La présente invention est relative à l'utilisation de cellules, dans lesquelles le cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline est modifié, pour le criblage et la sélection d'inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, à l'application de ces derniers en tant qu'anticancéreux ainsi qu'à un procédé de criblage mettant en oeuvre lesdites cellules.

Les microtubules forment, avec les filaments d'actine et les filaments intermédiaires, le cytosquelette des cellules eucaryotes. Les microtubules sont des organelles protéiques composées de molécules de tubuline, assemblées en structures tubulaires d'environ 25 nm de diamètre, d'une longueur pouvant atteindre plusieurs dizaines de micromètres.

Les microtubules jouent de multiples rôles dans la cellule. Ils ont un rôle central dans la genèse et le maintien de la forme des cellules. Lors de l'interphase, ils organisent l'espace intracellulaire et sont responsables du transport intracellulaire d'organelles. Ils sont essentiels à la division cellulaire ; en effet, lors de la mitose, ils se réorganisent pour former le fuseau mitotique, responsable de la répartition des chromosomes entre les deux cellules filles. Dans le système nerveux, les microtubules sont aussi directement impliqués dans la pousse des neurites et le transport axonal.

Enfin, ils jouent un rôle central dans la motilité de cellules différen- citées, comme par exemple les spermatozoïdes.

Dans les cellules, la tubuline, formée de deux sous-unités (a et ß), existe sous plusieurs isoformes. Cette diversité est générée à deux niveaux : -la transcription sélective d'un ou plusieurs gènes codant pour chaque sous-unité, -une variété de modifications post-traductionnelles de la tubuline, comme son acétylation (Piperno G. et al., J. Cell Biol., 1985,101,2085-2094), sa phosphorylation (Gard D. et al., 1985, J. Cell Biol., 1985,100,764-774), sa glutamy- lation (Eddé B. et al., Science, 1990,247,83-85), sa polyglycylation (Redeker V. et

al., Science, 1994,266,1688-1691) ou sa tyrosination (Barra HS. et al., 1988,2, 133- 143).

Cette dernière modification est connue sous le nom de cycle de tyro- sination-détyrosination de la tubuline et est illustré à la figure 1.

Conformément à ce cycle, la tubuline existe sous une forme tyrosine (tubuline tyrosine ou tubuline-tyr) et sous une forme détyrosinée (tubuline détyrosinée ou tubuline-glu) ; le passage de l'une à l'autre de ces formes met en jeu deux enzymes spécifiques, qui agissent au niveau de l'acide aminé carboxy-terminal Tyr de la sous-unité a de la tubuline : le résidu tyrosine est clivé de la chaîne polypeptidique principale par une tubuline-carboxypeptidase (TCP) ou rajouté par une enzyme spécialisée, la tubuline-tyrosine-ligase (TTL) (voir figure 1).

Ce cycle, qui est absolument spécifique de la tubuline, inclut la synthèse d'une liaison peptidique sans participation des ribosomes.

Une autre isoforme de la tubuline, résistante à la tyrosination, a également été mise en évidence (Paturle-Lafanechère L. et al., J. Cell. Science, 1994, 107,1529-1543 et Biochemistry, 1991,30,10523-10528). Il s'agit d'une forme parti- culière de tubuline, représentant environ 35 % de la tubuline cérébrale, qui a été dénommée tubuline A2. Elle comprend deux aminoacides en moins (Glu450-Tyr45'), par rapport à la tubuline-tyr (voir figure 2).

Les Inventeurs ont maintenant constaté, de manière surprenante, qu'il existe une suppression sélective de la tubuline-tyrosine-ligase (TTL) dans les tumeurs, qui est directement corrélée à l'apparition de tubuline A2, normalement absente des cellules non-neuronales. La génération de tubuline A2, lors de la crois- sance tumorale, associée à la suppression d'activité de la TTL est pathologique ; la tubuline A2 constitue donc un marqueur tumoral, particulièrement intéressant.

La TTL agit préférentiellement sur la tubuline libre et ne semble pas avoir d'action sur la tubuline des microtubules, alors que la TCP agit de préférence sur la tubuline polymérisée (microtubules assemblés). En conséquence, les microtubules nouvellement assemblés, en interphase, sont largement composés de tubuline-tyr tandis que les microtubules stables sont largement composés de tubuline-glu.

Les Inventeurs ont également trouvé que l'absence de TTL est compatible avec un cycle résiduel, dans lequel la tubuline tyrosine (tubuline-tyr) provient de la néosynthèse de tubuline, ce qui a pour conséquence que l'inhibition de l'activité de la tubuline carboxypeptidase permet de restaurer des niveaux normaux de tubuline tyrosine.

C'est pourquoi les Inventeurs se sont donné pour but d'utiliser des cellules permettant de cribler des substances capables d'inhiber l'activité de la tubuline-carboxypeptidase et en conséquence de compenser l'élimination de l'activité TTL au cours de la croissance tumorale et donc d'inhiber cette croissance.

La présente invention a pour objet l'utilisation de cellules issues de n'importe quel tissu, dans lesquelles le cycle de tyrosination-détyrosination de la tubuline est modifié, lesquelles cellules surproduisent de la tubuline-glu, pour la sélection ou le criblage de produits inhibiteurs de l'activité de la tubuline- carboxypeptidase (TCP).

Lesdites cellules produisant de la tubuline-glu en excès, sont notam- ment obtenues, soit par inhibition de la dynamique de renouvellement de l'assemblage de tubuline, soit par inhibition de l'activité TTL.

La dynamique de renouvellement de l'assemblage de tubuline est inhibée, soit par un agent de stabilisation des microtubules, tel que le taxol, soit par un alcaloide de la pervenche, tel que la vinblastine.

En effet, l'addition de taxol favorise la polymérisation de la tubuline, in vitro ; ajouté aux cellules, il provoque l'assemblage d'une grande proportion de la tubuline libre en microtubules stables. La vinblastine ou la vincristine induisent la formation d'agrégats paracristallins de tubuline.

De telles cellules, surproductrices de tubuline-glu, lorsqu'elles sont en présence d'un inhibiteur de la TCP, doivent voir la tubuline-glu disparaître et la tubuline-tyr apparaître.

Par ailleurs, les cellules dans lesquelles l'activité TTL est inhibée, notamment par un anticorps anti-TTL, mais dans lesquelles l'activité TCP est intacte, produisent de la tubuline-glu, alors que lorsqu'elles sont en présence d'un inhibiteur de TCP, on doit observer une restauration de niveaux normaux de tubuline-tyr.

La présente invention a également pour objet l'utilisation de cellules qui ne produisent pas de tubuline-tyr (cellules TTL-), pour un criblage ou une sélection d'inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase.

De telles cellules, dans lesquelles l'activité TCP est intacte, produisent de la tubuline-glu, alors que lorsqu'elles sont en présence d'un inhibiteur de TCP, on doit observer l'apparition de tubuline-tyr par néosynthèse, et une diminution ou une disparition de tubuline-glu.

De telles cellules sont notamment des cellules dérivées de cellules NIH/3T3 déposées sous le N° ATCC CRL 1658 (fibroblastes embryonnaires de souris) et sont obtenues après de multiples passages en culture ; ces cellules produisent de la tubuline-glu et de la tubuline-A2.

La présente invention a également pour objet l'utilisation d'un extrait brut ou semi-purifié de TCP pour le criblage ou la sélection de produits inhibi- teurs de l'activité TCP.

Ledit extrait brut ou semi-purifié de TCP, catalysant le clivage de la tyrosine de la chaîne polypeptidique principale est susceptible d'tre obtenu par homo- généisation à froid d'un organe sélectionné, suivie de précipitations fractionnées des protéines et d'étapes de séparations successives notamment par adsorption, dialyse et passage sur différentes colonnes de chromatographie.

De manière préférée, ledit organe sélectionné est soumis aux étapes de séparation décrites par TM Martensen (Methods in Cell Biology, 1982,24,265- 269).

L'activité enzymatique de la TCP est mesurée par la disparition de la tyrosine C-terminale présente dans des microtubules, dans lesquels la tyrosine a été préalablement radiomarquée (par exemple,'4C-tyrosine ou 3H-tyrosine, conformément à TM Martensen, précité).

La disparition de la tubuline tyrosine et l'apparition de tubuline détyrosinée peuvent aussi tre quantifiées en immunodosages en utilisant les anticorps spécifiques de chacune de ces formes de tubuline.

La présente invention a, en outre, pour objet un procédé de criblage et de sélection de produits inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, caractérisé en ce qu'il comprend : -la mise en contact de l'inhibiteur potentiel avec une cellule ou un extrait brut ou semi-purifié de TCP, tels que définis ci-dessus et -la mesure de la tubuline-tyr et/ou de la tubuline-glu par tout moyen approprié.

Par exemple, la détection de la tubuline-tyr peut tre effectuée, soit par mesure de l'incorporation de la tyrosine radiomarquée, soit par un immunodosage, en présence d'un anticorps spécifique de la tubuline-tyr ; la détection de la tubuline- glu peut tre effectuée par un immunodosage en présence d'un anticorps spécifique de la tubuline-glu. Les méthodes applicables sont les suivantes : * Méthodes fluorimétriques : . méthode directe : les anticorps spécifiques anti-tubuline-tyr et anti- tubuline-glu sont marqués par un composé fluorescent et mis en contact avec 1'extrait cellulaire ; . méthode indirecte : les anticorps anti-tubuline-tyr et anti-tubuline- glu, non marqués sont appliqués sur 1'extrait cellulaire ; les anticorps marqués dirigés contre les Ig de l'espèce d'où provient l'anticorps spécifique, révèlent sa fixation.

La mesure est de préférence réalisée en immunofluorescence par double-marquage des isotypes tyrosinés et détyrosinés.

* Dosages immuno-enzvmatiques La technique est fondée sur la liaison entre la tubuline-glu ou la tubuline-tyr et un anticorps standard spécifique de ces tubulines. L'antigène ou l'anticorps est lié de façon covalente à une enzyme. L'enzyme, habituellement la peroxydase du raifort, la phosphatase alcaline ou la p-galactosidase, est visualisée par réaction colorée avec le substrat. Plusieurs modalités techniques peuvent tre utilisées : . une technique de compétition peut tre utilisée pour doser la tubuline-tyr et la tubuline-glu. Ce sont les tubuline-tyr et tubuline-glu ou des peptides reproduisant les séquences spécifiques de chacune de ces formes de tubuline, qui sont

toujours fixées sur les microplaques. Un mélange d'extrait cellulaire, et de faibles quantités d'anticorps anti-tubuline-tyr et anti-tubuline-glu est ajouté. La quantité d'anticorps fixée sur la microplaque est d'autant plus faible que les molécules de tubuline-tyr et de tubuline-glu présentes dans l'échantillon à analyser ont neutralisé plus de molécules d'anticorps.

La présente invention a, de plus, pour objet un procédé de criblage et de sélection de produits inhibiteurs de la tubuline-carboxypeptidase, caractérisé en ce qu'il comprend : -la mise en contact de l'inhibiteur potentiel avec un extrait brut ou semi-purifié de TCP, tel que défini ci-dessus, dont la tyrosine a été préalablement radiomarquée, et -la mesure de la tyrosine radiomarquée libre.

La présente invention a, en outre, pour objet l'utilisation d'un inhibi- teur de la tubuline-carboxypeptidase, tel que défini ci-dessus, pour l'obtention d'un médicament anti-cancéreux.

Outre les dispositions qui précèdent, l'invention comprend encore d'autres dispositions, qui ressortiront de la description qui va suivre, qui se référé à des exemples de mise en oeuvre du procédé objet de la présente invention, avec référence aux dessins annexés, dans lesquels : -la figure 1 illustre le cycle tyrosination-détyrosination de la tubu- line ; -la figure 2 illustre les différences de séquences en C-terminal des différentes isoformes de tubuline.

Il doit tre bien entendu, toutefois, que ces exemples sont donnés uniquement à titre d'illustration de l'objet de l'invention, dont ils ne constituent en aucune manière une limitation.

EXEMPLE 1 : Utilisation de cellules normales surproduisant de la tubuline-glu (action du taxol ou de la vinblastine), pour cribler des inhibiteurs de la TCP.

-Préparation des cellules Des cellules HeLa sont cultivées en routine dans un milieu RPMI 1640 supplémenté avec 10 % de sérum de veau foetal.

-Traitement des cellules Le traitement est réalisé à 37°C. Du taxol (5 pM, 10 p1M ou 50 1M) ou de la vinblastine (10 u. M) sont ajoutés au milieu de culture.

-Test : On ajoute un inhibiteur de TCP au milieu de culture (ou on le microinjecte aux cellules) ; on fixe les cellules par incubation dans du méthanol pur, 6 min, à-20°C. Les cellules fixées sont incubées avec des anticorps anti-tubuline-glu (1/500) et des anticorps anti-tubuline-tyr (YL1/2,1/1000), suivie d'une deuxième incubation avec des anticorps de chèvre anti-rat conjugués à de la rhodamine (Jackson) (pour détecter les anticorps anti-tubuline-tyr) et un anticorps de chèvre anti- lapin (Cappel) (1/250) pour détecter les anticorps anti-tubuline-glu.

Les anticorps anti-tubuline-glu sont obtenus selon la procédure décrite dans Gundersen et al. (Cell, 1984,38,779-789). La séquence du peptide utilisé comme immunogène est GEEEGEE (7 résidus d'aminoacides de l'extrémité C- terminale de la tubuline-glu). Ce peptide est conjugué à la KLH et injecté à des lapins.

La spécificité des anticorps obtenus est vérifiée par ELISA conformément à la méthode décrite par Gundersen et al. précité. Les IgG obtenus sont purifiées selon la méthode de McKinney et al. (J. Immunol. Meth., 1987,96,271-278) et leur spécificité vis-à-vis de la tubuline-glu est vérifiée par analyse en western blot.

L'anticorps monoclonal anti-tubuline-tyr YL1/2 reconnaît spécifi- quement le résidu carboxy-terminal de la sous-unité a de la tubuline tyrosine (Wehland J. et al., J. Cell Biol., 1983,97,1467-1475) ; il est obtenu selon la procédure décrite dans Kilmartin J. V. et al., J. Cell Biol., En présence de TCP, on observe une détyrosination et seule la tubuline-glu est détectée, alors que lorsque les cellules sont en présence d'un inhibiteur de TCP, on mesure la tubuline-tyr.

EXEMPLE 2 : Utilisation de cellules normales dans lesquelles la TTL est inhibée.

On microinjecte un anticorps qui inhibe la TTL comme décrit dans J.

Wehland et al., J. Cell Science, 1987,88,185-203.

En l'absence d'inhibiteur, on mesurera essentiellement la tubuline- glu, alors qu'en présence d'un inhibiteur, on pourra mesurer la tubuline-tyr apparue et

vérifier la disparition de la tubuline-glu par double-marquage comme précisé à l'exemple 1.

EXEMPLE 3 : Utilisation de cellules TTL- Les cellules dérivées des cellules NIH/3T3 précitées, sont cultivées sur milieu DME complémenté avec du sérum de veau à 10 % et du sérum de veau foetal à 1 %.

Les sous-clones TTL-sont obtenus par dilution limite, après 3 cycles de croissance.

Ils sont sélectionnés en fonction de l'uniformité de leur phénotype, par double coloration en immunofluorescence, en utilisant un anticorps anti-tubuline- glu, ou un anticorps anti-tubuline A2, en combinaison avec un anticorps anti-tubuline- tyr.

Les sous-clones TTL-sont ceux qui produisent de la tubuline-glu et de la tubuline A2 en abondance.

Dans ces cellules, les microtubules Glu représentent la quasi-totalité des microtubules cytoplasmiques, au lieu de la petite sous-population habituellement observée dans les différents types cellulaires. La tubuline-tyr est peu abondante et est présente de manière diffuse dans les microtubules cytoplasmiques.

En présence d'un inhibiteur de la TCP, on pourra mesurer la tubuline-tyr apparue et vérifier la disparition de la tubuline-glu par double-marquage comme précisé à l'exemple 1.

Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes de mise en oeuvre, de réalisation et d'application qui viennent d'tre décrits de façon plus explicite ; elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en la matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la présente invention.