4、 5或 6个氨 基酸残基所得到的多肽。 例如， 当在 SLKAAP的左右两侧各延伸一个氨基酸残基时， 所述序列为 GSLKAAPG; 当在 SLKAAPGAGTR的左右两侧各延伸两个氨基酸残基 时， 所述序列为 GGSLKAAPGAGTRRN; 当 SLKAAPGAGTR的左侧延伸 6个氨基酸 残基、 右侧延伸 4个氨基酸时， 所述序列为 VTRRGGSLKAAPGAGTRR ES; 以此类 推。本申请也包括这些氨基酸序列的保守取代 产物， 尤其是上述多肽中的一个或几个 氨基酸残基被性质上相同的氨基酸残基所取代 （见前文所述） ， 同时保守取代所得的 氨基酸序列仍保留了抑制钙蛋白酶降解 TRPC6的活性。

本申请还提供一种分离的多肽， 选自： （c ) RRGGSLK AAPG AGTRR； 或 （d) 在 （C ) 中的氨基酸序列经过取代、 缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抑制钙蛋 白 酶降解 TRPC6的活性的由 （c) 衍生的多肽。

上述 （d) 项的多肽包括但不限于在上述 （c) 项序列两侧独立减少 0、 1、 2、 3 或 4 个氨基酸残基所得的多肽； 和在 SEQ ID NO: 1 的基础上， 在其中的 RRGGSLKAAPGAGTRR的左右两侧独立延伸 0、 1、 2、 3、 4、 5或 6个氨基酸残基 所得到的多肽。 例如， 当仅在 （c) 项序列左侧延伸一个氨基酸残基时， 所述序列为 TRRGGSLKAAPGAGTRR; 当在 （c) 项序列两侧各延伸 2个氨基酸残基时， 所述序 列为 VTRRGGSLKAAPGAGTRRNE; 依次类推。 本申请也包括这些氨基酸序列的保 守取代产物，尤其是上述多肽中的一个或几个 氨基酸残基被性质上相同的氨基酸残基 所取代 （见前文所述） ， 同时保守取代所得的氨基酸序列仍保留了抑制 钙蛋白酶降解 TRPC6的活性。 在一个实施方式中， 本申请包括分离的 CRRGGSLKAAPGAGTRR。 如前所述， C和 T均属性质上相近似的氨基酸， 其替换不会影响到所得多肽抑制钙蛋 白酶降解 TRPC6的活性。

在一个具体实施方式中， 本申请提供一种分离的多肽， 所述多肽选自 RRGGSLKAAPGAGTRR 及其含 SLKAAP 的片段。 在一个具体实施例中， 所述含 SLKAAP的片段为 GGSLKAAPGA。

本申请也提供一种肽序列， 该序列包含 SLKAAP , 并具有抑制钙蛋白酶降解 TRPC6 的活性。 在一个实施例中， 该肽序列的氨基酸残基数量为 6— 30个， 例如， 可以为 6— 25个、 6— 20个、 6— 16个、 6— 10个等。 在一实施例中， 包含 SLKAAP 的序列为 SEQ ID NO: 1 或其片段。 在另一实施例中， 包含 SLKAAP 的序列为 R GGSLKAAPGAGTRR 或其片段。 在另一实施例中， 包含 SLKAAP 的序列为 GGSLKAAPGA或其片段。

前述附图 14b所示 TRPC6为 MSOSPRFVTRRGGSJ ^ ^G ^l ^G7 ^ ^RNE SOD， 前 述可在 SLKAAP、 ( a) 项序列、 （c) 项序列和 （e) 项序列两侧独立延伸或减少的 氨基酸残基及其所处位置与此 TRPC6序列一一相对应。 所述一一对应意指， 例如， 当延伸氨基酸残基时， 所延伸的氨基酸残基为从基础序列 （即 SLKAAP、 ( a) 项序 列、 （c) 项序列和 （e) 项序列） 两侧的最后一个氨基酸残基起分别外推至指定 数量 的氨基酸残基， 如当延伸 2个氨基酸残基时， 则从基础序列两侧的最后一个氨基酸残 基起算按顺序外推 2个氨基酸残基， 所延伸的氨基酸残基与图 14b的 TRPC6中对应 的氨基酸位置的氨基酸残基相同。 当减少氨基酸残基时， 是指从基础序列的两侧的第 一个氨基酸开始减少指定数量的氨基酸残基。

在一具体实施方式中 ， 本申请优选下述氨基酸序列： SLKAAP、 SLKAAPGAGTR, GSLKAAPGAGTR, GGSLKAAPGAGTR, RGGSLK A APGAGTR . R GGSLKAAPGAGTR 、 RRGGSLKAAPGAGTRR 、 TRRGGSLK A APGAGTR 、 VTR GGSLKAAPGAGTR 、 SLKAAPGAGTRR 、 SLKAAPGAGTRRN 、 SLKAAPGAGTRRNE 、 GSLKAAPGAGTRR 、 GGSLKAAPGAGTRR 、 RGGSLKAAPGAGTRR、 TRRGGSLK A APGAGTRR、 CRRGGSLKAAPGAGTR 、 VCRRGGSLKAAPGAGTRR F VCRRGGSLK A APG AGTRRN , GGS AAPGA等。

本申请的分离的多肽可与穿膜因子连接， 以便于穿过细胞膜。 穿膜因子指长度小 于约 30个氨基酸、 能穿过细胞膜并能将其所携带的各种物质带入 细胞中的多肽。 本 领域已知的各种穿膜因子可用于本申请， 包括但不限于 RKKRRQRRR、

GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL^ RQIKI WFQNRRMKWKK：、 RRRRRRR, RRRRRR RR, RRRR RRR RR, GRKKRRQRRRC等。 本申请分离的多肽可直接与 穿膜因子连接。可采用本领域各种已知的方法 制备与穿膜因子连接的本申请多肽， 例 如， 采用常规的化学合成法来制备。

本申请提供一种药物组合物， 所述组合物含有本申请的分离多肽以及药学上 可 接受的运载体或赋形剂。 在一个实施方式中， 所述多肽连接于穿膜因子。

本申请还提供一种药物组合物， 该组合物含有 TRPC6表达增强剂和药学上可接 受的运载体或赋形剂。 TRPC6表达增强剂指能提高 TRPC6的表达量的物质。 表达增 强剂包括 TRPC6表达载体、 OAG或其类似物。 本申请还提供一种药物组合物， 该组合物含有 NMDA受体的抑制剂和药学上可 接受的运载体或赋形剂。 本申请中， MDA 受体拮抗剂可选自地佐环平 （MK801 , Sigma公司） 、 金刚烷胺 （memantine) 等。

本申请还提供一种药物组合物， 该组合物含有 TRPC6表达载体。 在一个实施例 中， 所述表达载体是 CaMKIIa启动子驱使的表达载体。 可采用各种常规的技术手段 给予对象所述表达载体， 例如， 转染技术等。

本申请还提供一种药物组合物， 该组合物含有钙蛋白酶的抑制剂和药学上可接 受的运载体或赋形剂。 所述抑制剂为本申请的多肽、 calpepthu 亮抑蛋白酶、 或 MDL28170或其任意组合。 所述多肽可连接于穿膜因子。

本申请药物组合物中还含有溶于或分散于药学 上可接受的运载体或赋形剂中的 一种或多种其它制剂。 短语 "药学上可接受的"是指当用于动物时， 例如人， 不会产 生副作用、 过敏或其它不良反应的分子实体和组合物。 通过本文所公开的内容， 本领 域技术人员将会知道含有至少一种多肽、在某 些实施方式中还含有一种或多种其它活 性成分的药物组合物的制备， 例如见 《雷明顿药物科学》 第 18 版， Mack Printing Company, 1990 (纳入本文参考文献） 。 另外， 对动物 (如人)给药， 可以理解的是制 品应符合无菌、 无致热原， 总体安全和纯度标准。

本文使用的 "药学上可接受的运载体" 包括任何和所有的溶剂、 分散介质、 包 衣剂、 表面活性剂、 抗氧化剂、 防腐剂 (如抗菌剂， 抗真菌剂)、 等渗剂、 吸收延缓剂、 盐类、 防腐剂、 药物、 药物稳定剂、 粘合剂、 赋形剂、 崩解剂、 润滑剂、 增甜剂、 调 味剂、 染料等物质和它们的组合， 这是本领域普通技术人员知道的 (见例如， 《雷明 顿药物科学》第 18版， Mack Printing Company, 1990， 1289-1329页， 纳入本文参考 文献)。 除了与活性成分不相容的常规运载体外， 认为均可用于治疗或药物组合物中。

给予患病动物本申请组合物的实际剂量由物理 和生理因素， 如体重、 疾病严重 性、待治疗疾病的类型、原有和共同的治疗措 施、受试者的特发病和给药途径所决定。 负责给药的医生将决定组合物中活性成分的浓 度和受试者个体的合适剂量。

某些实施方式中， 药物组合物可含有， 例如至少约 0.001重量％的活性成分。 在 其它实施方式中， 药物组合物可含有例如 0.01-99.9重量％、 0.01-50重量％、 0.01-10 重量％等的本申请多肽。在一个具体实施方式 中， 给予的药物组合物中多肽的浓度可 为 0.01-5mM， 例如 0.01-3mM、 0.05-ImM。 给药的方式是常规的， 可由临床医师根 据患者的具体情况来确定。 例如， 可直接注射入侧脑室或蛛网膜下腔。 或者， 也可以 腹腔注射给药。

本申请药物组合物可含有各种抗氧化剂以防止 一种或多种组分的氧化。 此外可 用防腐剂来预防微生物的作用， 如各种抗菌和抗真菌剂， 包括但不仅限于对羟基苯丙 酸酯 (如甲基对羟基苯丙酸酯、 丙基对羟基苯丙酸酯)、 氯丁醇、 苯酚、 山梨酸、 硫柳 汞或其组合。

治疗性多肽可配制成游离碱、 中性或盐形式的组合物。 药学上可接受的盐包括 酸加成盐， 如与蛋白质组分的游离氨基形成的盐， 或与无机酸， 如盐酸或磷酸， 或有 机酸如乙酸、 草酸、 酒石酸或扁桃酸形成的盐。 与游离羧基形成的盐也可衍生自无机 碱， 如氢氧化钠、 钾、 铵、 钙或铁； 或有机碱如异丙胺、 三甲基胺、 组胺或普鲁卡因。

在该组合物是液体形式的实施方式中， 运载体可以是溶剂或分散介质， 包括但 不限于：水、 多元醇 (如甘油、 丙烯二醇、 液态聚乙二醇等）、 脂质 (如甘油三酯、 植物 油、 脂质体)和它们的组合。 例如， 可通过采用包衣如卵磷酯； 通过用运载体如液体 多元醇或脂分散维持所需颗粒大小； 用表面活性剂如羟丙基纤维素； 或这些方法的组 合来维持适当的流动性。 许多情况下， 优选包含等渗剂如糖、 氯化钠或其组合。

可采用本领域常规的方法配置本申请的药物组 合物。

该组合物在制备和贮存条件下必须稳定， 防止微生物如细菌和真菌的污染。 需 知应将内毒素的污染控制到最低， 处在安全水平内， 例如低于 0.5ng/mg蛋白质。

本申请包括本申请药物组合物在制备提高对象 的 TRPC6表达量用的药物中的用 途。 .

本申请也包括钙蛋白酶的抑制剂在制备提高对 象的 TRPC6表达量用的药物中的 用途。

本申请中， 钙蛋白酶的抑制剂包括本申请的多肽、 钙蛋白酶特异性的小干扰

RNA、 calpeptin、 亮抑蛋白酶 （leupeptin) 、 或 MDL28170或其任意组合。 所述多肽 可连接于穿膜因子。 钙蛋白酶特异性的小干扰 RNA可选自 SEQ ID NO: 5或 SEQ ID NO: 6, 或其组合。

本申请也包括 TRPC6增强剂在制备提高对象的 TRPC6表达量用的药物中的用 途。 增强剂包括 OAG、 其类似物或其任意组合。 本申请包括 NMDA受体拮抗剂在制 备提高对象的 TRPC6 表达量用的药物中的用途。 NMDA 受体拮抗剂包括金刚烷胺 ( memantine) 、 地佐环平、 SEQ ID NO: 7、 或 SEQ ID NO: 8等。 本申请包括 TRPC6 表达载体在制备提高对象的 TRPC6表达量用的药物中的用途。

本申请当然也包括 TRPC6表达载体本身。 在一个具体实施方式中， 所述表达载 体是 CaMKIIa启动子驱使的表达载体。

本申请涉及本申请多肽在制备治疗或预防缺血 引起的损伤用的药物中的用途。 所述多肽可与穿膜因子相连。 所述损伤包括脑缺血造成的脑损伤。 本申请多肽也可用于制备治疗或预防钙蛋白酶 和 TRPC6介导的各种疾病用的药 物， 通过抑制钙蛋白酶降解 TRPC6而实现治疗或预防目的。 所述疾病包括缺血造成 的损伤以及各种神经退行性疾病。

本申请多肽可用于制备保护神经元免受伤害的 药物。 所述伤害可由各种原因引 起， 包括由缺血引起的伤害等。

本申请多肽可用于制备治疗或预防各种神经退 行性疾病用的药物。

本文中， 神经退行性疾病包括阿尔茨海默氏病、 肌肉萎缩性侧索硬化症、 共济 失调毛细血管扩张症、 牛海绵状脑病、 克雅二氏病、 亨廷顿氏病、 小脑萎缩症、 多发 性硬化症、 帕金森氏病、 原发性侧索硬化、 和脊髓性肌萎縮症。

因此， 本申请还包括治疗或预防缺血引起的损伤的方 法， 该方法包括提高有此 需要的对象的 TRPC6的表达。

本申请还包括治疗或预防神经退行性疾病的方 法， 该方法包括提高有此需要的 对象的 TRPC6的表达。

本申请还包括保护神经元免受伤害的方法， 所述方法包括提高有此需要的对象 的 TRPC6的表达。

提高对象中 TRPC6 表达的方法包括： （1 ) 给予对象钙蛋白酶的抑制剂以抑制 该酶对 TRPC6表达的降解； ( 2 ) 提供 NMDA受体拮抗剂； （3 ) 提供. TRPC6表达 载体； 和 /或 （4 ) 提供 TRPC6表达增强剂。

给予对象钙蛋白酶的抑制剂包括给予对象本申 请的多肽、 钙蛋白酶特异性的小 干扰 RNA、 calpeptin, 亮抑蛋白酶、 或 MDL28170或其任意组合。 所述多肽可连接 于穿膜因子。 增强剂包括 OAG、 其类似物或其任意组合。 NMDA受体拮抗剂包括金 刚垸胺和地佐环平等。

本申请也包括一种提高患病对象中 TRPC6表达的方法。

本申请还包括治疗或预防钙蛋白酶和 TRPC6介导的各种疾病的方法， 所述方法 包括向有此需要的对象给予本申请的多肽， 通过抑制钙蛋白酶降解 TRPC6而实现所 述治疗或预防目的。

本文中， 对象包括各种哺乳动物， 尤其是人。

本申请提供一种筛选治疗或预防缺血引起的损 伤用的药物的方法， 所述方法包 括：

( 1 ) 将待测物质加入含有 TRPC6或表达 TRPC6的体系中；

( 2) 向步骤 （1 ) 所述的体系中加入钙蛋白酶；

( 3 ) 测定所述待测物质是否能抑制钙蛋白酶降解 TRPC6, 其中， 将能够抑制钙蛋白酶降解 T PC6的物质作为治疗或预防缺血引起的损伤 用的候选药物。

所述方法还包括， 测试该候选药物是否影响到钙蛋白酶除降解 TRPC6之外的其 它活性，.其中， 没有影响到钙蛋白酶的其它活性的候选药物是 优选的药物。

所述方法还包括， 进一步将测得的优选的药物进行体内实验。

本申请还涉及一种筛选 TRPC6表达增强剂的方法， 该方法包括：

( 1 ) 将待测物质加入表达 TRPC6的体系中； 和

( 2) 测定该体系中 TRPC6 的表达量， 其中， 与未加入待测物质的实验相比， 能使 TRPC6的表达量提高的待测物质确定为 TRPC6表达增强剂。

所述的表达 TRPC6的体系例如可以是细胞 （或细胞培养物） 体系， 所述的细胞 可以是内源性表达 TRPC6 的细胞； 或可以是重组表达 TRPC6 的细胞。 所述的表达 TRPC6的体系还可以是 (但不限于)亚细胞体系、 溶液体系、 组织体系、 器官体系或动 物体系 （如动物模型） 等。 所述含有 TRPC6的体系可以是例如含有 TRPC6的溶液体 系。 本文所用的术语 "治疗有效量" 指治疗剂治疗、 缓解或预防目标疾病或状况的 量， 或是表现出可检测的治疗或预防效果的量。本 领域技术人员能够采用常规的方法 评估一治疗是否达到所需的治疗目的。 . 下面结合具体实施例， 进一步阐述本发明。 应理解， 这些实施例仅用于说明本 发明而不用于限制本发明的范围。本发明的实 施除非另外说明， 将使用本领域技术人 员已知的化学、 生物化学、 重组 DNA技术和免疫学的常规方法。 这些技术在文献中 有完整的解释。 参见， 如 《基础病毒学》 （Fundamental Virology) ， 第二版， 第 I和 II卷 (B.N.Fields和 D.M.Knipe编）； 《实验免疫学手册》 （Handbook of Experimental Immunology ) ,第 I-IV 卷（D.M.Weir 禾 Π C.C.Blackwell 编， Blackwell Scientific Publications); T.E. Creighton, 《蛋白质： 结构和分子特性》 （Proteins: Structures and Molecular properties)(W.H. Freeman and Company, 1993)； A.L. Lehninger, 《生物化学》 ( Biochemistry) (Worth Publishers, Inc.最新版）； Sambrook等， 《分子克隆： 实验室 手册》 （Molecular Cloning: a Laboratory Manual ) ，第二版， 1989； 《酶学方法》 (Methods in Engymology) (S.Colowick禾卩 N. Kaplan编， Academic Press, Inc.)。 除 非另外说明， 否则百分比和份数按重量计算。 对于未指明来源的试剂， 使用的是通常 从市场上购得的常规试剂。 N2010/002044

具体实施例

1. 实验材料和方法

1.1 脑缺血动物模型

大鼠 （雄性 SD大鼠， 体重 250— 280克） 或小鼠 （雄性 C57BL6品系小鼠， 体 重 25— 30克）用 10 %的水合氯醛麻醉， 然后切开颈部皮肤， 分离出颈总动脉（CCA) 和颈外动脉 （ECA) ， 在 ECA两端结扎然后剪小口， 将栓线由此插入， 扎好栓线和 血管以后再放开靠近 CCA端的结扎线， 将栓线推入 CCA并且往上推入 ICA直至有 轻微阻感即可。 实验中， 大鼠缺血 2小时， 小鼠缺血 3小时以后， 将栓线退出， 恢复 灌流 （复灌） 。 在复灌不同时间后， 将老鼠脑取出， 间隔 2mm (大鼠） 或间隔 1mm (小鼠）切片， 然后将脑切片在 2% 2,3,5-三苯基四唑氯化物 (TTC, 在 0.9% 生理盐水 中） 中染色以确定梗塞区域的大小。

侧脑室注射药物的时候， 利用 stoelting公司的立体定位仪固定大鼠， 根据脑图谱 定位， 将药物 ( 5 μΐ)用微量注射泵 ( microsyringe pump, Stoelting Co. )按 0.5 μΐ/min 的速度注入侧脑室， 注射完毕留针 lOmin: 然后再缝合。

. 1.2 蛋白免疫印迹和免疫组织化学

细胞或组织在裂解液 （以 mM计， 10 Tris-Cl, pH 7.4, 150 NaCl, 5 EDTA, 1% Triton-XlOO, 1原钒酸钠， 50 NaF, 1 PMSF, 1 抑酶肽， 1 亮抑酶肽和 5 DTT) 中进行匀 浆裂解， 将匀浆液在 13000rpm， 4度， 离心 15分钟， 分离后取上清液。 用分光光度 计测定样品蛋白浓度并调整至相同浓度。 加入上样缓冲液， 混匀后在 95度加热 5〜8 分钟， 使蛋白变性后， 经过蛋白质 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳， 电转至硝酸纤维素膜， 用 5%的脱脂牛奶在室温封闭 1个小时， 用抗体稀释液 （5%BSA+0.05%NaN ₃ +PBS ) 稀释一抗到合适浓度（1 :200〜1 :2000)，用稀释过的一抗杂交过夜， PBS洗 3次后（3* 10 分钟） ， 用抗体稀释液稀释 HRP连接的羊抗兔 （鼠） 二抗， 室温孵育 2小时。 PBS 洗 3次后 （3* 10分钟） ， ECL曝光显影。 Western-blot的条带灰度经过胶片扫描后用 软件 ImageQuant (Amersham)统计分析。

免疫组化实验中， 麻醉动物后， 先用 37摄氏度的 PBS通过心脏灌流， 然后用 4 摄氏度的 4%PFA (多聚甲醛） 灌流固定， 最后取出脑组织； 组织块用 OCT (冰冻切 片包埋剂， 是一种聚乙二醇和聚乙烯醇的水溶性混合物） 包埋， 然后冰冻切片， 切片 厚度一般为 12— 16 μηΐ; 冰冻切片用 5%的普通羊血清室温封闭 1小时， 随即加入用 5%普通羊血清稀释好的一抗， 4摄氏度过夜， 第二天 PBS洗 3次后， 加入对应的荧 光二抗在暗处孵育 1小时， PBS洗 3次后， 用封片剂固定后到荧光显微镜下观察。 1.3 神经元的培养， 质粒转染和氧糖剥夺 （OGD ) 实验

怀孕 SD大鼠 （E17 ) ， 取胚胎小鼠的皮层， 胰酶消化后， 按 4χ 10 ⁶ 个细胞电转 质粒 4 g， 用电转仪 the rat neuron Nucleofector Kit (Amaxa, Koeln, 德国）将 DNA质 粒或 RNA质粒导入细胞。在氧糖剥夺实验中，先将细 胞外液替换为无葡萄糖的 Earle's 平衡盐溶液 （见 1.7 实验所用抗体和药品） ， 然后放入一个密闭的 OGD 室 (Forma Scientific, Marietta, OH, US A)中， 冲入氮气 （5% C0 ₂ 和 95% N ₂ )10分子， 然后将该 室放入 37Γ培养箱中孵育 2h; OGD处理结束， 换回原来的细胞外液再放入正常的培 养箱中孵育即可。 细胞死亡采用碘化丙锭 （PI) 染色的方法来计算。

1.4 电生理和钙成像实验

利用计算机控制的 700A扩增仪 (Axopatch 700A, Molecular Devices, Foster City, CA) , 在培养的皮层神经元上采用全细胞膜片钳的方 法来记录电信号。 电极内液成分 如下 （以 mM计）： CsCl 140, CaCl ₂ 0.3, EGTA 10, MgCl ₂ 1 , HEPES 10, pH 7.2。 正常细 胞外液包含 （以 mM计）： NaCl 140, KCl 5, MgCl ₂ 1, CaCl ₂ 1 , D-葡萄糖 10, 和 HEPES 10, pH 7.4o 记录过程中， 钳制电压为- 70 mV。

钙成像实验的方法主要是参考 Zhu 等 1996 的文章 [Zhu, X.等， trp, a novel mammalian gene family essential for agonist-activated capacitative Ca2+ entry. Cell, 1996. 85(5): p. 661-71.]。简言之， 皮层神经元和钙离子染料 Fura-2 AM (溶解在 0.0125 %的聚醚酸中， 并用 DMSO稀释)共孵育 30min， 整个反应在 HEPES缓冲盐水 (HPSS: (以 mM计） 120 NaCl, 5.3 KCl, 0.8 MgS0 ₄ , 1.8 CaCl ₂ , 1 1. 葡萄糖和 20 HEPES, pH7.4) 中进行，孵育完毕用 HPSS洗 2-3次，然后再用 HPSS孵育半小时。然后用尼康 eclipse Te2000-e显微镜来检测胞内钙离子浓度 [Ca ²⁺ ]i (F340/F380比)的变化情况。

1.5 体外钙蛋白酶切实验

成年大鼠脑组织用 HEPES 缓冲液 （以 mM 计： 20 HEPES, pH7.4, 5 KCl, 1.5 MgCl ₂ , 1 二硫苏糖醇， 1 EGTA) 来匀浆， 其提取物与 1 mM Ca ²⁺ 在 37摄氏度反应； 或者在 I mM Ca ²⁺ ， 37 摄氏度条件下与纯化的 μ-钙蛋白酶 (Biovision, Palo Alto, CA,USAS) 孵育 _D 为了确定钙蛋白酶在 TRPC6上的切割位点， 在 HEK293细胞中转 染 ¾g-loop-H^-TRPC6-"y c质粒 （pcDNA3.1TRPC6-myc质粒， 在之前插入 flag, 中 间 TRPC6第二个 loop区插入 HA，插入标签用的是美国 Stratagene公司的 QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit) ， 然后用 HEPES 缓冲液提取细胞裂解液， 再加入 μ-钙 蛋白酶切消化。 纯化蛋白 NUS-C6W03用 Μ 柱 (Qiagen, Hilden, 德国)提取， 然后加入 μ-钙蛋白酶切消化， 酶切下来的片段用来做质谱分析和 Edman测序。 1.6 TRPC6转基因小鼠的构建和培养

利用 CaMKIIa的启动子来驱动小鼠 TRPC6基因在小鼠大脑 （特别是前脑）神经 元上的表达。 在质粒 p279 ( Joe Z Tsian等， Neuron, March 4, 2004) 上含有大约 8.5kb 的来源于小鼠基因组的 CaMKIIa的启动子区域，在其后接上小鼠 TRPC6的 cDNA片 断， 并且后面加上 polyA尾巴。 将该质粒进行线性化， 然后显微注射到 C57BL6J和 FBN品系小鼠杂交的受精卵中，最后将注射好的 受精卵植入代孕的母鼠体内。转基因 小鼠的基因型是通过聚合酶链式反应（PCR) 的方法来鉴定的。 PCR检测所用的引物 分别是：

p279 F, GTTCTCCGTTTGCACTCAGG ( SEQ ID NO: 2) ；

trpc6-flag R, CGGGATCCCTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCTCTGCGG ( SEQ ID NO: 3 )

最终得到 3个亲代小鼠 (F0)。 使 F0的小鼠与 C57BL6J品系的小鼠进行交配产生 子代， 实验中所用的小鼠都是子 3代 （F3 ) .以上的小鼠。

1.7 实验所用抗体和药品

实验中所用商业化抗体分别来自以下公司：

Alomone Labs的兔抗 TRPC 1、 3、 4、 5、 6抗体；

Millipore 的兔抗 TRPC6抗体、.小鼠抗 NeuN、 抗 GFAP、 抗血影蛋白、 抗 NR2A 和抗 CD31抗体； '

Upstate的兔抗 GluRl、 GluR2/3、 GREB和磷酸 -GREB Serl33抗体， 小鼠抗 myc 和抗 PSD95抗体；

Sigma的小鼠抗 CaMKIIo 抗 α-微管蛋白抗体， 和抗 TRPC6抗体；

Santa Cruz的羊抗 capain 1抗体、 小鼠抗磷酸 -CaMKIIa Thr286抗体和抗 NOS 1 抗体。 .

除非特别说明， 其他药品及试剂均来自 Sigma公司。

由吉尔生化 （上海） 有限公司直接合成本申请的 TAT-C6肽 （见图 14b) 。

1.8 数据统计 用于数据分析的软件主要有： Clampfit 9.0( Axon公司，美国）、Origin 7.0( Originlab corporation , 美国）和 Excel 2003 ( Microsoft ) 。 实验数据以平均值士标准误 （mean ± s.e.m ) 表示。 用 t检验 （ student' s t-test, 包含配对与非配对检验） 比较两组数据之间 的差异性； 用方差分析 （ANOVA) 比较多组数据之间的差异性。 p表示显著性值， n 表示实验例数。 当 p < 0.05 即认为有显著性差异。 此外， 生存曲线的分析采用的是 nonparametric Kaplan-Meier方法.。

2. 实验结果

2.1 脑缺血后神经元中的 TRPC6蛋白特异的下调

大鼠局灶脑缺血模型采用的是中动脉栓塞 （middle cerebral artery occlusion ,

MCAO) 白勺方法 [Longa, E.Z.等, Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke, 1989. 20(1): p. 84-91 ] , 缺血 2小时然后复灌不同时间； 缺 血损伤情况用 TTC 染色的方法来检测。 首先， 在缺血大鼠脑中筛査了与生存相关的 分子的蛋白表达变化情况。将缺血大鼠脑中缺 血侧的半影区和相对应的正常侧脑区的 组织提取蛋白， 再用免疫蛋白印迹的方法来检测其中蛋白的变 化情况。 利用特异的 TRPC抗体 (图 1) (见 1.7 实验所用抗体和药品） ， 发现 TRPC6蛋白表达量在缺血 后复灌的 0、 6、 12和 24小时分别降低为对照侧蛋白量的 74 %、 58 %、 40 %和 32 % (每个时间点， n= 5-8只老鼠， * p < 0.05, * * p < 0.01， 图 2a) ， 而 TRPC3和 TRPC4 蛋白在这些时间点上却没有显著变化 （图 2b)。 尽管 TRPC6蛋白量在复灌后 24小时 有显著的降低， 但是 TRPC 1、 C3、 C4、 C5和 GluRl等蛋白的表达量却没有明显降低 (图 2c；)。 此外， 实时酶链式聚合反应也显示， 在缺血复灌后 TRPC6在 mRNA水平上 未有显著变化 （图 2d)， 这就提示， 其蛋白量的显著下调是发生在翻译后水平的。 综 上可以推断 TRPC6蛋白在缺血后的半影区发生了特异的下调� ��

接着， 用免疫组织化学的方法研究 TRPC6蛋白的下调是否发生在神经元中。 实 验显示， 复灌后 24小时在缺血侧的 NeuN阳性细胞 （神经元） 中 TRPC6的免疫阳性 显著降低 (图 2e)， 然而在 GFAP阳性细胞（胶质细胞） 中， TRPC6的免疫阳性却没有 明显变化 (图 3)。 这提示缺血后神经元中的 TRPC6蛋白发生了特异的下调。

2.2 TRPC6蛋白的下调先于神经元的死亡

为了研究 TRPC6蛋白的下调是否是神经元死亡的一个被动� ��果， 将缺血大鼠的 脑切片同时用 TRPC6蛋白的抗体 （见 1.7 实验所用抗体和药品） 和检测细胞死亡的 试剂盒 （TUNEL Kit ) 来做染色标记。 实验结果显示， 缺血复灌 24小时后， 半影区 的 TRPC6蛋白已有明显下调， 但是 TU EL检测的阳性细胞却要在复灌 48小时后才 会明显增多 （图 4a)。 进一步的统计分析表明， 缺血后的复灌期间， TRPC6蛋白量和 TU EL阳性细胞数之间有很好的负相关性。 如图 4b显示， 缺血后复灌 0小时开始， TRPC6蛋白就明显降低， 并且在 12、 24、 48小时其蛋白表达量显著的逐渐降低。 而 TUNEL标记的阳性细胞在复灌后 24小时才开始出现并在 48小时显著增加。 这就提 示， TRPC6蛋白的下调是先于神经元死亡的， 并且 TRPC6蛋白下调可能在其后的缺 血 神经元死亡中扮演一个重要角色。 ，

2.3 在细胞模拟缺血实验中 TRPC6蛋白发生功能性的下调

为了更好地研究 TRPC6蛋白的下调， 利用广泛使用的细胞模拟缺血实验， 即在 培养的神经元细胞上进行氧糖剥夺实验 （Oxygen-Glucose Deprivation , 简称 OGD ) [Goldberg, M.P.和 D.W. Choi, Combined oxygen and glucose deprivation in cortical cell culture: calcium-dependent and calcium-independent mechanisms of neuronal injury. J Neurosci, 1993. 13(8): p. 3510-24]。 结果发现， 在 OGD处理的培养神经元中， TRPC6 蛋白量特异地下调， 而 TRPC3蛋白量却没有显著变化（图 5a)。 通过定量 RT-PCR的 方法分析得出 TRPC6在 mRNA水平上并未有变化 （图 5b)， 这就与前面在动物中的 实验结果相符， 表明在模拟缺血刺激的条件下， 神经元中的 TRPC6蛋白也会发生特 异性的下调。

为了研究 TRPC6蛋白的下调是否影响膜上 TRPC6通道的功能，进行电生理实验。 利用全细胞膜片钳的记录方式， 在培养的神经元中 OAG ( DAG (二酰基甘油） 的类 似物，是 TRPC6、TRPC3通道的增强剂）可以引起一个缓慢� �微小的内向电流 （I _OAG )。 用 SKF96365 (广泛的 TRPCs通道的抑制剂， Sigma公司购得） 或者用 0 Ca ²⁺ 外液加 NMDG (替代 Na ⁺ )都可以完全抑制这一电流。 进一步， 在神经元中转染针对 TRPC6 蛋白的特异的 RNAi质粒 （RNAi_C6， 见 Zhou j*等的文献， 旨在敲减 TRPC6蛋白的 表达量） 可以抑制 OAG引起的这一电流 （图 6a、 b)。 同样， 在钙成像实验中， 发现 用 OAG 刺激可以在培养的皮层神经元中引起一个缓慢 而微小的胞内钙离子浓度 ([Ca ²⁺ ]i) 的升髙。这一 [Ca ²⁺ ]i的升高可以被 SKF96365所抑制；如果在 0 Ca ²⁺ 外液中， 0AG 则不能引起胞内钙升高； 此外， 如果神经元中过表达突变型的 TRPC6 (DN-TRPC6 ,其通道孔区有三个突变，从而可以抑制 TRPC6通道的开放 [Hofmann, T., et al., Subunit composition of mammalian transient receptor potential channels in living cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(1 1): p. 7461 -6]) , 则 OAG引起的 [Ca2+]i升高 也会被明显抑制 (图 7)。 并且， 根据电流和电压的关系所显示的该通道的双向 整流性 质（图 6c)， 提示 I _OAG 电流主要是由 TRPC6通道蛋白所介导的。 在 OGD处理的神经 元中， 发现 I _0AG 明显被抑制 (图 8)， 作为对照， 与己有报道一致的是， 由酸离子通道 所介导的电流 ΙρΗβ.Ο 明显增力口 [Xiong, Z.G., et al., Neuroprotection in ischemia: blocking calcium-permeable acid-sensing ion channels. Cell, 2004. 1 18(6): p. 687-98]。这 就提示， 在模拟缺血的实验条件下神经元中的 TRPC6通道蛋白特异下调， 从而导致 膜上 TRPC6通道功能的特异性的下调。

在神经元中过表达以下质粒： GFP (对照蛋白） ， TRPC6 (功能性通道蛋白） ， DN-TRPC6 (突变的没有功能的通道） ， RNAi_C6 (敲减 TRPC6蛋白的表达） （Zhou J*, Du WL*, Zhou KC, Tai YL, Yao HL, Jia YC, Ding YQ, Wang YZ. Critical role of TRPC6 channels in the formation of excitatory synapses. Nat Neurosci. 2008 Jul;l l(7):741-3 ) ， 并且对神经元做 OGD处理。 结果发现， 过表达 TRPC6蛋白可以 降低 OGD引起的细胞死亡数， 而过表达 DN-TRPC6或者过表达 RNAi_C6质粒敲减 内源的 TRPC6蛋白量都会明显增加 OGD引起的细胞死亡。这就说明， 在模拟的缺血 条件下， 增加 TRPC6蛋白表达量对神经元有保护作用， 而降低 TRPC6蛋白量则加重 细胞损伤 （图 9)。 与此相应， 我们用 OAG预处理细胞后再做 OGD刺激， 细胞死亡 率明显降低； 但是如果用 SKF96365预处理细胞后再给 OGD刺激， 则细胞死亡率明 显增加（图 10a)。 同样， 在 MCAO大鼠 （Sprague-Dawley, 250-280 g, 上海斯莱克实 验动物有限公司） 中， 如果预先侧脑室注入 OAG， 那么缺血引起的梗塞面积明显减 小； 相反， 如果预先注入 SKF96365 , 则加重缺血损伤 (图 10b,c)。 以上实验结果表明， 在模拟缺血剌激的情况下， 上调 TRPC6有很好的神经元保护作用， 而下调 TRPC6则 加重神经元的损伤。

此外， 在培养的神经元中过表达 TRPC3蛋白， 发现其对于 OGD引起的细胞死亡 并没有保护作用（图 11)。进一步的实验提示， TRPC6蛋白的特异性保护作用是有赖于 CREB蛋白的激活， 因为， 其一， 过表达 TRPC6蛋白量可以增加 p-CREB的表达量， 即激活形式的 CREB增多（图 12a); 其二， 如果将 KCREB (显性抑制型环磷酸腺苷 反应元件结合蛋白， 不能与 DNA结合， 无功能） 与 TRPC6共表达的话， 则完全抑 制了 TRPC6蛋白的保护作用（图 12b)。

2.4 TRPC6蛋白被钙蛋白酶降解

缺血复灌中， TRPC6 蛋白的快速下调提示， 这可能是由一种蛋白酶介导的快速 降解过程。 接下来的实验筛査是参与 TRPC6蛋白的下调的蛋白酶。

在大鼠脑组织提取液中，加入钙离子可以诱导 TRPC6蛋白特异的下调，而 TRPC3 蛋白却没有这种钙离子引起的下调，并且预加 EGTA可以阻断这种蛋白降解 （图 13 a)。 时程分析表明， 加入钙离子 5分钟后这一蛋白降解就非常明显了， 并且发现当钙离子 浓度从 Ι ΟΟμΜ开始就有这一降解现象 （图 13b)。 已知这样的钙离子浓度正好可以激 活 μ型钙蛋白酶， 这也是主要分布在神经元中的一类型钙蛋白酶 [Goll, D.E., et al., The calpain system. Physiol Rev, 2003. 83(3): p. 73 1 -801 ]。这些结果提示， TRPC6蛋白被一 种钙离子激活的蛋白酶水解。为了进一步验证 是哪一种蛋白酶参与此过程， 使用以下 抑制剂： PMSF , 丝氨酸蛋白酶抑制剂， cpm-VAD-CHO, caspase蛋白酶抑制剂， 以及 lactacystin, 蛋白降解体抑制剂 （见 1.7 实验所用抗体和药品） ， 然而， 这些抑制剂 都不能阻断这一体外系统中钙离子引起的 TRPC6蛋白的降解。 相反， 钙蛋白酶的抑 制剂， 包括： calpeptin , 亮抑蛋白酶和 MDL28170 (见 1.7 实验所用抗体和药品） ， , 它们都很好的阻断了钙离子引起的 TRPC6 蛋白的降解 (图 13a，c；)。 这些结果表明， TRPC6 蛋白的降解是由于钙蛋白酶的蛋白水解作用。 此外， 通过免疫蛋白印迹的方 法检测了 spectrin蛋白的降解情况（可以作为钙蛋白酶激� ��与否的一个标志 [Siman, R.， M. Baudry, and G. Lynch, Brain fodrin: substrate for calpain I, an endogenous calcium-activated protease. Proc Natl Acad Sci U S A, 1984. 81(1 1): p. 3572-6] ) , 证实 了在这一体外系统中钙蛋白酶确实是激活的。

接下来验证 TRPC6蛋白是否是由钙蛋白酶直接降解的。 首先在 HEK293细胞系 中表达了 N- 7ag-second \oo >-HA-C-myc ( pcDN A3. 1 TRPC6-myc质粒，在之前插入 flag, 中间 TRPC6第二个 loop区插入 HA， 插入标签用的是 Stratagene公司的 QuikChange® Site-Directed Mutagenesis Kit) 标记的 TRPC6质粒 （图 14, 示意小图）， 24小时以后， 收取细胞蛋白并做钙蛋白酶体外消化实验。 在免疫蛋白印记实验中用 ^4抗体检测发 现， 代表全长的 TRPC6蛋白的条带随着钙蛋白酶浓度的增加而降� �� (Fig. 3.4.2a), 并 且在原来主带下面出现两条条带。用 ?ag抗体检测发现， 随着钙蛋白酶浓度的增加全 长 TRPC6蛋白的条带很快的消失了，而用 m_yc抗体检测的全长条带消失明显晚于 ¾ _g 抗体所识别的条带， 并且随着钙蛋白酶浓度的增加， 全长的条带下面紧靠着出现一条 条带， 到最后的全部条带消失。 这就提示， TRPC6蛋白的 N端比 C端更容易被钙蛋 白酶降解。 因此推测 N端是开始降解的地方， 随着 N端的降解， TRPC6蛋白发生了 顺序的降解， 直至 C端片段也完全降解。

接下来， 在原核细胞 . Co/ 中表达了 TRPC6蛋白的 N端氨基酸序列 (把 TRPC6 的 N端序列从 M ¹ 到 D ^2Q3 亚克隆后接到载体 NUS— tag ( pET-43. 1 a载体， Novagen , 德 国） ， 即 NUS_C6 _WC) 3)， 分离纯化这段蛋白后， 加入钙蛋白酶消化。 结果显示， 钙 蛋白酶浓度依赖性地切割这段蛋白， 并且发现了一条被切割下来的片段， 把这一片段 收集并进行质谱分析和 N端测序， 显示该片段确实来源于 TRPC6 , 测序结果也证实 了钙蛋白酶在 TRPC6上的切割位点是在 AAPGA序列的 N端 （图 14b)。 根据这一位 点构建了一段多肽， 其序列就是包含了这一切割位点的一段 TRPC6的氨基酸序列， 并带有 TAT序列 （为了使其很好的穿过细胞膜 [Vives, E., P. Brodin,和 B. Lebleu, A truncated HIV-1 Tat protein basic domain rapidly translocates through the plasma membrane and accumulates in the cell nucleus. J Biol Chem, 1997. 272(25): p. 16010-7] ) 。 将 该 多 肽 命 名 为 TAT-C6 ， 其 序 列 为 GRKKRRQRRRCRRGGSLKAAPGAGTRR ( SEQ ID NO: 4 ) 。 接下来的要用这一段多 肽去特异的阻断钙蛋白酶对 TRPC6的蛋白水解作用而不影响钙蛋白酶的其他� ��能。 实验发现， 这段 TAT一 C6肽段可以有效的抑制 Ca离子引起的大鼠脑溶解物（rat brain lysates )中 TRPC6蛋白的降解，而并不影响钙蛋白酶的标志� ��底物 spectrin的降解 （图 14b, 右图）。 这就提示， 这段肽对于抑制钙蛋白酶降解 TRPC6 的过程是非常特异并 且有效的。 2.5 在缺血情况下 NMDA受体参与 TRPC6蛋白的降解

根据已有文献报道， 在缺血过程中， 钙蛋白酶的激活很可能是由于 NMDA受体 的过度开放造成的。

为了研究 NMDA受体是否参与了缺血条件下钙蛋白酶介导� � TRPC6蛋白水解过 程，首先在培养的神经元中预加入钙蛋白酶的 两种抑制剂： calpeptin和 MDL28170 (见 1.7 实验所用抗体和药品） ， 再将细胞做 OGD处理， 24小时后检测其中蛋白变化情 况和细胞死亡率。 实验结果显示， OGD引起的 TRPC6蛋白的降解可以被预加钙蛋白 酶的抑制剂所阻断。 并且， 这两个钙蛋白酶的抑制剂都可以有效的降低 OGD引起的 细胞死亡 (图 15a)。

预先在培养的皮层神经元中转染特异的针对钙 蛋白酶的两段 siRNA ( CAPN i_l : 5 ' -GCUUCUUGUUGGCCCUC AUTT-3 ' ( SEQ ID NO: 5 ) ； CAPN i_2 ， 5 '-GAAUCAUUAGCAAAC ACAATT-3 ' ( SEQ ID NO: 6 ) , 上海吉玛公司合成） 以敲 减钙蛋白酶的表达量， 再做 OGD刺激然后统计 TRPC6蛋白的降解情况。 结果发现， 这两段 siRNA都能很好的阻断 OGD引起的 TRPC6蛋白降解（图 15b)。

这些结果都表明， 细胞缺血条件下 TRPC6蛋白的下调确实由于钙蛋白酶的水解 作用。

此外还发现地佐环平 （MK801 , Sigma公司购得， NMDA受体的阻断剂）能有效 的阻断 TRPC6蛋白的降解（图 15c)， 提示 NMDA受体可能参与这一过程。 进一步的， 预 先 用 转 染 siRNA ( RANi 由 上 海 吉 玛 公 司 合 成 ， NR li— 1 : 5'-GGCAGUUCACGAACUCCUATT-3' ( SEQ ID NO: 7 ) ； NR li—2: 5 ' -GACU AAAGAUAGUGAC AAUTT-3 ' ( SEQ ID NO: 8 ) ) 的方法去降低 NMDA受 体一个必需亚基 NR1 的蛋白表达量， 结果， OGD引起的 TRPC6蛋白降解被有效的 抑制 (图 15d)。 这提示， NMDA受体也确实参与了 TRPC6蛋白的降解过程。 此外， 在 大鼠的缺血模型中， 如果预先侧脑室注入 NMDA受体的阻断剂 （memantine) 或钙蛋 白酶的抑制剂（calpeptin) ,都可以有效的抑制缺血引起的 TRPC6蛋白的降解 (图 15e)。 无论在缺血的动物模型中或细胞模型中， 都证实了 NMDA受体和钙蛋白酶都参与了 TRPC6蛋白的降解过程。

2.6 增加 TRPC6蛋白表达量可以有效的降低缺血小鼠脑损� ��

为了进一步证明 TRPC6蛋白量与脑缺血保护的关系，构建了 TRPC6转基因小鼠。 利用 CaMKIIa启动子驱使的表达载体， 可以将外源的 TRPC6蛋白比较特异的表达在 前脑神经元中， 这其中包括皮层和海马神经元， 而不包括小脑神经元。

首先鉴定了在转基因小鼠大脑皮层蛋白中， TRPC6 蛋白的表达水平较之于野生 型小鼠有明显的增加而其他蛋白水平未有改变 (图 16a, b)。 其次， 用免疫组化实验观 察到在转基因小鼠中 TRPC6 蛋白在皮层和海马中都有较高表达， 而小脑中没有 （图 16c)。 这都说明了转基因小鼠中的 TRPC6 蛋白特异的在前脑神经元中有较高表达。 接下来， 用转基因小鼠 (Tg)和其同窝的非转基因小鼠 (WT)做了缺血实验（这里釆用的 是双盲实验的方式， 即做手术的人员并不知道小鼠的分组， 而统计缺血损伤的人员也 不知道小鼠的分组情况） 。 结果发现 TRPC6转基因小鼠的脑梗塞面积明显小于非转 基因的野生型小鼠， 并且转基因小鼠的存活率也高于野生型小鼠 (图 17)。 这就进一步 的证实， 增加 T PC6蛋白表达量对于缺血小鼠的脑损失有明显的 降低作用， 并且可 以提高脑缺血后的存活率。 同时， 也用免疫组化的方法， 通过标记 CD31蛋白 （一种 血管内皮细胞的 marker, 常用于显示血管的结构及密度） ， 来检查转基因小鼠和野生 型小鼠脑中的血管结构及密度， 结果表明没有显著性差异 (图 18)。 另一方面， 用激光 多普勒血流仪来检测缺血前后转基因小鼠和野 生型小鼠脑中的血流量变化情况，结果 显示也没有明显差异 (图 18， 右图)。 所以， 我们认为， 转基因小鼠对于缺血损伤的耐 受性可能是由于保持了一定的 TRPC6蛋白量， 而并非其他原因。

为了进一步证实 TRPC6 转基因小鼠在脑缺血中的耐受性是由于其神经 元中

TRPC6蛋白量较高， 我们将缺血后的小鼠脑片做免疫组化染色标记 TRPC6蛋白的同 时用 TUNEL试剂盒来检测细胞死亡情况。 结果显示， 在转基因小鼠中， TRPC6蛋白 表达量高的细胞对应的 TU EL阳性数目较少， 而在野生型小鼠中 TRPC6蛋白表达 量低的细胞对应的 TUNEL阳性数目显著多于前者 （图 19)。 这就提示， 细胞中维持 一定的 TRPC6蛋白量可以有效的增加其对缺血损伤的耐� ��性。

如图 20a所示, 在假手术组中， 转基因小鼠脑中的 TRPC6蛋白量明显高于野生 型小鼠； 缺血后， 尽管转基因小鼠和野生型小鼠脑中的 TRPC6蛋白量都有明显降低， 但是转基因小鼠脑中的 TRPC6蛋白量仍然高于野生型小鼠。 这就提示缺血保护作用 可能是依赖于维持一定的 TRPC6蛋白量。

2.7 TRPC6的缺血保护作用可能是依赖于 CREB蛋白的激活

在 TRPC6转基因小鼠的皮层蛋白中， 检测缺血前后 p-CREB以及 CREB的蛋白 水平， 结果显示， 假手术组中， 转基因小鼠脑中的 p-CREB/CREB水平明显的高于野 生型小鼠， 并且在缺血后， 转基因小鼠皮层中的 p-CREB/CREB水平也仍高于对照小 鼠 （图 20b)。 作为对照， 还同时检测了其他受 Ca ^{2 +} 调控的下游蛋白， 比如， p-CaMKIIa/CaMKIIa和 NOS 1的蛋白量变化情况，结果表明在转基因小鼠� �野生型小 鼠中， 这两个蛋白的表达量在缺血前后都没有明显的 差异 （图 20c；)。 这就提示， 转基 因小鼠的缺血损伤小并且存活率长很可能是由 于其脑中 TRPC6蛋白水平较高， 进而 下游激活形式的 CREB , 即 p-CREB蛋白水平较高， 作为一个促进细胞存活的蛋白， CREB 的持续激活对于保护大脑免受缺血损伤有重要 作用 [Kitagawa, K., CREB and cAMP response element-mediated gene expression in the ischemic brain. Febs J, 2007. 274(13): p. 3210-7]。

2.8 抑制钙蛋白酶降解 TRPC6可以有效的降低大鼠脑缺血损伤

前面的实验表明， TAT— C6这段肽可以有效抑制 Ca ^{2 +} 引起的脑溶解物中 TRPC6 蛋白的降解而不影响钙蛋白酶对于其他底物的 降解过程。所以， 检测 TAT—C6肽是否 可以抑制脑缺血引起的脑中 TRPC6蛋白的降低，进而维持内源性 TRPC6蛋白量而保 护脑免受缺血损伤。实验结果显示， 缺血前侧脑室注入 TAT_C6肽可以有效的减少缺 血引起的 TRPC6蛋白的降解而不影响 spectrin的降解 (图 21)，即不影响钙蛋白酶的其 他功能， 只是特异性的抑制钙蛋白酶降解 TRPC6这一过程。 此外， 将大鼠分为三组， 分别给予 Veh. (蒸馏水） 、 T AT— Ctrl ( GRKKRRQRRRC— PPYGYYPSFRG E RL由 吉尔生化 （上海）有限公司直接合成）和 TAT_C6肽 （缺血前侧脑室注入） ， 然后缺 血 2小时复灌 24小时以后评估其缺血损伤情况， 发现只有第三组， 即 TAT_C6肽处 理组的大鼠其脑损伤最小， 相比前两组有明显的差异 (图 21 ,右图）。 综上， 利用针对 性的肽段 （TAT_C6)抑制钙蛋白酶降解 TRPC6 蛋白， 这一策略可以有效的保护缺血 性脑损伤。

3. 其它多肽也能抑制钙蛋白酶降解 TRPC6

. 在之前的实验中我们已证明 RRGGSLKAAPGAGTRR 可以阻止钙蛋白酶切割 TRPC6, 并且在侧脑室注射此肽段可以保护缺血脑损伤 。 为了进一步证明钙蛋白酶对 TRPC6 的切割位点是这一保护作用中的关键， 我们合成了包含有此位点的更短肽段 TAT-C6-2 ( grkkrrqrrrcGGSLKAAPGA ( SEQ ID NO: 9) ， grkkrrqrrrc为 TAT序列（穿 膜因子） ， KA为切点两侧的氨基酸） 。 侧脑室注射 （每只大鼠侧脑室注射 ImM肽 X 5 U 1) 后对损伤面积的分析表明， 缺血前注射此短肽段对缺血损伤仍有显著的保 护作用 （*ρ<0.05 ) (见图 22) 。

为了进一步证明钙蛋白酶对 TRPC6的切割位点是这一保护作用中的关键因素� �� 我们合成了包含有此位点的更短肽段 T AT-C6-3 ( TAT-C6-3： grkkrrqrrrcSLKAAP ( SEQ ID NO: 10) ， grkkrrqrrrc为 TAT序列 （穿膜因子） ， KA为切点两侧的氨基酸） 。 每 只大鼠侧脑室注射 ImM 肽 Χ 5 μ 1， 侧脑室注射后对损伤面积的分析表明， 缺血前注 射此短肽段对缺血损伤仍有仍有显著的保护作 用 （*ρ<0.05 ) (见图 23 ) 。

'此外， 在体外系统中 (cell-free)， 将钙蛋白酶与纯化的 TRPC6蛋白在 37°C并且有 钙离子存在的条件下孵育， 同时加入不同浓度的多肽。然后用免疫印迹的 方法检测某 多肽是否能浓度依赖性的抑制钙蛋白酶降解 TRPC6蛋白。

采用上述方法检测如下多肽： SLKAAPGAGTR、 RGGSLKAAPGAGTR、

TRRGGSLKAAPGAGTR 、 VCRRGGSLKAAPGAGTRR 、

FVCRRGGSLKAAPGAGTRRN , 预期这些多肽能够抑制特异性地竞争性结合到 钙蛋 白酶解离 TRPC6的位点， 从而抑制钙蛋白酶降解 TRPC6。 4. 腹腔注射 TAT-C6改善老年性痴呆模型老鼠的学习和记忆能 力

选取年龄在 1 1 个月左右的野生型 （WT ) 和 APP/PS1 老年性痴呆模型小鼠 ( APP/PS1 ) ， 按照 20mg/kg的剂量分别进行腹腔注射 TAT-C6肽和对应量的生理盐 水， 分成四个组 （每组的 n=5 ) ： WT注射 TAT-C6肽组 （WT+肽） ， WT注射生理盐 水组 （WT) ， APP/PS 1注射 TAT-C6肽组 （APP/PS1+肽） ， APP/PS1注射生理盐水 组 （APP/PS1 ) 。 每周注射两次， 一共持续三个月， 然后进行水迷宫实验检测老鼠的 学习和记忆能力。

结果显示 （图 24 ) ， 相比 WT组， APP/PS 1 组在训练阶段需要花更多时间才能 找到隐藏的平台 （图 24b ) ， 在测试阶段则更少次地穿越了平台位置 （图 24d) ， 提 示 APP/PS1 鼠在 14个月时表现出明显的学习记忆能力下降。 而与 APP/PS1 相比， APP/PS 1+肽组在训练阶段只需花更少时间即可找到隐� ��的平台， 在测试阶段则更多 次地穿越了平台位置 ( *p<0.05 ; **p<0.01 ; ***p<0.001 ) 。 这说明 TAT-C6肽能够显 著改善 APP/PS 1 鼠的学习和记忆能力。 以上以具体实施方式的形式描述了本发明。但 是， 这些具体实施例仅仅是阐述性 而言， 而非是对本发明范围的限制。本领域技术人员 在不偏离本申请说明书的精神的 情况下可对本发明作出各种变动和更改。 本申请的保护范围由权利要求书来限定。