La voie de biosynthèse des acides aminés aromatiques constitue une voie métabolique vitale pour les plantes, les bactéries et les champignons. En plus de la biosynthèse de la tyrosine, de la phénylalanine et du tryptophane, cette voie métabolique joue un rôle essentiel dans la production de nombreux métabolites aromatiques secondaires impliqués dans des processus tels que les interactions plantes-microbes, la biosynthèse de biopolymères structuraux comme la lignine et la subérine, la synthèse hormonale, ou la synthèse des quinones. Parmi l'ensemble des organismes vivants possédant cette voie métabolique, deux voies ont été identifiées pour la transformation du préphénate en tyrosine (Figure 1 ; Stenmark et al., 1974). Chez la plupart des bactéries chlorophylliennes, quelques microorganismes, et chez la plupart des plantes, la L-tyrosine est synthétisée par la voie de l'arogénate (Abou-Zeid et al., 1995 ; Byng et al., 1981 ; Connely and Conn 1986 ; Frazel and Jensen 1979 ; Gaines et al., 1982 ; Hall et al., 1982 ; Keller et al., 1985 ; Mayer et al., 1985). Dans cette voie, le préphénate est transaminé en arogénate par une transaminase spécifique, la préphénate aminotransférase (EC 2.6.1.57), puis l'arogénate est transformé en L-tyrosine par une arogénate dehydrogénase (EC 1.3.1.43 ; ADH sur la Figure 1).

D'une manière différente, chez des organismes comme la bactérie Escherichia coli ou les levures,

le préphénate est dans un premier temps transformé en p-hydroxyphenylpyruvate par une préphénate dehydrogénase (EC 1.3.1.12, EC 1.3.1.13), lequel p-hydroxyphenylpyruvate est transaminé en L-tyrosine (Lingens et al., 1967). De par son rôle dans la voie de biosynthèse de la tyrosine chez les plantes, l'enzyme arogénate dehydrogénase constitue une cible potentielle pour de nouveaux herbicides.

D'autres enzymes impliquées dans cette voie métabolique constituent déjà des cibles d'herbicides majeurs. On peut citer par exemple l'enzyme 5-enolpyruvylshikimate 3-phosphate synthase (EPSPS), intervenant en amont de la synthèse du préphénate, qui est la cible de l'herbicide total glyphosate. On peut également citer l'enzyme p-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase (HPPD) impliquée dans la transformation du p-hydroxyphenylpyruvate en homogentisate. L'HPPD est la cible de nouvelles familles d'herbicides dont l'activité conduit au blanchiment des feuilles (Schulz et al., 1993 ; Secor 1994). Ces herbicides sont notamment les isoxazoles (EP 418 175, EP 470 856, EP 487 352, EP 527 036, EP 560 482, EP 682 659, US 5 424 276) en particulier l'isoxaflutole, herbicide sélectif du maïs, les dicétonitriles (EP 496 630, EP 496 631), en particulier la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2 CH3-4-CF3 phényl) propane-1,3- dione et la 2-cyano-3-cyclopropyl-1-(2-SO2 CH3-4-2, 3 C12 phényl) propane-1,3-dione, les tricétones (EP 625 505, EP 625 508, US 5,506,195), en particulier la sulcotrione ou la mésotrione, ou encore les pyrazolinates.

Un des avantages des herbicides ayant pour cible des enzymes impliquées dans les voies métaboliques vitales des plantes est leur large spectre d'activité sur des plantes d'origines phylogénétiques éloignées. Toutefois, de tels herbicides présentent également l'inconvénient majeur, lorsqu'ils sont appliqués sur des cultures pour éliminer les végétaux indésirables ou "mauvaises herbes", d'agir également sur les plantes cultivées. Cet inconvénient peut tre pallié par l'utilisation de plantes cultivées tolérantes aux dits herbicides. De telles plantes sont généralement obtenues par génie génétique en introduisant dans leur génome un gène codant une enzyme de résistance audit herbicide de manière à ce qu'elles surexpriment ladite enzyme dans leurs tissus. Jusqu'à présent trois principales stratégies utilisant le génie génétique ont été employée pour rendre des plantes tolérantes aux herbicides. La première consiste à détoxifier l'herbicide par transformation de la plante avec un gène codant une enzyme de detoxification.

Cette enzyme transforme l'herbicide, ou son métabolite actif, en produits de dégradation non

toxique, comme par exemple les enzymes de tolérance au bromoxynil ou au basta (EP 242 236, EP 337 899). La seconde stratégie consiste à transformer la plante avec un gène codant l'enzyme cible mutée de manière à ce qu'elle soit moins sensible à l'herbicide, ou son métabolite actif, comme par exemple les enzymes de tolérance au glyphosate (EP 293 356, Padgette S. R. & al., J.

Biol. Chem., 266,33,1991). La troisième stratégie consiste à surexprimer l'enzyme cible sensible, de manière à produire dans la plante des quantités importantes d'enzyme cible, si possible bien supérieures à la quantité d'herbicide pénétrant la plante. Cette stratégie, qui a été employée pour obtenir avec succès des plantes tolérantes aux inhibiteurs d'HPPD (WO 96/38567), permet de maintenir un niveau suffisant d'enzyme fonctionnelle, malgré la présence de son inhibiteur.

Le fait que deux voies de biosynthèse de la L-tyrosine existent dans des groupes taxonomiques différents, et en particulier que la voie transformant directement le préphénate en p-hydroxyphenylpyruvate ne se retrouve pas chez les plantes permet d'envisager une quatrième stratégie pour rendre des plantes tolérantes aux herbicides. En effet, dans le cas de l'utilisation d'un composé herbicide ayant pour cible l'enzyme arogénate déhydrogénase chez les plantes, la transformation des plantes que l'on souhaite rendre tolérantes avec un gène codant une enzyme préphénate déhydrogénase de bactérie ou de levure permettra aux dites plantes de synthétiser de la L-tyrosine, donc de tolérer la présence du composé herbicide, malgré l'inhibition de l'enzyme arogénate déhydrogénase par ledit composé herbicide. Cette nouvelle stratégie consiste donc à créer chez les plantes que l'on souhaite rendre résistantes un contournement de la voie métabolique naturelle de biosynthèse de la tyrosine, laquelle voie utilise l'enzyme arogénate déhydrogénase, par implantation artificielle chez ces plantes d'une nouvelle voie métabolique de biosynthèse de la tyrosine utilisant l'enzyme préphénate déhydrogénase. Un tel contournement permet aux plantes le possédant, de préférence les plantes d'intért agronomique, de tolérer la présence du composé herbicide inhibant la voie métabolique naturelle, alors que les plantes ne possédant pas ce contournement, en particulier les végétaux indésirables, seront sensibles audit composé herbicide.

Description La présente invention concerne donc de nouveaux polynucléotides isolés codant pour une enzymese possédant une activité arogénate dehydrogénase. Selon la présente invention, on entend par"polynucléotide"une séquence nucléotidique naturelle ou artificielle pouvant tre de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin. Par enzymes possédant une activité arogénate dehydrogénase, on entend les enzymes capables de transformer l'arogénate en L-tyrosine. La mesure de l'activité arogenate dehydrogénase est réalisée par toute méthode permettant soit de mesurer la diminution de la quantité du substrat arogénate, soit de mesurer l'accumulation d'un produit issu de la réaction enzymatique, à savoir la L-tyrosine ou le cofacteur NADPH. En particulier, la mesure de l'activité arogenate dehydrogénase peut tre réalisée par la méthode décrite à l'exemple 4.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides codant pour une enzyme arogénate dehydrogénase comprennent des polynucléotides codant pour la séquence polypeptidique sélectionnée parmi la séquence décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 13. Il est bien connu de l'homme du métier que cette définition inclus tous les polynucléotides qui, bien que comprenant des séquences nucléotidiques différentes comme résultat de la dégénérescence du code génétique, codent pour une mme séquence d'acides aminés, laquelle est représentée par les identificateurs de séquences SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID N0 : 11 ou SEQ ID N0 : 13.

La présente invention comprend également des polynucléotides isolés codant pour des enzymes arogénate dehydrogénase et capables de s'hybrider de manière sélective à un des polynucléotides précédemment décrits, ou un fragment de ces polynucléotides constituant une sonde. Par"polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective", on entend selon l'invention les polynucléotides qui, par une des méthodes usuelles de l'état de la technique (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press), s'hybrident avec les polynucléotides ci-dessus, ou avec les sondes qui en sont dérivées, à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative.

Le bruit de fond peut tre lié à l'hybridation d'autres polynucléotides présents, par exemple d'autres ADNc présents dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre le polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective et les polynucléotides définis par les séquences SEQ ID NO : ci-dessus selon l'invention, ou les sondes, est généralement 10

fois, de préférence 100 fois plus intense que celui généré par l'interaction avec d'autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut tre mesuré par exemple, par marquage des polynucléotides décrits ci-dessus ou des sondes avec des éléments radioactifs, comme le 32p. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C- 60°C).

L'invention comprend également des polynucléotides isolés codant pour des enzymes arogénate dehydrogénase et homologues des polynucléotides précédemment décrits. Par "homologue", on entend selon l'invention des polynucléotides présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport aux séquences nucléotidiques décrites ci-dessus et codant pour une enzyme à activité arogénate dehydrogénase fonctionnelle. Ces modifications peuvent tre naturelle ou obtenues artificiellement selon les techniques usuelles de mutation conduisant notamment à l'addition, la délétion, ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides par rapport aux séquences de l'invention. Ces modifications déterminent un degré d'homologie vis-à-vis des séquences ci-dessus décrites. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport aux séquences décrites, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (Basic Local Alignment Search Tool ; Altschul et al., 1993, J.

Mol. Evol. 36 : 290-300 ; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 : 403-10 ; voir aussi http ://www. ncbi. nlm. nih. gov/BLAST/).

La présente invention concerne également des fragments des polynucléotides décrits ci- dessus. Le terme"fragment"désigne notamment un fragment d'au moins 20 nucléotides, en particulier d'au moins 50 nucléotides, et de préférence d'au moins 100 nucléotides.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le polynucléotide selon l'invention est représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 1, SEQ ID NO : 2, SEQ ID NO : 4, SEQ ID NO : 6, SEQ ID NO : 8, SEQ ID NO : 10 ou SEQ ID NO : 12.

La présente invention concerne également des polynucléotides comprenant au moins un des polynucléotides tels que décrits précédemment.

Tous les polynucléotides décrits ci-dessus codent des enzymes arogénate dehydrogénase.

En conséquence, l'invention s'étend donc à toutes les enzymes arogénate dehydrogénase codées

par l'ensemble de ces polynucléotides.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'enzyme arogénate dehydrogénase est une enzyme dont la séquence peptidique est sélectionnée parmi la séquence décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 13, ou un fragment de ces séquences. Par fragment, on entend essentiellement un fragment biologiquement actif, c'est-à-dire un fragment de la séquence d'une enzyme arogénate dehydrogénase possédant la mme activité qu'une enzyme arogénate dehydrogénase complète.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides et les enzymes arogénate dehydrogénase décrits ci-dessus proviennent de plantes. Plus particulièrement, ils proviennent de plantes du genre Arabidopsis, de préférence du genre A. thaliana, ou de plantes du genre Picea, de préférence Picea glauca.

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucléotides et les enzymes arogénate dehydrogénase décrits ci-dessus proviennent de bactéries. Plus particulièrement, ils proviennent de bactéries du genre Synechocystis.

La présente invention concerne également un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour une enzyme arogénate dehydrogénase tel que défini dans la présente invention, et un élément terminateur fonctionnel dans ce mme organisme hôte. Les différents éléments qu'un gène chimère peut contenir sont, d'une part, des éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des protéines, tels qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal ou un peptide de transit, ou un élément terminateur constituant un signal de polyadénylation, et d'autre part un polynucléotide codant pour une protéine. L'expression"liés entre eux de manière opérationnelle"signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de manière à ce que le fonctionnement d'un de ces éléments est affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de ladite séquence codante. La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed.,

New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant le gène chimère est essentiellement fonction de l'espèce hôte dans laquelle ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans un organisme hôte donné. Par"fonctionnels", on entend capables de fonctionner dans un organisme hôte donné.

Les promoteurs que peut contenir le gène chimère selon l'invention sont soit constitutifs, soit inductibles. Un promoteur constitutif selon la présente invention est un promoteur qui induit l'expression d'une séquence codante dans tous les tissus d'un organisme hôte et en permanence, c'est-à-dire durant toute la durée du cycle vital dudit organisme hôte. Certains de ces promoteurs peuvent tre tissu-spécifiques, c'est-à-dire exprimer la séquence codante en permanence, mais uniquement dans un tissu particulier de l'organisme hôte. Des promoteurs constitutifs peuvent provenir de tout type d'organisme. Parmi les promoteurs constitutifs qui peuvent tre utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple, des promoteurs bactériens, comme celui du gène de l'octopine synthase ou celui du gène de la nopaline synthase, des promoteurs viraux, comme celui du gène contrôlant la transcription des ARN19S ou 35S du virus de la mosaïque du Choux-Fleur (Odell et al., 1985, Nature, 313,810- 812), ou les promoteurs du virus de la mosaïque de la nervure du Manioc (tels que décrits dans la demande de brevet WO 97/48819). Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO), le promoteur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'un gène d'actine de riz (US 5,641,876).

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le gène chimère contient un promoteur inductible. Un promoteur inductible est un promoteur qui ne fonctionne, c'est-à-dire qui n'induit l'expression d'une séquence codante, que lorsqu'il est lui-mme induit par un agent inducteur. Cet agent inducteur est en général une substance qui peut tre synthétisée dans l'organisme hôte suite à un stimulus externe audit organisme, ce stimulus externe pouvant tre par exemple un agent pathogène. L'agent inducteur peut également tre une substance externe à cet organisme hôte capable de pénétrer à l'intérieur de celui-ci. De manière avantageuse, le promoteur utilisé dans la présente invention est inductible suite à l'agression de l'organisme hôte par un agent pathogène. De tels promoteurs sont connus, comme par exemple le promoteur du gène d'O-méthyltransférase de classe II (COMT II) de plante décrit dans la demande de brevet FR 99 03700, le promoteur PR-1 d'Arabidopsis (Lebel et al., 1998, Plant J. 16 (2) : 223-233), le

promoteur EAS4 du gène de la sesquiterpène synthase du Tabac (Yin et al., 1997, Plant Physiol.

115 (2), 437-451), ou le promoteur du gène codant la 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Nelson et al., 1994, Plant Mol. Biol. 25 (3) : 401-412) Parmi les éléments terminateurs pouvant tre utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple l'élément terminateur nos du gène codant la nopaline synthase d'Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 11 (2), 369-385), ou l'élément terminateur d'un gène d'stone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.

Il apparaît également important que le gène chimère comprenne aussi un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de l'enzyme arogénate dehydrogénase de manière spécifique dans une partie de l'organisme hôte, comme par exemple le cytoplasme, un compartiment particulier du cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires, par exemple les chloroplastes, ou dans la matrice extracellulaire.

Les peptides de transit peuvent tre soit simples, soit doubles. Les peptides de transit doubles sont éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire qu'ils comprennent, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. De tels peptides de transit doubles sont par exemple décrits dans la demande de brevet EP 0 508 909.

Comme peptide signal utile selon l'invention, on peut citer en particulier le peptide signal du gène PR-la du tabac décrit par Cornelissen et al. (1987, Nucleic Acid Res. 15,6799-6811) en particulier lorsque le gène chimère selon l'invention est introduit dans des cellules végétales ou des plantes, ou le peptide signal du précurseur du facteur Mat al (Brake et al., 1985, In : Gething M.-J. (eds.) ; Protein transport and secretion, pp. 103-108, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) lorsque le gène chimère selon l'invention est introduit dans des levures.

La présente invention concerne également un vecteur contenant un gène chimère selon l'invention. Le vecteur selon l'invention est utile pour transformer un organisme hôte et exprimer dans celui-ci une enzyme arogénate dehydrogénase. Ce vecteur peut tre un plasmide, un

cosmide, un bactériophage ou un virus. De manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent tre une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, notamment grâce à la présence d'une origine de réplication, et à y exprimer une enzyme arogénate dehydrogénase. Le choix d'un tel vecteur ainsi que les techniques d'insertion dans celui-ci du gène chimère selon l'invention sont largement décrits dans Sambrook et al.

(1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press) et font partie des connaissances générales de l'homme du métier. De manière avantageuse, le vecteur utilisé dans la présente invention contient également, en plus du gène chimère de l'invention, un gène codant pour un marqueur de sélection. Ce marqueur de sélection permet de sélectionner les organismes hôtes effectivement transformés, c'est-à-dire ceux ayant incorporé le vecteur. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte à transformer est un microorganisme, en particulier une levure, une bactérie, un champignon, ou un virus. Selon un autre mode de réalisation, l'organisme hôte est une plante ou une cellule végétale. Parmi les gènes codant pour des marqueurs de sélection utilisables, on peut citer les gènes de résistance aux antibiotiques tel que, par exemple, le gène de l'hygromycine phosphotransférase (Gritz et al., 1983, Gene 25 : 179-188), mais également les gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al., NAR 18 : 1062,1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyphosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées.

De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, et WO 97/04103.

La présente invention concerne également des organismes hôte transformés, contenant un vecteur tel que décrit ci-dessus. Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut tre introduit, pour la production d'enzyme arogénate dehydrogénase. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple Escherichia coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces, Kluyveromyces, ou Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un baculovirus, ou de préférence de cellules végétales et de plantes.

Par"cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des

embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.

On entend par"plante"selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones.

On entend par"organisme hôte transformé", un organisme hôte qui a incorporé dans son génome le gène chimère de l'invention, et produit en conséquence une enzyme arogénate dehydrogénase dans ses tissus, ou dans un milieu de culture. Pour obtenir les organismes hôtes selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser une des nombreuses méthodes de transformation connues.

Une de ces méthodes consiste à mettre les cellules à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et des vecteurs de l'invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen.

Genet. 168 (1), 111-115 ; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70 (4), 503-517).

L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs de l'invention à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), 650-660 ; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3 (1), 56-62). Une autre méthode consiste à directement injecter les vecteurs dans les cellules ou les tissus hôtes par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136). De manière avantageuse, la méthode dite de"biolistique"pourra tre utilisée. Elle consiste à bombarder des cellules ou des tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs de l'invention (Bruce et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), 9692-9696 ; Klein et al., 1992, Biotechnology 10 (3), 286-291 ; US Patent No. 4,945,050). De manière préférentielle, la transformation de plantes se fera à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6,143-173 ; Shaw et al., 1983, Gene 23 (3) : 315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genet.

16 : 357-384 ; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4 (1), 24-28). De manière préférentielle, la transformation de cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14 (6), 745-750).

L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de 1'organisme hôte à transformer.

La présente invention concerne donc également un procédé de préparation de l'enzyme arogénate dehydrogénase, comprenant les étapes de culture d'un organisme hôte transformé comprenant un gène codant pour une enzyme arogénate dehydrogénase tel que défini ci-dessus

dans un milieu de culture approprié, de récupération de l'enzyme arogenate dehydrogénase produite dans le milieu de culture par centrifugation ou par filtration, puis de purification de l'enzyme récupérée par un passage au travers d'au moins une colonne de chromatographie. Ces étapes conduisent à l'extraction et à la purification totale ou partielle de l'enzyme arogenate dehydrogénase obtenue. De manière préférentielle, l'organisme transformé est un microorganisme, en particulier une bactérie, une levure, un champignon, ou un virus.

La présente invention comprend également un procédé d'identification d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogenate dehydrogénase, caractérisé en ce que : (a) on prépare au moins deux échantillons contenant chacun une quantité équivalente d'enzymes arogenate dehydrogénase en solution (b) on traite un des échantillons avec un composé (c) on mesure l'activité arogenate dehydrogénase dans chacun desdits échantillons (d) on identifie le composé utilisé à l'étape (b) comme étant un composé herbicide lorsque l'activité mesurée à l'étape (c) est significativement inférieure dans l'échantillon traité par rapport à l'échantillon non traité (e) on valide l'activité herbicide du composé identifié à l'étape (d) en traitant des plantes avec ledit composé Selon le présent procédé, la mesure de l'activité arogenate dehydrogénase est réalisée par toute méthode permettant soit de mesurer la diminution de la quantité du substrat arogenate, soit de mesurer l'accumulation d'un produit issu de la réaction enzymatique, à savoir la L-tyrosine ou le cofacteur NADPH. En particulier, la mesure de l'activité arogenate dehydrogénase peut tre réalisée par la méthode décrite à l'exemple 4. De plus, l'activité herbicide validée à l'étape (e) du présent procédé peut tre une activité mortelle se traduisant par la mort de la plante traitée, ou une activité de ralentissement significatif de la croissance de la plante traitée.

Par composé, on entend selon l'invention tout composé chimique ou mélange de composés chimiques, y compris les peptides et les protéines. Par mélange de composés on comprend selon l'invention au moins deux composés différents, comme par exemple les (dia) stéréoisomères d'une molécule, des mélanges d'origine naturelle issus de l'extraction de matériel biologique (plantes, tissus végétaux, culture bactériennes, cultures de levures ou de champignons, insectes, tissus animaux, etc.) ou des mélanges réactionnels non purifiés ou

purifiés totalement ou en partie, ou encore des mélanges de produits issus de techniques de chimie combinatoire.

Selon un mode particulier de réalisation du procédé selon l'invention, les enzymes arogénate dehydrogénase employées proviennent de plantes, de préférence d'Arabidopsis thaliana.

Selon un autre mode de réalisation du procédé selon l'invention, les enzymes arogénate dehydrogénase employées proviennent de bactéries, de préférence de bactéries du genre Synechocystis.

De préférence, les enzymes arogénate dehydrogénase employées dans le procédé selon l'invention sont les enzymes selon la présente invention, en particulier celles représentées par les SEQ ID NO : 3, SEQ ID NO : 5, SEQ ID NO : 7, SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 11 ou SEQ ID NO : 13.

L'invention s'étend également aux composés herbicides identifiés par le procédé ci-dessus mentionné, en particulier les composés herbicides ayant pour cible une enzyme arogénate dehydrogénase, c'est-à-dire ceux qui inhibent l'activité de cette enzyme. De manière préférentielle, les composés herbicides ne sont pas des inhibiteurs généraux d'enzymes. De manière également préférentielle les composés herbicides selon l'invention ne sont pas des composés déjà connus pour avoir une activité herbicide.

La présente invention concerne également des compositions agrochimiques herbicides comprenant comme matière active au moins une quantité efficace d'un composé herbicide selon l'invention.

Par composition agrochimique herbicide, on entend selon l'invention une composition applicable de manière préventive ou curative sur les surfaces sur lesquelles des végétaux cultivés sont ou doivent tre cultivés, afin d'empcher le développement de végétaux indésirables ou "mauvaises herbes"sur les surfaces sur lesquelles sont mis en culture lesdits végétaux cultivés, quel que soit leur stade de développement. Une quantité efficace de composé herbicide selon l'invention correspond à une quantité de composé permettant de détruire ou d'inhiber la croissance des végétaux indésirables.

Les compositions agrochimiques herbicides selon l'invention comprennent un composé herbicide selon l'invention ou un de ses sels acceptables en agriculture ou un complexe

métallique ou métalloïdique de ce composé, en association avec un support solide ou liquide, acceptable en agriculture et/ou un agent tensioactif également acceptable en agriculture. En particulier sont utilisables les supports inertes usuels et les agents tensioactifs usuels. Ces compositions recouvrent non seulement les compositions prtes à tre appliquées sur une plante ou une semence à traiter au moyen d'un dispositif adapté, tel qu'un dispositif de pulvérisation ou de poudrage, mais également les compositions concentrées commerciales qui doivent tre diluées avant application sur la culture.

Les compositions herbicides selon l'invention peuvent contenir aussi de nombreux autres ingrédients tels que, par exemple, des colloïdes protecteurs, des adhésifs, des épaississants, des agents thixotropes, des agents de pénétration, des stabilisants, des séquestrants. Plus généralement, les matières actives peuvent tre combinées à tous les additifs solides ou liquides correspondant aux techniques habituelles de la mise en formulation.

Par le terme"support", on désigne selon la présente invention une matière organique ou minérale, naturelle ou synthétique, avec laquelle la matière active est combinée pour faciliter son application sur les parties de la plante. Ce support est donc généralement inerte et il doit tre acceptable en agriculture. Le support peut tre solide (par exemple des argiles, silicates naturels ou synthétiques, silice, résines, cires, engrais solides) ou liquide (par exemple de l'eau, des alcools, notamment le butanol).

L'agent tensioactif peut tre un agent émulsionnant, dispersant ou mouillant de type ionique ou non ionique ou un mélange de tels agents tensioactifs. On peut citer par exemple des sels d'acides polyacryliques, des sels d'acides lignosulfoniques, des sels d'acides phénolsulfoniques ou naphtalènesulfoniques, des polycondensats d'oxyde d'éthylène sur des alcools gras ou sur des acides gras ou sur des amines grasses, des phénols substitués (notamment des alkylphénols ou des arylphénols), des sels d'esters d'acides sulfosucciniques, des dérivés de la taurine (notamment des alkyltaurates), des esters phosphoriques d'alcools ou de phénols polyoxyéthylés, des esters d'acides gras et de polyols, les dérivés à fonction sulfates, sulfonates et phosphates des composés précédents. La présence d'au moins un agent tensioactif est généralement indispensable lorsque la matière active et/ou le support inerte ne sont pas solubles dans l'eau et que l'agent vecteur de l'application est l'eau.

La présente invention concerne également des plantes transgéniques tolérantes à un composé herbicide ayant pour cible une enzyme impliquée dans l'une des étapes métaboliques de

transformation du préphénate en L-tyrosine, caractérisées en ce qu'elles contiennent un gène codant une enzyme préphénate dehydrogénase et expriment ladite enzyme dans leurs tissus. Une enzyme préphénate dehydrogénase est une enzyme catalysant la réaction de transformation du préphénate en p-hydroxyphénylpyruvate. L'identification d'une enzyme à activité préphénate dehydrogénase peut tre réalisée par toute méthode permettant soit de mesurer la diminution de la quantité du substrat préphénate, soit de mesurer l'accumulation d'un produit issu de la réaction enzymatique, à savoir le p-hydroxyphénylpyruvate ou un des cofacteurs NADH ou NADPH. En particulier, la mesure de l'activité préphénate dehydrogénase peut tre réalisée par la méthode décrite à l'exemple 4.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes transgéniques selon l'invention sont tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogénate déhydrogénase, de préférence une enzyme arogénate déhydrogénase telle que décrite dans la présente invention.

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, les plantes kransgéniques selon l'invention sont tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme préphénateaminotransférase.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le gène codant l'enzyme préphénate dehydrogénase exprimée dans les plantes tolérantes selon l'invention est un gène de levure. De préférence, il s'agit du gène codant l'enzyme préphénate dehydrogénase de Saccharomyces cerevisiae (No. d'accession NC001134) tel que décrit dans Mannhaupt et al.

(1989, Gene 85,303-311) et représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 14.

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le gène codant l'enzyme préphénate dehydrogénase exprimée dans les plantes tolérantes selon l'invention est un gène de bactérie. De préférence, il s'agit d'un gène de bactérie du genre Bacillus, en particulier de l'espèce B. subtilis (No. d'accession M80245) tel que représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 16. De préférence, il s'agit d'un gène de bactérie du genre Escherichia, en particulier de l'espèce E. coli (No. d'accession M10431) telle que décrit dans Hudson et al. (1984, J. Mol. Biol.

180 (4), 1023-1051) et représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 18. De préférence, il s'agit d'un gène de bactérie du genre Erwinia, en particulier de l'espèce d'E. herbicola (No. d'accession 43343) tel que représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO : 20.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le gène codant l'enzyme préphénate dehydrogénase exprimée dans les plantes tolérantes selon l'invention est un gène de

champignon.

Les plantes transgéniques selon l'invention sont obtenues par transformation génétique avec un gène codant une enzyme préphénate dehydrogénase. De préférence, ce gène est un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour une enzyme préphénate dehydrogénase, et un élément terminateur fonctionnel dans ce mme organisme hôte. Ce gène est généralement introduit dans un vecteur, lequel est utilisé pour introduire ledit gène dans lesdites plantes par une des méthodes de transformation décrites ci-dessus.

La présente invention concerne également un procédé de production de plantes tolérantes vis-à-vis de composés herbicides ayant pour cible une enzyme impliquée dans l'une des étapes métaboliques de transformation du préphénate en L-tyrosine, caractérisé en ce que l'on transforme lesdites plantes avec un gène codant une enzyme préphénate dehydrogénase de manière à ce qu'elles l'expriment dans leurs tissus.

Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le présent procédé s'applique à la production de plantes tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogénate déhydrogénase telle que décrite dans la présente invention.

Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le présent procédé s'applique à la production de plantes tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme préphénate aminotransférase.

Le présent procédé comprend donc également un procédé de production de plantes tolérantes vis-à-vis d'un composé herbicide ayant pour cible une enzyme arogénate déhydrogénase, caractérisé en ce que l'on transforme lesdites plantes avec un gène codant une enzyme préphénate dehydrogénase de manière à ce qu'elles l'expriment dans leurs tissus.

Les plantes transgéniques selon l'invention peuvent également contenir, en plus d'un gène codant une enzyme préphénate dehydrogénase, au moins un autre gène contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intért. Parmi les polynucléotides codant pour une protéine d'intért, on peut citer des polynucléotides codant une enzyme de résistance à un herbicide, par exemple le polynucléotide codant pour l'enzyme bar (White et al., NAR 18 : 1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le polynucléotide codant pour l'enzyme EPSPS (US

5,188,642 ; WO 97/04103) pour la tolérance au glyphosate ou encore le polynucléotide codant pour l'enzyme HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer un polynucléotide codant pour une toxine insecticide, par exemple un polynucléotide codant pour une toxine de la bactérie Bacillus thuringiensis (pour exemple, voir International Patent Application WO 98/40490). Peuvent également tre contenus dans ces plantes d'autres polynucléotides de résistance aux maladies, par exemple un polynucléotide codant pour l'enzyme oxalate oxydase tel que décrit dans la demande de brevet EP 0 531 498 ou le brevet US 5,866,778, ou un polynucléotide codant pour un autre peptide antibactérien et/ou antifongique tels que ceux décrits dans les demandes de brevets WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, et W099/91089. On peut également citer des polynucléotides codant pour des caractères agronomiques de la plante, en particulier un polynucléotide codant pour une enzyme delta-6 désaturase tel que décrit dans les brevets US 5,552,306, US 5,614,313, et demandes de brevets WO 98/46763 et WO 98/46764, ou un polynucléotide codant pour une enzyme serine acétyltransférase (SAT) tel que décrit dans les demandes de brevets WO 00/01833 et PCT/FR 99/03179.

Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.

Exemple 1 : Identification du gène codant l'enzyme arogénate déhydrogénase d'Arabidpsis tlaaliana Une comparaison des séquences de toutes les enzymes préphénate déhydrogénase et arogénate déhydrogénase actuellement disponibles dans les bases de données publiques (http ://www. ncbi. nlm. nih. gov) a révélé quatre courtes portions de séquences homologues. Les enzymes comparées sont la préphénate déhydrogénase de levure (numéro d'accession : Z36065), la préphénate déhydrogénase de Bacillus subtilis (numéro d'accession : M80245), et la préphénate déhydrogénase de Synechocystis (numéro d'accession : D90910). Ces portions d'homologie ont permis d'identifier un gène d'A. thaliana (numéro d'accession : AF096371) initialement annoté comme codant une enzyme"similaire à la D-isomer spécifique 2-hydroxyacid dehydrogénase".

Ce gène est constitué de deux exons séparés par un intron de 94 bp. Le premier exon comporte un cadre ouvert de lecture de 1.08 kb contenant une séquence putative de peptide de transit chloroplastique située en aval du premier codon ATG. Le second exon code potentiellement pour un cadre ouvert de lecture de 892 bp. Une très forte homologie d'environ 60 % existe entre les séquences protéiques déduites des deux exons. Cette homologie s'étend à 70% si la séquence putative de peptide de transit chloroplastique située dans le premier exon n'est pas prise en compte. De plus, chacune des deux séquences protéiques prédites a la taille et possède les quatre portions homologues caractéristiques des enzymes préphénate/arogénate déhydrogénases. Ce gène a été appelé TyrA (SEQ ID NO : 1).

Exemple 2 : Caractérisation transcriptionnelle de TyrA La taille du transcrit du gène TyrA a été déterminée par les techniques de Northern Blot et PCR. Des ARNm purifiés extraits de jeunes feuilles d'A. thaliana ont été hybridées avec des sondes radiomarquées au 32P correspondant à des fragments d'ADN des deux exons de TyrA.

Cette analyse a permis d'identifier un transcrit de 1.8-1.9 kb très proche de la taille présumée d'un ARNm contenant les deux exons. De plus, bien que l'ADNc complet n'aie pas pu tre amplifié par PCR, un fragment PCR de 1.5 kb a été obtenu. Ce fragment comprend l'oligonucléotide 5' (P8 = 5'-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3') commençant en position 513 bp, et l'oligonucléotide 3' (P7 = 5'-CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-

3') complémentaire du 3'UTR et commençant en position 2053 bp. Ce fragment contient une partie de la première séquence codante (TyrA-ATI) et la séquence complète de la seconde séquence codante (TyrA-AT2). L'analyse de la séquence de cet ADNc a confirmé l'épissage de l'intron. Les résultats des analyses par Northern Blot et PCR suggèrent fortement l'existence d'un transcrit ARNm contenant les deux régions codantes TyrA ATI (SEQ ID NO : 4) et TyrA-AT2 (SEQ ID NO : 6).

Exemple 3 : Préparation de construits contenant les différentes séquences codantes de l'arogénate déhydrogénase d'A. fhaliana Le premier exon TyrA-A T1 a été obtenu par amplification PCR de 1'ADN gnomique d'A. thaliana avec l'oligonucléotide P1 (5'-TCTCCATATGATCTTTCAATCTCATTCTCATC-3') qui introduit un site de restriction Nde 1 (souligné) au niveau du premier codon ATG, et l'oligonucléotide P2 (5'-CTAACTAACTAACTACATACCTCATCATATCC-3') qui est complémentaire de l'extrémité 3'du premier exon et de l'extrémité 5'de l'intro et introduit un codon stop (souligné). Trois construits exempts de la séquence codant le peptide de transit ont également été réalisés avec l'oligonucléotide P3 (5'-CCTCTCTTTCCATATGCTCCCTTCTC-3') qui introduit un site de restriction Nde I (souligné) au niveau du second codon ATG (M43) en position 127, l'oligonucléotide P4 (5'-CCGCCAGCCACCTCCATATGACCGACACCATCC-3') qui introduit un codon initiateur ATG et un site de restriction Nde I (souligné) en position 174 depuis le premier codon ATG (V58M), et l'oligonucléotide P5 (5'-CGCCACCCCTCATATGCGTATCGCC-3') qui introduit un codon initiateur ATG et un site de restriction Nde I (souligné) en position 222 depuis le premier codon ATG (L75M). Tous les fragments PCR correspondant au premier exon, codant un peptide de transit ou non, ont été clones dans le plasmide pPCR-Script (Stratagène). Des fragments d'ADN Nde I-BamH 1 contenant les séquences codantes, avec ou sans la séquence de peptide de transit, ont ensuite été clones dans le plasmide pET21 a (+) (Novagen), conduisant à l'élaboration des plasmides pET21-TyrA-ATI, avec et sans séquence de peptide de transit (pET21-TyrA-ATI- M1,pET21-TyrA-ATI-M43, pET21-TyrA-ATI-M58, et pET21-TyrA-ATl-M75).

Deux autres oligonucléotides ont été utilisés pour amplifier la deuxième séquence codante (TyrA- AT2). L'oligonucléotide P6 (5'-GATGCATCTTTGCATATGATGAGGTCAGAAGATG-3') introduit un site de restriction NdeI (souligné) au niveau du codon ATG du second cadre ouvert de lecture (en position 1081 depuis le premier codon ATG), et l'oligonucléotide P7 (5'-CAGTATAATTAGTAGTCAAGGATCCTGACTGAGAG-3') complémentaire du début du 3'-UTR qui

introduit un site de restriction BamH I (souligné). Le fragment PCR correspondant à la deuxième séquence codante a été digéré par Nde I-BamH I, puis clone dans le plasmide pET21 a (+), donnant la plasmide pET21-TyrA-AT2.

La séquence codante complète a été reconstituée par assemblage de l'extrémité 5'manquante du premier exon avec un ADNc de TyrA-AT partiel (1.5 kb), obtenu par amplification PCR de 1'ADNc d'Arabidopsis avec l'oligonucléotide P8 (5'-GCTAAAACTCTTCTCCTTCAATACTTACCTG-3') commençant en position 513 bp depuis le premier codon ATG et l'oligonucléotide 3'P7. Un site de restriction EcoRV situé en position 812 bp depuis le premier codon ATG et présent dans l'extrémité 5'de l'ADNc partiel de TyrA-AT a été utilisé pour la reconstitution. L'ADNc partiel de TyrA-AT a été cloné dans le plasmide pPCR-Script. Un fragment EcoRV-EcoRV a été obtenu du plasmide pPCR-Script-TyrA-AT puis cloné dans le plasmide pPCR-Script-TyrA-ATI préalablement digéré par EcoRV. Cette manipulation a conduit à l'obtention du plasmide pPCR- Script-TyrA-ATc. Un fragment Ndel-BamHl contenant la séquence codante complète a été excisé du plasmide pPCR-Script-TyrA-ATc, puis clone dans un plasmide pET21a (+) (Novagen), préalablement digéré par Ndel et BamHl, conduisant au plasmide pET21a (+)-TyrA-ATc. Puis, de la mme manière que pour le premier exon, quatre plasmides pET21a (+)-TyrA-ATc ont été obtenus. Un plasmide contenant la séquence codante complète avec la séquence codant le peptide de transit putatif, et trois plasmides dénués de cette séquence de peptide de transit qui a été clivée à trois sites différents (M43, V58, et L75, voir ci-dessus).

Pour tous les construits décrits ci-dessus, les inserts d'ADNc ont été séquençés afin de s'assurer qu'aucune mutation indésirable n'a été introduite qu cours des amplifications PCR.

Exemple 4 : Mesure des activités enzymatiques L'activité arogénate deshydrogénase est mesurée à 25°C par suivi spectrophotométrique à 340 nm de la formation de NADH ou NADPH dans une solution contenant 50 mM de Tris-HCI, pH 8.6,300 pM d'arogénate, et 1 mM de NAD ou NADP dans un volume total de 200 p1.

L'activité préphénate deshydrogénase est mesurée à 25°C par suivi spectrophotométrique à 340 nm de la formation de NADH ou NADPH dans une solution contenant 50 mM de Tris-HCI, pH 8.6,300 uM de préphénate, et 1 mM de NAD ou NADP dans un volume total de 200 . 1.

Exemple 5 : Production d'arogénate déhydrogénase recombinante

Des cellules d'Escherichia coli AT2471 ont été transformées avec chacun des plasmides pET21-TyrA-AT obtenus à l'exemple 3, puis cultivée à 37°C dans 2 litres de milieu Luria-Bertani supplémenté avec 100 llg/ml de carbeniciline. Lorsque la culture a atteint l'équivalent d'une absorbance à 600nm (A600) de 0,6,1 mM dtisopropyl-ß-D-thiogalactoside a été ajouté au milieu de culture afin d'induire le synthèse des protéines recombinantes. Les cellules ont ensuite été cultivées pendant 16h à 28°C, récoltées, puis centrifugées 20 min à 40 000 g. Le culot a ensuite été resuspendu dans un tampon Tris-HCl 50 mM, pH 7.5,1 mM EDTA, 1 mM dithiothreitol, 1 mM benzamidine HC1, 5 mM amino caproic acid, puis soniqué (100 impulsions toutes les 3 secondes à la puissance 5) avec un disrupteur Vibra-Cell (Sonics and Materials, Danbury, CT, USA). Les extraits bruts ainsi obtenus sont ensuite centrifugés 20 min à 40 000 g, et les surnageant sont utilisés directement pour les tests enzymatiques.

Les analyses par SDS-PAGE d'extraits protéiques totaux de la souche E. coli AT 2471 contenant les différents construits pET21-TyrA-Atc, pET21-TyrA-ATl, et pET21-TyrA-AT2, ont révélé la présence de trois protéines recombinantes possédant des masses moléculaires de 66-68 kDa, 35 kDa, et 33-34 kDa respectivement. Ces masses moléculaires correspondent bien avec les masses déduites de leurs séquences codantes respectives (68786 Da pour TyrA-ATc, 34966 Da pour Tyr- A-AT1, et 34069 Da pour Tyr-A-AT2). Pour les transformants contenant la séquence codante complète (TyrA-Atc) et la première séquence codante (TyrA-ATI), des protéines recombinantes n'ont été observées qu'avec les construits codant les protéines M58-TyrA-Atc et M58-TyrA-ATl.

Les trois protéines recombinantes ont principalement été retrouvées dans les corps protéiques.

Toutefois, la présence de faibles quantités de protéines recombinantes dans les extraits protéiques solubles d'E. coli ont permis une caractérisation de leurs propriétés biochimiques.

Exemple 6 : Identification et caractérisation biochimique des enzymes arogénate dehydrogénase d'Arabidopsis thaliana La caractérisation biochimique des enzymes arogénate déhydrogénase recombinantes a été mise en oeuvre à partir des extraits protéiques solubles des souches d'E. coli transformées.

L'activité arogénate déhydrogénase a été mesurée selon la méthode décrite à l'exemple 4. Une activité arogénate déhydrogénase strictement NADP-dépendante a été mise en évidence pour chacune des trois enzymes recombinantes. Aucune activité arogénate déhydrogénase n'a été détectée en présence de NAD, et aucune activité préphénate déhydrogénase n'a été détectée quel que soit le cofacteur utilisé (NADP ou NAD) et quelle que soit la protéine testée (TyrA-ATc,

TyrA-ATI, ou TyrA-AT2). De plus, le préphénate à une concentration de 1 mM n'inhibe pas l'activité arogénate déhydrogénase des trois enzymes recombinantes. Chacune de ces enzymes a un comportement de type Michaelis-Menten, et leur valeur de Km pour l'arogénate et le NADP est peu différent (Figures 2 et 3). Les constantes de Michaelis pour le NADP sont respectivement de 40 uM pour TyrA-Atc, 60 u. M pour TyrA-AT1, et 20 uM pour TyrA-AT2. Les constantes de Michaelis pour l'arogénate sont respectivement de 70 uM pour TyrA-Atc, 45 uM pour TyrA- AT1, et 45 IlM pour TyrA-AT2. De plus, comme les autres arogénates déhydrogénases de plantes (Byng et al., 1981, Phytochemistry 6,1289-1292 ; Connelly and Conn, 1986, Z. Naturforsch 41c, 69-78 ; Gaines et al., 1982Planta 156,233-240), les arogénates déhydrogénases d'Arabidopsis sont toutes très sensibles à la tyrosine, le produit de la réaction enzymatique, et insensibles à 1 mM de phenylalanine et 1 mM de p-hydroxyphenylpyruvate. L'inhibition par la tyrosine est compétitive vis-à-vis de l'arogénate (Ki de 14 uM pour TyrA-Atc, 8 uM pour TyrA-ATI, et 12 uM pour TyrA-AT2), et non-compétitive vis-à-vis du NADP.

Exemple 7 : Identification et caractérisation biochimique de l'enzyme arogénate dehydrogénase de Synechocystis La séquence du gène codant l'arogénate déhydrogénase d'A. thaliana identifiée à l'exemple 1 (TyrA) a permis d'identifier un gène d'arogénate déhydrogénase chez la bactérie Synechocystis (numéro d'accession : 1652956). Ce gène était originellement décrit comme codant une enzyme "préphénate déhydrogénase". Il a été isolé à partir de d'une banque gnomique de Synechocystis, et l'enzyme a été produite de la mme manière que l'enzyme d'A. thaliana selon le protocole décrit à l'exemple 5. Une caractérisation biochimique de l'enzyme produite a permis de démontrer qu'il s'agit d'une enzyme arogénate déhydrogénase et non pas d'une enzyme préphénate déhydrogénase. Cette caractérisation biochimique de l'enzyme arogénate déhydrogénase de Synechocystis a été mise en oeuvre à partir des extraits protéiques solubles purifiés des souches d'E. coli transformées. L'activité arogénate déhydrogénase a été mesurée selon la méthode décrite à l'exemple 4. Une activité arogénate déhydrogénase strictement NADP-dépendante a été mise en évidence pour cette enzyme. Aucune activité arogénate déhydrogénase n'a été détectée en présence de NAD, et aucune activité préphénate déhydrogénase n'a été détectée quel que soit le cofacteur utilisé (NADP ou NAD). De plus, le préphénate à une concentration de 1 mM n'inhibe pas l'activité arogénate déhydrogénase de cette enzyme. L'arogénate déhydrogénase de

Synechocystis a un comportement de type Michaelis-Menten (Figure 4). La constante de Michaelis est de 6, uM pour le NADP, et de 107 FM pour l'arogénate.

Exemple 8 : Identification d'autres enzymes arogénate déhydrogénase de plantes La séquence du gène codant l'arogénate déhydrogénase d'A. thaliana identifiée à l'exemple 1 (TyrA) a permis d'identifier un autre gène d'arogénate déhydrogénase chez A. thaliana. Ce nouveau gène (Numéro d'accession : AC034256 ; SEQ ID NO : 8) était initialement annoté comme "contenant une similarité avec la protéine d'abondance de l'embryon (EMB20) de Picea glauca".

Il possède également une séquence de peptide de transit chloroplastique putative, mais pas de région répétée.

La séquence du gène TyrA a également permis d'identifier deux autres ADNc codant pour des enzymes arogénate déhydrogénase dans les bases de données d'EST (Expressed Sequence Tags) publiques. Une de ces ADNc, qui n'est pas complet, correspond à un ADNc de Tomate (TC41067 ; SEQ ID NO : 22). Le caractère incomplet de cet ADNc ne permet pas de déterminer s'il est dupliqué comme TyrA car son extrémité 3's'arrte juste après le codon correspondant au D356 de Tyr-ATl. Le second ADNc correspond à un ADNc complet de Picea glauca (Numéro d'accession : L47749 ; SEQ ID NO : 10), et ne possède pas de région répétée. Cet ADNc de Picea. glauca était annoté comme étant une protéine d'abondance de l'embryon".