技术领域

本发明涉及一种抗病毒化合物， 更具体地，涉及一种改良的 Tat蛋白及其制 备方法和应用。

背景技术

高效抗逆转录病毒治疗 (Highly Active Antiretroviral Therapy, HAART) 治疗可以有效地将病人体内的病毒数量控制到 检测不到的程度，但是潜伏感染的 HIV-1 (人类免疫缺陷病毒一型） 前病毒整合进宿主的基因组中形成储存库以后 很难去除。病人必须长期用药以抑制病毒复制 ， 一旦撤药就会造成病毒复制的回 弹。 怎样清除 HIV-1的潜伏感染已经成为彻底治愈艾滋病的瓶� ��问题。

白介素 2 Cnterleukin 2 IL-2)和 anti_CD3等细胞因子曾被用于激活 HIV-1 的潜伏感染， 这些细胞因子使细胞在整体水平上发生了激活 ， 对机体造成了极大 的毒副作用。 多种组蛋白乙酰化酶抑制剂 （Histone Deacetylase inhibitor, HDACi ) 也是目前研究比较多的潜伏激活剂， 一方面由于 HDACi对基因的激活也 是广谱效应， 容易引起其他基因的异常表达， 另一方面在体外效果比较好的 HDACi , 如 valproc acid (VPA)禾口 Vorinostat (即 suberanilohydroxamic acid, SAHA)等， 在临床上的表现都不佳， 不能够投入实际应用。 因此， 寻找新的特异 性强、 高效而安全的潜伏激活剂是当务之急。

HIV-1 Tat是 HIV-1特异性的反式激活因子， 该蛋白特异地结合到 HIV-1 5'

LTR的 TAR上， 将 HIV-1 mRNA的转录抬高数百倍。 Tat 蛋白在 HIV-1的潜伏感 染中也是关键的因子。 该蛋白带有穿膜肽， 被证明具有高效穿过细胞膜的功能； 曾被设计作为 HIV-1的疫苗进入临床实验使用，对人体相对安� ��。但 Tat蛋白被 证明具有诱导凋亡的功能， 可能对免疫细胞功能造成影响。

发明内容

本发明的目的之一就是寻找一种新的抗 HIV途径，

首先提供一种 Tat蛋白在制备抗 HIV药物中的应用，本发明采用的是 TAT-86 来证明效果。

更进一步提供一种减毒 Tat蛋白在制备抗 HIV药物中的应用， 所述的减毒 Tat蛋白氨基酸序列 SEQ N0: 1、 SEQ N0: 2、 SEQ N0: 3、 SEQ N0: 4所示。 更进一步提供一种减毒 Tat蛋白，所述的减毒 Tat蛋白氨基酸序列 SEQ N0: 1 (R4M4)、 SEQ NO: 2 (R4M5)、 SEQ NO: 3 (R4M7)、 SEQ NO: 4 (R5M4) 所示。

进一步提供一种上述的减毒 Tat蛋白的制备方法，其特征在于， 首先选择定 点突变的位点， 对这些位点在 Tat的基因上进行定点突变， 最终得到大量保留 Tat 的反式激活功能， 并去除其中凋亡和其他活性的减毒蛋白。

本发明具有以下优点：

1. 本发明的目的在于提供若干减毒的 HIV-1 Tat蛋白用于激活 HIV-1潜伏 感染。

2. 本发明提供了一种利用 HIV-1 自身的反式激活蛋白 Tat作为激活潜伏感 染工具的思路， 并且通过累计突变对 Tat蛋白进行改造， 使其在安全性上更加可 罪。

3. 本发明提供四种减毒的 Tat蛋白， 能够在细胞水平上特异性激活 HIV-1 潜伏感染。

4. 本发明提供了一种改良的 HIV-1体外潜伏感染模型的构建方式。

5. 本发明提供一种减毒 Tat蛋白跟 SAHA联用激活 HIV-1潜伏感染的新方 法。

6. 本发明提供的减毒 Tat蛋白对免疫细胞的功能不造成影响。

7. 本发明发现 Tat蛋白的具备较好的反式激活活性， 能够有效抬高 HIV-1 mRNA的转录。

8. Tat蛋白具备良好的穿膜活性， 能够有效进入细胞和各个组织发挥功能 附图说明

图 1 : HIV1 Tat蛋白改造及筛选原理。

图 2: 四种减毒 Tat的模式图。

图 3: 四种减毒 Tat能够在 Tzm-bl中激活 HIV-1的启动子。

图 4: Tat_R5M4的改造降低了细胞毒性和凋亡活性。

图 5: Tat-R5M4能有效地穿膜进入细胞以及各个组织。

图 6: HIV-1体外潜伏感染模型的构建。

图 7: Tat-R5M4能有效激活 HIV-1体外潜伏模型。

图 8: Tat-R5M4能有效激活来自临床病人外周血的潜伏� ��染状态的 CD4 ⁺ T细胞。 图 9: 急性毒性实验和免疫原性检测。 具体实 式

下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本 发明。除非特别说明， 本发明 采用的试剂、设备和方法为本技术领域常规市 购的试剂、设备和常规使用的方法。 实施例一： 对 Tat蛋白的改造和活性检测 在过去的几十年中， HIV-1 Tat的结构和功能已经有很详细的研究。 在本发 明中， 我们通过积累突变改造出去除凋亡活性， 同时保留大部分反式激活活性的 Tat蛋白。 由于 Tat 蛋白前三个结构域 （氨基酸 1-59 ) 的研究已经非常详尽， 所以我们首先选择研究较少的氨基酸 60-72进行点突变，将突变的基因连接到真 核表达载体上转染 Tzm-bl细胞后检测荧光素酶活性，其中只有 M36， M39, M51， M66， M67， M68， M69， M77 保留了 80%的反式激活活性。 接着我们把这些突变 进行组合叠加，进行了一共六轮突变，最后得 到 4个候选蛋白： R4M4, R4M5, R4M7, R5M4, 其中 R5M4积累了最多 5个点突变。 其中 R4M4在定点突变中， 将第 36位的缬氨酸用丙氨酸取代， 第 66位的谷 氨酰胺用丙氨酸取代， 第 67位的缬氨酸用丙氨酸取代， 第 68位的丝氨酸用丙氨 酸取代。 其中 R4M5在定点突变中， 将第 39位的异亮氨酸用丙氨酸取代， 第 66位的 谷氨酰胺用丙氨酸取代， 第 67位的缬氨酸用丙氨酸取代， 第 68位的丝氨酸用丙 氨酸取代。 其中 R4M7在定点突变中， 第 66位的谷氨酰胺用丙氨酸取代， 第 67位的缬 氨酸用丙氨酸取代， 第 68位的丝氨酸用丙氨酸取代， 第 77位的丝氨酸用丙氨酸 取代。 其中 R5M4在定点突变中， 将第 36位的缬氨酸用丙氨酸取代， 第 66位的谷 氨酰胺用丙氨酸取代， 第 67位的缬氨酸用丙氨酸取代， 第 68位的丝氨酸用丙氨 酸取代， 第 77位的丝氨酸用丙氨酸取代。

将 R4M4， R4M5, R4M7, R5M4克隆到原核表达载体中进行表达及纯化， 获得 的蛋白对 Tzm-bl细胞进行处理， 48小时后检测 Firefly Luciferase的活性。

该实验证明改造的 R4M4， R4M5, R4M7, R5M4在 Tzm-bl中具有良好的反式激 活活性。

实施例二： 细胞毒性和凋亡活性检测

分别将 ΙΟηΜ, 50ηΜ， ΙΟΟηΜ, 500nM， luM, 2uM, 3uM, 4uM 的 Tat-86或 Tat-R5M4与 Tzm-bl细胞共同孵育， 48小时后用 MTS法检测细胞活力。 分别用 0. lug, 0. 5ug, lug, 2ug的 Tat-86 (根据常规的技术进行原核表达， 引用文献： Expression of full length Tat in E. coli and its purification) 禾口 Tat_R5M4 和 Jurkat细胞共孵育， 48小时后用 Annexin_V_FITC和 PE双染色， 通过流式细 胞术检测凋亡比例。

本实验证明 Tat_R5M4明显降低了细胞毒性和诱导凋亡的能力� ��

实施例三： 检测 Tat-R5M4的穿膜活性

为了验证 Tat-R5M4在突变后是否影响穿膜活性， 纯化的 Tat_R5M4蛋白用 NHS-罗丹明 （NHS-Rhodanmine) 进行了标记， 标记过的蛋白分别处理 PBMC禾口 Jurkat细胞 6小时后用流式检测 Tat进入细胞的状态。 Tat_R5M4具有良好的穿 膜活性。 为了检测 Tat-R5M4进入细胞以后在胞质跟胞质的分布情况� �� Tzm_bl细 胞用纯化的 Tat-R5M4蛋白处理后用 Tat_R5M4的抗体进行免疫荧光检测，我们发 现 Tat-R5M4进入细胞后大部分分布在胞质， 仅有少量蛋白进入胞核。 为了检测 Tat-R5M4蛋白在小鼠体内的分布情况， 罗丹明标记的 Tat_R5M4蛋白通过尾静脉 注射进入小鼠体内， 6小时后脾脏、 胸腺、 大脑和小肠等组织制作切片后检测， 发现 Tat_R5M4明显分布在这些组织中。

本实验证明了改造后的蛋白完整保留了其穿膜 特性，能够高效进入细胞和组 织发挥功能。

实施例四： HIV-1体外潜伏感染模型的构建

用带有 基因的假病毒感染激活的原代 CD4 ⁺ T细胞， 通常阳性率在 5%-10%之间。 感染 3天后， 我们通过流式分选把 GFP阳性的细胞分选出来， 用添 加了 IL-2的 PRM1640培养基继续培养，同时添加 CD3和 CD28抗体进行再次激活， 一周后换成不添加任何细胞因子 PRM1640培养基， 培养 3-4周后撤除 IL-2使细 胞逐步进入静息状态。 这些静息状态的细胞即可用于潜伏激活剂的检 测。

实施例五： Tat-R5M4在 HIV-1体外潜伏感染模型和临床病人来源的 CD4 ⁺ T细胞 中的激活作用

用体外构建的潜伏感染系统对 Tat-R5M4激活潜伏感染的能力进行检测， 同 时用 CD3/CD28和 SAM处理作为阳性对照，三天后通过荧光显微镜 观察 GFP阳性 细胞的比例。

用 CD3/CD28抗体和 SAHA作为阳性对照，同时用 Tat_R5M4或者 Tat_R5M4和 SAHA联用处理分离的临床样本 CD4 ⁺ T细胞， 18小时后取上清， 提取 RNA检测上 清中的 HIV-1 RNA含量。 以上实验证明 Tat-R5M4能有效地激活 HIV-1体外潜伏感染模型和临床病人 样本来源的潜伏状态的 CD4 ⁺ T细胞， 同时与 SAM联用能增强其反式激活效应。 实验六： 急性毒性实验和免疫原性检测 为了给后续的动物实验提供了一定的理论支持 ， Tat_R5M4蛋白的毒性被进 行进一步的检测。 首先， 用 Babl/c小鼠进行的急性毒性实验表明， 当尾静脉注 射剂量达到 40mg/ml时小鼠依然生存良好。 小鼠的丙氨酸氨基转移酶或谷丙

(ALT ) , 天冬氨酸氨基转移酶或谷草 （AST)、 尿素氮 （BREA) 和 CR (肌酐） 等 指标经检测都处于正常水平， 病理切片也显示， 除了野生型 Tat-86蛋白引起了 肝部局部炎症细胞的浸润， 小鼠的心脏、 肝脏、 脾脏、 肺部和肾都未显示明显损 伤，表明 Tat-R5M4对小鼠实验而言是安全的。同时，我们� ��现尾静脉注射 Tat-86 一周后， 小鼠的脾脏有明显的肿大， 说明 Tat-86会引起明显的免疫反应， 但 Tat-R5M4不会引起类似的现象。 继而我们分别用 Tat-86和 Tat_R5M4皮下注射 免疫小鼠， 在 7天， 14天， 21天时分别断尾取血检测 Tat抗体的浓度， 发现 Tat-R5M4剌激产生的抗体量明显要低于 Tat_86。 本实验证明改造后的 Tat-R5M4对小鼠相对安全， 且免疫原性显著降低， 比 野生型 Tat-86更适于进行体内实验。 SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学 <120> 一种 Tat蛋白及其制备方法和应用 〈130〉

〈160〉 4

<170> Patentln version 3. 3

<210> 1

<211> 86

<212> PRT

<213> Tat 蛋白

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