USO DEL QUITOSANO PARA INCREMENTAR LA ESPORULACION DE

HONGOS

Esta invención se refiere a una composición en base a Ia utilización del quitosano que permite incrementar Ia esporulación de hongos, agentes de control biológico.

Antecedentes de Ia invención

La utilización de organismos naturales, como bacterias, virus y hongos, para el control de plagas y enfermedades, presenta un gran interés. En concreto, los hongos son organismos con gran potencial como agentes de control biológico, ya que tienen una capacidad de reproducción extremadamente alta, un tiempo de generación muy corto, y en ocasiones son muy específicos en su acción, atacando únicamente al huésped con el cual han co-evolucionado. Además, los hongos tienen fases saprofíticas en las cuales pueden sobrevivir sin el huésped, y permanecer en el medio hasta que éste vuelva a aparecer (11 ).

Los hongos nematófagos son un grupo de hongos antagonistas de nematodos (parásitos de plantas y animales) (17) y son, por tanto, buenos candidatos para su uso como agentes de control biológico de nematodos parásitos (30). Además de ello, también tienen Ia capacidad de infectar y colonizar otros organismos, incluyendo otros hongos y raíces de plantas (9).

Pochonia. chlamydosporía es un buen ejemplo de este tipo de hongos, ya que es utilizado como agente de control biológico contra nematodos fitopatógenos (4, 10, 17), especialmentene radiculares, es un buen colonizador de Ia raíz de cereales (14) y diversas hortalizas (2, 3 ) y en

experimentos in vitro es capaz de inhibir el crecimiento de estos hongos patógenos radiculares (5,8,24 ).

Otros hongos nematófagos de especial interés son Paecilomyces lilacinus, Lecanicillium lecanii y Pochonia rubescens, capaces también de inhibir a varios fitopatógenos in vitro (5, 8, 22, 6)

Los hongos entomopatógenos son un grupo de hongos patógenos de insectos con numerosos ejemplos de su eficacia en Ia supresión de plagas de insectos, por Io que presentan gran potencial como agentes de control biológico (7). Los géneros Beauveria, Metarhizium, Lecanicillium, Cordyceps y Paecilomyces son los más importantes para su desarrollo como agentes de control biológico frente a plagas de vegetales.

Por ejemplo, el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana, además de su papel en el control de plagas vegetales, es capaz de colonizar endofíticamente tejidos (6,28,18) y de inhibir, en experimentos in vitro, el crecimiento del hongo fitopatógeno Penicillium vermoesenii.

Por otro lado, el quitosano es, en su mayoría, un polímero de β— 1-4 glucosamina, una forma parcialmente desacetilada de Ia quitina. El quitosano se puede obtener por procesos químicos sometiendo Ia quitina a Ia acción de un medio alcalino muy concentrado, y a temperaturas superiores a 60 ⁰ C. En estas condiciones se produce Ia reacción de desacetilación, que consiste en Ia pérdida del resto acetilo del grupo amido del carbono 2 de Ia N-acetilglucosamina, quedando un grupo amino en esa posición. El quitosano se obtiene de fuentes naturales de quitina, principalmente a partir de caparazones de crustáceos y plumas de calamar, procedentes de las plantas procesadoras de marisco.

Se ha comprobado que el quitosano y sus derivados presentan actividad antimicrobiana frente a diferentes grupos de microorganismos, como

bacterias y hongos. La acción bactericida del quitosano se debe a que desestabiliza las membranas celulares, provocando Ia pérdida del contenido celular (13). Asimismo, existen numerosas evidencias del efecto del quitosano sobre hongos fitopatógenos. En concreto, el quitosano inhibe Ia germinación de las esporas de hongos fitopatógenos (16), afecta a su crecimiento (23, 15, 19, 26), induciendo alteraciones morfológicas (12) y ultraestructurales en las hifas y provoca reducción de Ia producción de toxinas (20).

Descripción de Ia invención

La presente invención permite incrementar Ia esporulación de hongos filamentosos mediante el uso del quitosano. Dichos hongos podrán ser utilizados posteriormente como agentes de control biológico.

Las esporas son el principal mecanismo de inoculación de estos hongos por Io que aumentar Ia esporulación de los hongos agentes de control biológico, permite incrementar Ia producción de inoculo de los hongos para su posterior formulación y aplicación.

El quitosano es un buen inductor de Ia esporulación de hongos agentes de control biológico presentando los hongos crecidos en medio de cultivo con quitosano valores de producción más de 40 veces mayores que en el medio control sin quitosano.

El quitosano aplicado en estos medios de cultivo presenta una serie de ventajas, que aunque comprenden, no se limitan a las siguientes:

• No afecta las características biológicas de los conidios; se ha comprobado experimentalmente que los conidios del hongo entomopatógeno Beauvería bassiana producidos en medio con

quitosano, no muestran diferencia en Ia viabilidad con respecto a los conidios control.

• No afecta a Ia patogenicidad de los conidios; los conidios procedentes de medio con quitosano no muestran cambios en su patogenicidad frente a insectos al compararlos con los conidios control.

Por Io tanto, un primer aspecto de Ia invención se refiere al uso del quitosano para aumentar Ia esporulación de hongos.

Un segundo aspecto de Ia invención se refiere al uso del quitosano para Ia elaboración de un medio de cultivo para incrementar Ia esporulación de hongos.

En una realización preferida los hongos son hongos entomopatógenos u hongos nematófagos. En una realización más preferida, el hongo nematófago se selecciona de Ia lista que comprende, pero no se limita a: Pochonia chlamydosporia, Pochonia rubescens o Paecilomyces lilacinus. En otra realización más preferida el hongo entomopatógeno se selecciona de Ia lista que comprende, pero no se limita a: Beauvería bassiana o Lecanicillium cf. psalliotae.

Otro aspecto de Ia invención se refiere al medio de cultivo para incrementar Ia esporulación de hongos que comprende al menos quitosano. En adelante este medio de cultivo será denominado como medio de cultivo de Ia invención.

En una realización preferida el medio de cultivo de Ia invención presenta una concentración de quitosano de entre 0,1 mg/ml y 2 mg/ml En una realización más preferida el medio de cultivo de Ia invención presenta una concentración de quitosano de entre 0,5 mg/ml y 1 ,5 mg/ml En una

realización aún más preferida el medio de cultivo de Ia invención presenta una concentración de quitosano de 1mg/ml.

Otro aspecto de Ia invención se refiere al método para incrementar Ia esporulación de hongos que comprende Ia selección del hongo, su inoculación al medio de cultivo de Ia invención y Ia incubación de dicho hongo inoculado en el medio de cultivo de Ia invención, en condiciones apropiadas para el crecimiento de hongos.

Otro aspecto de Ia invención se refiere al método para Ia obtención de esporas para su uso como agente de control biológico que comprende Ia selección del hongo, Ia inoculación del hongo seleccionado al medio de cultivo de Ia invención, su incubación en condiciones apropiadas para Ia esporulación y el aislamiento de las esporas producidas en el paso anterior.

A Io largo de Ia descripción y las reivindicaciones, Ia palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en Ia materia, otros objetos, ventajas y características de Ia invención se desprenderán en parte de Ia descripción y en parte de Ia práctica de Ia invención. Los siguientes ejemplos y figuras sirven para ilustrar Ia invención y no deben ser considerados como limitativos del alcance de Ia misma.

Descripción de las figuras

Figura 1 : Se muestra el resultado obtenido en Ia esporulación del hongo entomopatógeno B. bassiana (aislado 119, colonias de 18 días) al añadir concentraciones crecientes de quitosano al medio de cultivo. En Ia gráfica se puede observar que el aumento de Ia concentración de quitosano va acompañado de un aumento de Ia esporulación, alcanzando el valor máximo a Ia concentración de quitosano de 1 mg/ml.

Figura 2: Se refleja el efecto del quitosano aplicado a concentraciones de 2mg/ml en medio CMA (agar extracto de maíz), sobre Ia esporulación de hongos agentes de control biológico.

Figura 3: Esta gráfica muestra el valor de LT50 (tiempo letal medio, tiempo que tarda un organismo patógeno en matar a Ia mitad de Ia población del organismo diana) del hongo entomopatógeno Beauveria bassiana (aislado 119) inoculado en larvas de Gallería mellonella estadios L3-L4. Los tratamientos aplicados a las larvas de G. mellonella son los siguientes:

- B. bassiana 119: Bb119 CMA; se trata de conidios de B. bassiana cepa 119 crecidos en medio de cultivo CMA

- Bb119 CMA+HCI ; se trata de conidios de B. bassiana cepa 119 crecidos en medio de cultivo CMA con HCI

- Bb119 CMA+T8s ; se trata de conidios de B. bassiana cepa 119 crecidos en medio de cultivo CMA con quitosano a 2 mg/ml

- Controles sin B. bassiana 119: Control H ₂ O-T8s; consiste en agua recogida de placas de medio de cultivo CMA con quitosano - Control H ₂ O-HCI ; consiste en agua recogida de placas de medio de cultivo CMA con HCI

- Control H ₂ O ; consiste en agua recogida de placas de medio de cultivo CMA

- Control H ₂ O-SL , consiste en agua recogida de placas de medio de cultivo CMA, sin pasarla por lana de vidrio

- Control SN , se trata de un control en el que no se añade nada a las larvas

EXPOSICIóN DETALLADA DE MODOS DE REALIZACIóN

Los siguientes ejemplos y figuras sirven para respaldar Ia eficacia del uso del quitosano, así como del medio de cultivo de Ia invención, para incrementar Ia esporulación de hongos, manteniendo las características biológicas de los mismos.

Ejemplo 1 : Efecto del quitosano en Ia esporulación.

Se estudió el efecto del quitosano en Ia esporulación de hongos nematófagos y hongos entomopatógenos. Los hongos utilizados fueron los siguientes:

- Pochonia chlamydospoήa (P. c), hongo nematófago, 9 cepas aisladas de distinta procedencia geográfica: P. c.123 (Sevilla, aislado de Heterodea avenae,),

P.C.BK69 (Nueva Zelanda),

P.c.BK132 (Kenia,),

P.C.BK309 (Zimbawe,),

P.C.BK392 (Cuba,), P.c.BK 399 (China,),

P.c. 4624 (Perth, Australia),

P. c.64 (Tarragona, aislado de Meloidogyne sp.,),

P.c75 (Valladolid, aislado de Heterodea schachtü, c).

- Pochonia rubescens, hongo nematófago (Escocia, aislado de Heterodea avenae,).

- Paecilomyces lilacinus, hongo nematófago

Beauvería bassiana, hongo entomopatógeno, 3 cepas aisladas de distinta procedencia geográfica:

B.b119 (Orihuela, Alicante, aislado de coleóptero), B.b193 (Valencia, aislado de Rhynchophorus ferrugineus,),

B.b203 (Elche, Alicante, aislado de Rhynchophorus ferrugineus,).

Lecanicillium cf. psalliotae, hongo entomopatógeno (Elche, Alicante, aislado de Phoenicococcus marlatti,).

El quitosano utilizado fue el denominado T8s, (Marine BioProducts GMBH). Se trata de un quitosano con un peso molecular de 70 KDa, y un grado de desacetilación del 79.6 %.

Para utilizar experimentalmente el quitosano, previamente debe disolverse. Para ello, el quitosano en polvo se disolvió con ácido Clorhídrico 0.25 M y se ajustó el pH a 5.6 con Hidróxido de Sodio 1 M. La disolución de quitosano se sometió a diálisis en agua destilada a 4 ⁰ C, con dos cambios al día, a Io largo de tres días, para eliminar las sales presentes en el quitosano, o formadas al ajustar el pH del HCI a 5.6 con NaOH (2). Tras Ia diálisis se comprobó que el pH del quitosano se mantuvo estable a 5.6. Se utilizó un pH de 5.6 para que el pH no afectase a los hongos. A un pH más básico el quitosano no es soluble y un pH más ácido puede influir en el crecimiento del hongo. Asimismo, el ajuste de pH se realizó con HCI y NaOH debido a que el producto de Ia neutralización, NaCI es muy soluble y se puede eliminar fácilmente por diálisis.

Finalmente, se sometió el quitosano disuelto a esterilización mediante vapor húmedo en autoclave.

El medio de cultivo suplementado con quitosano se realizó preparando el medio de cultivo CMA (agar extracto de maíz, BBL). Se eligió el medio CMA para estudiar el efecto en Ia esporulación debido a que es el medio de cultivo en el que los hongos estudiados muestran mayor esporulación. Una vez esterilizado con vapor húmedo en autoclave (20 minutos a 120 ⁰ C), se añadió el volumen de quitosano necesario para obtener Ia concentración de quitosano deseada. (12). Por último, se dispensó el medio de cultivo en placas Petri de plástico estériles de nueve centímetros

de diámetro. Como control se utilizaron placas conteniendo CMA sin quitosano.

Se realizó un segundo control añadiendo al medio de cultivo ácido Clorhídrico 0.25M con pH 5.6 ajustado con Hidróxido de Sodio, y dializado.

Para este segundo control se usó el mismo volumen de HCI a pH 5.6 que el volumen de quitosano utilizado para preparar Ia mayor concentración de quitosano (2 mg/ml). Este segundo control se realizó para descartar posibles efectos inhibitorios debidos al Cloruro Sódico producido al ajustar el pH del ácido Clorhídrico con el Hidróxido de Sodio.

Las placas con el medio descrito se inocularon en el centro con discos de 5 mm tomados del borde de colonias, de los distintos hongos creciendo activamente, y se incubaron a 25 ⁰ C en oscuridad. Se realizaron tres réplicas por tratamiento.

Cuando las colonias tenían entre 18 y 21 días (próximas a alcanzar el borde de Ia placa) se extrajeron los conidios y se cuantificaron.

Para extraer los conidios se trabajó en una cámara de flujo laminar, con material esterilizado por vapor húmedo en autoclave, y con el instrumental flameado previamente. Se añadió agua destilada estéril sobre Ia placa, se arrastraron los conidios utilizando un asa de vidrio, se recogieron con una micropipeta y se dispusieron en tubos Eppendorf estériles de 1 ,5 mi. La concentración de conidios se calculó utilizando una cámara de Neubauer de 0,025 mm ² de área y 0,1 mm de profundidad. De esta forma se calculó el número de conidios por cm ² .

En Ia figura 1 se puede observar que el aumento de Ia concentración de quitosano va acompañado de un aumento de Ia esporulación del hongo B.

bassiana (aislado 119), alcanzando el valor máximo a Ia concentración de quitosano de 1mg/ml.

Los resultados del efecto del quitosano en Ia esporulación en los hongos agentes de control biológico se resumen en Ia Tabla 1 y Figura 2. Podemos observar que tanto en los hongos nematófagos como en los hongos entomopatógenos hay un claro aumento de Ia esporulación por cm ² . En algunas especies o cepas Ia esporulación llega a incrementarse más de 40 veces respecto al control (S. bassiana, aislado 119).

Hongos Tratamiento Conidios/cm ± DE % conidios/cm ± DE (quitosano respecto a control)

Tabla 1 : Efecto del quitosano a 2mg/ml sobre Ia esporulación de hongos agentes de control biológico en medio CMA.

Ejemplo 2: Viabilidad de los conidios

Se comprobó Ia viabilidad de los conidios procedentes de los hongos creciendo en medio con quitosano según Io descrito en el ejemplo 1 , comparando su germinación respecto a Ia de los conidios procedentes de las placas control (sin quitosano).

Para ello, los conidios se lavaron varias veces por centrifugación a 13500 rpm durante 5 minutos, y resuspensión en agua destilada estéril. De esta forma se eliminan posibles inhibidores de Ia germinación producidos por los propios conidios (21 ). Se ajustó Ia concentración a 10 ⁶ conidios/ml, utilizando agua destilada estéril. Los conidios se dispusieron en portaobjetos con diez pocilios de 6 mm de diámetro (ICN Biomedicals) como se indica a continuación: Se añadieron 25μl de Ia suspensión de conidios por pocilio, con tres réplicas por tratamiento, y dos pocilios por réplica (en total seis pocilios por tratamiento). Los portaobjetos se dispusieron dentro de una placa de petri estéril, sobre un trozo de papel estéril humedecido, formando una cámara húmeda.

Tras 24 horas se contó al microscopio el número de conidios germinados y sin germinar de tres zonas al azar de cada pocilio y se calculó el porcentaje de conidios germinados. Se consideró que los conidios habían germinado

cuando la longitud del tubo germinal media más de Ia mitad del diámetro del conidio (16).

Por último, los conidios se sembraron en placas petri con medio de cultivo rico en nutrientes PDA (Agar dextrosa de patata) utilizando un asa de vidrio. A Io largo de las 72 horas siguientes se cuantificó el número de colonias.

No se observaron diferencias en Ia viabilidad de los conidios producidos en medio suplementado con quitosano respecto a los conidios producidos en medio sin quitosano.

Ejemplo 3: Efecto del quitosano en Ia patogenicidad de los conidios.

Para Ia realización del ensayo de patogenicidad se utilizaron 15 larvas de estadio L3-L4 del lepidóptero Gallería mellonella repartidas en 3 réplicas. Como inoculo se utilizaron los conidios del hongo entomopatógeno Beauvería bassiana (aislado 119) procedentes de placas sin quitosano y placas con quitosano a 2mg/ml, ajustando su concentración a 2-10 ⁶ conidios /mi con agua destilada estéril.

Se pusieron 5 larvas en una placa Petri. A cada una de las larvas se Ie añadió una gota (20 μl) de las suspensiones de 2-10 ⁶ conidios / mi, inoculando 4-10 ⁴ conidios por larva. Se cerraron las placas para evitar fugas de los insectos. Se anotaron cada día, durante 10 días, los individuos muertos de cada uno de los tratamientos.

Como control se utilizaron extractos sin conidios obtenidos de placas de

CMA con Quitosano, CMA con HCI y CMA. Todos estos extractos se prepararon pasando el contenido recogido de cada placa por lana de vidrio.

Se realizó un cuarto control en el que el contenido recogido de una placa de CMA no se pasó por lana de vidrio.

Por último se utilizó un quinto control al que no se añadió nada (insectos sin tratar).

Con todos los datos obtenidos se calculó Ia LT50 (tiempo letal medio, tiempo que tarda un organismo patógeno en matar a Ia mitad de Ia población del organismo diana).

Los resultados de los ensayos de patogenicidad se muestran en Ia Figura 3. No se observaron diferencias en el nivel de patogenicidad frente a G. méllemela entre los conidios procedentes de los distintos tratamientos (hongo crecido en placa de CMA, en placa de CMA con Quitosano o en placa de CMA con HCI), con valores de LT50 entorno a los 6-7 días. Los insectos de los tratamientos control superaron los 10 días de supervivencia, por Io tanto no se pudo calcular Ia LT50.

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