USO DE DERIVADOS DE FENOLES 2,4-DISUBSTITUIDOS COMO INHIBIDORES DE LA EXPRESION DE L-SELECTINAS Y DE LA ISOFORMA INDUCIBLE DE LA SINTASA DEL OXIDO NITRICO La presente invención se refiere al uso en medicina y veterinaria de ciertos derivados de fenoles 2,4- disubstituidos que, debido a una potente actividad como inhibidor de la isoforma inducible de la sintasa del óxido nítrico (iNOS) y como inhibidor de la expresión de la molécula de adhesión L-selectina en la superficie de la membrana plasmática de los leucocitos, resultan de gran utilidad en la preparación de medicamentos para el tratamiento de indicaciones terapéuticas mediadas por la acción de la iNOS, por la acción de la expresión de la L-selectina o por las dos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR La excesiva producción de óxido nítrico (NO) ha sido implicado en la respuesta inmune e inflamatoria. El papel del NO, como mediador fisiológico o como radical citotóxico, viene determinado por las condiciones y cantidad de su síntesis.

El NO es de naturaleza gaseosa y es sintetizado a partir del aminoácido L-arginina gracias a la actuación de una emzima citosólica denominada sintasa del óxido nítrico. Esta enzima pertenece a la familia de las flavoproteínas, tiene cierta homología con las reductasas del citocromo P450 y de ella se han descrito tres diferentes isoformas : la sintasa del óxido nítrico endotelial (eNOS), la sintasa del óxido nítrico neuronal (nNOS) y la sintasa del óxido nítrico inducible (NOS). Tanto eNOS como nNOS son expresadas de forma constitutiva, son dependientes de calcio y

calmodulina e insensibles a los efectos de los glucocorticoides, liberan pequeñas cantidades de NO de forma intermitente por periodos cortos, el NO constitutivo actúa como un mecanismo de transducción de señales en múltiples procesos fisiológicos y está involucrado en el mantenimiento del tono vascular.

Las características bioquímicas de las NOS constitutivas son similares, pero se diferencian en su localización y en la función realizada por el NO producido por ellas. La eNOS está localizada preferentemente en las células endoteliales, plaquetas y mesangiales renales, osteoblastos y osteoclastos y está involucrada en la regulación de la homeostasia vascular y la función plaquetaria. La nNOS es de localización nerviosa, tanto central como periférica, y es productora de un NO que actúa como neurotransmisor central y periférico.

Por el contrario, la iNOS no es expresada bajo condiciones fisiológicas sino que requiere ser inducida. La iNOS no es calcio dependiente y los estímulos inflamatorios de endotoxinas (como el lipopolisacárido) y ciertas citoquinas (interleucina-1, factor de necrosis tumoral (TNF-alpha) o interferon gamma (INF-gamma) ), inducen la formación de NOS en una variedad de células, incluyendo células epiteliales, macrófagos y neutrófilos. La sintasa del óxido nítrico inducible produce cantidades mucho mayores de NO durante largos periodos de tiempo en comparación con las otras isoformas. E1 NO sintetizado por la iNOS desarrolla un papel fundamental en la defensa contra agentes externos como la molécula citotóxica y está involucrado en la vasodilatación en los procesos inflamatorios.

Es conocido por los expertos en la materia que grandes cantidades de NO producido por iNOS presenta funciones antimicrobianas (J. Clin. Invest., 1989,81 : 1129-1136) y antitumorales (Science, 1987,235 : 473-476). El NO está involucrado en la eliminación de parásitos, bacterias, células tumorales y virus. La alta concentración de NO sintetizado por iNOS explica los efectos citotóxicos y citostáticos de este enzima. Por lo tanto, el iNOS desempeña un importante papel en la respuesta inmune.

Altas concentraciones de NO debido a una crónica, inapropiada o excesiva expresión de iNOS ha sido implicado en el daño tisular e inflamación, especialmente en ciertas enfermedades autoinmunes. El iNOS encontrado en macrófagos, monocitos, etc., produce cantidades micromolares de NO el cual contribuye al daño tisular de forma local y a la hipertensión sistémica la cual acompaña al shock séptico y otros procesos inflamatorios. Del mismo modo, la interacción del NO con el metabolismo del hierro, tiene como efecto adverso el desarrollo de una enfermedad crónica, debido a la inhibición de la ALA sintasa y al secuestro de hierro que inducen a una inhibición tanto de la síntesis de hem como de la eritropoyesis. También puede ser responsable directo de alguno de los cuadros patológicos de la malaria grave, ya que la hiperproducción de NO que se da en el curso de la malaria grave, alteraría la función sináptica e induciría áreas locales de hipoglucemia y acidosis. Del mismo modo, puede estar linvolucrado en la inmunodeficiencia asociada a la malaria.

De acuerdo con esto, estados adicionales en los que existe una ventaja de inhibir la producción de NO a

partir de L-arginina, mediante la inhibición de la expresión de la iNOS, incluyen estados autoinmunes y/o inflamatorios articulares y musculoesqueléticos, enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal, isquemia cardiovascular, diabetes, hiperalgesia, isquemia cerebral, hipotensión sistémica asociada con el choque séptico y/o tóxico inducido por una amplia variedad de agentes, terapia de citoquinas, como adyuvante para la inmunosupresión a corto plazo en terapia de transplantes, así como trastornos del SNC mediados por NO.

La inflamación es la respuesta de los tejidos vascularizados frente a las agresiones. El principal objetivo de la inflamación es localizar y erradicar la irritación y reparar el tejido circundante. La respuesta inflamatoria implica 3 importantes etapas : dilatación de los capilares para incrementar el flujo sanguíneo, cambios estructurales microvasculares y liberación de proteínas plasmáticas del torrente sanguíneo, y en tercer lugar la transmigración leucocitaria a través del endotelio y acumulación en la zona dañada. En su regulación se encuentran implicados diferentes factores humorales, como las prostaglandinas, aminas vasoactivas, citoquinas, etc., pero en las dos últimas décadas se ha podido constatar que ciertas moléculas de membrana citoplasmática presentes tanto en leucocitos como en células endoteliales desempeñas un papel importante en la regulación de la infiltración leucocitaria de los tejidos inflamados y, por lo tanto, en el desarrollo y mantenimiento de la respuesta inflamatoria.

La cascada de adhesión de leucocitos es una secuencia de eventos de adhesión y activación que finaliza con la

extravasación del leucocito. Al menos 5 pasos parecen ser necesarios para el reclutamiento efectivo de leucocitos : captura, rotación, rotación lenta, adhesión firme y transmigración. El bloqueo de cualquiera de estos pasos puede reducir de forma significativa la acumulación de leucocitos en el tejido.

El reclutamiento de leucocitos a los focos de inflamación está dirigido por una serie de moléculas de adhesión presentes tanto en la superficie de la membrena plasmática de los propios leucocitos, como en las células endoteliales de los capilares y vénulas de tejidos inflamados. Las moléculas de adhesión implicadas en la respuesta inflamatoria pertenecen principalmente a 3 grandes familias : selectinas, integrinas y la superfamilia de inmunoglobulinas.

Señales específicas producidas en respuesta a la herida e infección, controlan la expresión y activación de ciertas moléculas de adhesión. Las interacciones y respuestas entonces iniciadas por la unión de estas moléculas de adhesión a sus receptores/ligandos juegan un papel importante en la mediación de las reacciones inflamatoria e inmune que constituyen una línea de la defensa del cuerpo contra estos ataques.

Los miembros de la familia de selectinas están involucradas en la interacción inicial entre los leucocitos que se encuentran en el torrente sanguíneo, y las células endoteliales activadas en los focos de inflamación. Las selectinas son glicoproteínas caracterizadas por contener una región amino terminal con homología estructural a lectinas calcio dependientes (LC), seguida de otra estructura similar al factor de crecimiento epidérmico (EGF); de 2 a 9

regiones tipo proteína reguladora del complemento (SCR); una zona transmembrana; y una región citoplasmática.

La L-selectina se expresa de forma constitutiva en neutrófilos, monocitos, linfocitos T y B vírgenes y en una subpoblación de células K. Esta molécula de adhesión contribuye en gran medida a la captura de leucocitos durante las primeras etapas de la cascada de adhesión, demostrándose su implicación en dicho reclutamiento de leucocitos a focos de inflamación.

Después de la captura, la L-selectina es eliminada de la superficie de los leucocitos, y liberada al medio, en respuesta a diferentes estímulos activadores, como citoquinas, ionóforo de calcio, ésteres de forbol, etc.

Este mecanismo de regulación de su expresión es compartido con otras moléculas de adhesión o receptores de citoquinas.

La región tipo lectina de la L-selectina participa en el reconocimiento de los ligandos; estos dominios unen la L-selectina a los ligandos mediante una interacción dependiente de calcio de la región amino terminal tipo lectina de la L-selectina con carbohidratos complejos (sialilados, sulfatados y/o fucosilados) presentes en diferentes glicoproteinas de las células endoteliales.

Las células NK son linfocitos del sistema inmune innato que reconocen e inducen la lisis de una variedad de células, incluyendo células infectadas por virus, células tumorales, y células alogénicas sin sensibilización previa. Además, las células NK elaboran una variedad de citoquinas como interferon-gamma, factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alpha), IL-lß, IL- 10 y también producen quimioquinas como RANTES,

proteína inflamatoria del macrófago la y proteína inflamatoria del macrófago lp, las cuales están involucradas en la eliminación de patógenos intracelulares in vivo, así como en la generación de respuesta inmune antígeno-específica.

La diferenciación de las células NK está acompañada por la expresión en la superficie celular de una glicoproteína (PEN5), la cual es una modificación post-translacional del ligando de la selectina P (PSGL- 1). El epítopo PEN5 crea sobre PSGL-1 un único sitio de unión para la L-selectina. La selectividad de la expresión de PEN5 en las células NK, y su ausencia en linfocitos T y B antígeno-específicos, sugiere que las específicas funciones de las células NK dependen de la adquisición de este ligando para L-selectina. Por lo tanto, el control de interacciones de las células NK vía PEN5 puede tener importantes implicaciones para la inducción y mantenimiento de la inmunidad a enfermedades tumorales e infecciosas, así como amplificando la respuesta inmune a un estímulo inflamatorio.

La presente invención proporciona un grupo de productos derivados de fenoles 2,4-disubstituidos, conocidos químicamente en la literatura. De estos fenoles 2,4- disubstituidos nunca se había descrito antes su actividad inhibitoria de la isoforma inducible de la sintasa del óxido nítrico, ni de su capacidad de inhibición de la expresión de la molécula de adhesión L-selectina en la superficie de la membrana plasmática de los leucocitos.

La patente ES2087019 menciona la actividad inhibitoria de la 5-lipoxigenasa (5-LO) de los productos incluidos

en la presente invención, pero en ningún momento se menciona la posibilidad de que dichos productos puedan presentar actividad inhibitoria de la isoforma inducible de la sintasa del óxido nítrico, ni de su capacidad de inhibición de la expresión de la molécula de adhesión L-selectina en la superficie de la membrana plasmática de los leucocitos.

En la solicitud de patente EP147892 se menciona cierta actividad analgésica y antiinflamatoria de un producto incluido en la presente invención, pero dicha actividad analgésica y antiinflamatoria podría deberse a alguna actividad inhibitoria de la cicloxigenasa, puesto que los ensayos comparativos descritos se realizaron frente a típicos inhibidores de dicho enzima.

Por lo tanto, nada en el conocimiento técnico general, enseña o hace obvio que los productos incluidos entre los derivados de la presente invención, puedan presentar actividad inhibitoria de la isoforma inducible de la sintasa del óxido nítrico, ni de su capacidad de inhibición de la expresión de la molécula de adhesión L-selectina en la superficie de la membrana plasmática de los leucocitos, enseñanza ésta que es parte integrante de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Es objeto de la presente invención el uso de un derivado de fenol 2, 4-disubstituido de fórmula (I),

donde : R2 es (Cl-C4)-alquilo, (Cl-C4)-acilo, CF3, Cl, Br o I ; R3 es H, (Cl-C4)-alquilo, (Cl-C4)-acilo, (C1-C4)- alcoxilo, CF3, F, Cl, Br, fenilo, OH, SH, NHz o amino mono-o disubstituido por (C1-C3)-alquilo ; R4 es (Cl-C4)-alquilo, (Cl-C4)-acilo, CF3, F, C1, Br, I, carboxilo, (C1-C4)-alcoxicarboxilo, ciano, nitro o fenilo; y R6 es H, (Cl-C4)-alquilo, (C1-C4)-acilo, CF3, Cl, Br o I ; o de las sales o solvatos farmacéuticamente aceptables de dicho derivado, en la preparación de un medicamento inhibidor de la isoforma inducible de la sintasa del óxido nítrico e inhibidor de la expresión de la molécula de adhesión L-selectina en la superficie de la membrana plasmática de los leucocitos.

Son preferidos aquéllos en los que : R2 es (Cl-C4)- alquilo, CF3, C1, Br o I; R3 es H, (Cl-C4)-alquilo, CF3, F, Cl, Br, fenilo, OH, SH, NH2 o dimetilamino; R4 es (Cl-C4)-alquilo, CF3, F, C1, Br, I, carboxilo, ciano, nitro o fenilo; y R6 es H, (Cl-C4)-alquilo, CF3, Cl, Br o I.

En una realización particular de la presente invención, R2 es I; R3 es H, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, F, Cl, Br, fenilo o OH; R4 es metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, F, Cl, Br, I, carboxilo o fenilo; y R6 es H, isopropilo, terbutilo, CF3, C1, Br o I. Siendo preferidos aquéllos en los que : R3 es H, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, Cl, Br o fenilo; R4 es isopropilo, terbutilo, CF3, Br, I, carboxilo o fenilo; y R6 es H, isopropilo, terbutilo, CF3 o I. Aún se prefiere más aquellos en los que : R3 es H; R4 es terbutilo, CF3, I o fenilo; y R6 es terbutilo, CF3 o I. Todavía se prefiere más aquél en el que R4 y R6 son I.

En otra realización particular de la presente invención, se usa un derivado de fenol 2,4- disubstituido de fórmula (I) donde : R2 es CF3 o Br; R3 es H, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, F, Cl, Br, fenilo o OH; R4 es metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, F, Cl, Br, I, carboxilo o fenilo; y R6 es H, isopropilo, terbutilo, CF3, Cl, Br o I. De entre estos, se prefiere usar aquéllos en los que : R3 es H, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, C1, Br o fenilo; R4 es isopropilo, terbutilo, CF3, Br, I, carboxilo o fenilo; y R6 es H, isopropilo, terbutilo, CF3 o I. Y todavía se prefiere más aquellos en los que : R3 es H; R4 es terbutilo, CF3, I o fenilo; y R6 es terbutilo, CF3 o I.

En otra realización particular de la presente invención, se usa un derivado de fenol 2,4- disubstituido de fórmula (I) donde : R2 es isopropilo o terbutilo; R3 es H, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, F, C1, Br, fenilo o OH; R4 es metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, F, C1, Br, I,

carboxilo o fenilo; y R6 es H, isopropilo, terbutilo, CF3, Cl, Br o I. De entre los anteriores se prefiere usar aquéllos en los que : R3 es H, metilo, etilo, isopropilo, terbutilo, CF3, Cl, Br o fenilo; R4 es isopropilo, terbutilo, CF3, Br, I, carboxilo o fenilo; y R6 es H, isopropilo, terbutilo, CF3 o I. Y todavía se prefiere usar más aquél los en los que : R3 es H; R4 es terbutilo, CF3, I o fenilo; y R6 es terbutilo, CF3 o I.

En particular, son especialmente útiles los productos de la Tabla 1 adjunta, donde se indican los códigos internos (códigos de la compañía), los nombres químicos y los número de registro (RN = registry number) de Chemical Abstracts Service (CAS) o mediante la mención del volúmen y número de abstracts donde se han publicado en la revista Chemical Abstracts (CA) o el número de patente donde se describen por primera vez, de algunos de los derivados de fenoles 2,4- disubstituidos de fórmula (I) que han sido preparados a modo de ejemplo. Tabla 1 Derivados de fenoles 2,4-disubstituidos

Cód. Int. Nombre químico RN/Ref. CA/Pat.

Bobel-1 4-fluoro-2-yodofenol [2713-29-3] Bobel-2 4-terbutil-2-yodofenol [38941-98-9] Bobel-3 2-terbutil-4-yodofenol [60803-25-0] Bobel-4 2,6-diisopropil-4-yodofenol ES2087019 Bobel-5 2,4-diyodofenol CA 24 : 5289 Bobel-6 2-metil-4,6-diyodofenol [4186-52-1] Bobel-7 2-etil-4, 6-diyodofenol ES2087019 Bobel-8 2-isopropil-4,6-diyodofenol [127502-66-3] Bobel-9 2-terbutil-4,6-diyodofenol [60803-26-1] Bobel-10 2-cloro-4,6-diyodofenol [15459-49-1] Bobel-11 2-bromo-4,6-diyodofenol [89466-01-3] Bobel-12 2-trifluorometil-4, 6-diyodofenol [61494-84-6] Bobel-13 4-metil-2,6-diyodofenol [2432-18-0] Bobel-14 4-isopropil-2,6-diyodofenol [2432-19-1] Bobel-15 4-terbutil-2,6-diyodofenol [75908-75-7] Bobel-16 4-fenil-2,6-diyodofenol CA 55 : 5845d Bobel-17 4-fluoro-2,6-diyodofenol [392-72-3] Bobel-18 4-cloro-2,6-diyodofenol [15459-50-4] Bobel-19 4-brom-2, 6-diyodofenol [15459-51-5] Bobel-20 4-trifluorometil-2, 6-diyodofenol ES2087019 Bobel-21 3-trifluorometil-2,6-diyodofenol ES2087019 Bobel-22 4-nitro-2,6-diyodofenol [305-85-1] Bobel-23 3-terbutil-2,4-diyodofenol ES2087019 Bobel-24 2,4, 6-triyodofenol [609-23-4] Bobel-25 3-metil-2,4-6-triyodofenol [2109-12-8] Tabla 1 (Continuación)

Cód. Int. Nombre químico RN/Ref. CA/Pat Bobel-26 3-etil-2,4, 6-triyodofenol [124311-20-2] Bobel-27 3-isopropil-2,4-6-triyodofenol ES2087019 Bobel-28 3-fenil-2,4, 6-triyodofenol [91353-81-0] Bobel-29 3-fluoro-2,4, 6-triyodofenol [444-07-5] Bobel-30 3-cloro-2,4, 6-triyodofenol [89465-75-8] Bobel-31 3-bromo-2,4, 6-triyodofenol [124311-19-9] Bobel-32 3-trifluorometil-2,4, 6- triyodofenol ES2087019 Bobel-33 3-hidroxi-2,4, 6-triyodofenol [19403-92-0] Bobel-34 4-hidroxi-3,5-diyodobenzonitrilo [1689-83-4] Bobel-35 2,4, 6-triterbutilfenol [732-26-3] Bobel-36 ácido 4-hidroxi-3,5- diyodobenzoico [618-76-8] Algunos de los productos de fórmula (I) presentan estereoisómeros. El uso de éstos isómeros, por separado o mezclados, como inhibidores de la isoforma inducible de la sintasa del óxido nítrico e inhibidores de la expresión de la molécula de adhesión L-selectina en la superficie de la membrana plasmática de los leucocitos, también es objeto de la presente invención.

Como inhibidores de la isoforma inducible de la sintasa del óxido nítrico e inhibidores de la expresión de la molécula de adhesión L-selectina en la superficie de la membrana plasmática de los leucocitos, los productos de fórmula (I) o sus sales o solvatos farmacéuticamente aceptables, son útiles en la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades mediadas por la acción de la isoforma inducible de lasintasa del óxido nítrico, por la acción de la

expresión de la L-selectina o por las dos, con las preferencias señaladas anteriormente.

Los derivados de fenoles 2,4-disubstituidos o sus sales farmacéuticamente aceptables, cuyo uso es objeto de la presente invención, convenientemente asociados a aditivos o excipientes conocidos, pueden administrarse por vía oral, parenteral o tópica, en forma de inyectables, comprimidos, grageas, jarabes, lociones, champúes, pomadas, supositorios, colirios, etc.

EJEMPLOS La presente invención se ilustra mediante los siguientes ejemplos no limitativos.

Ejemplo 1. Efecto sobre la actividad de la sintasa del óxido nítrico (NOS) en un modelo de colitis ulcerosa inducida por TNB en rata.

Mediante el presente ejemplo se pretendió demostrar la posible actividad inhibitoria del BOBEL-24 sobre la sintasa del óxido nítrico en un modelo de colitis ulcerosa inducida por ácido sulfónico de trinitrobenzeno (TNB) en la rata.

Se emplearon ratas Wistar macho, las cuales fueron anestesiadas y se les indujo una inflamación crónica del colon mediante la aplicación de una única dosis intracolónica de ácido sulfónico de trinitrobenzeno (TNB, 80mg kg-1, disuelto en etanol 30% y administrado en un volumen de lml kg-1).

A los animales se les administraron diferentes drogas antiiflamatorias, 24 horas tras la administración de TNB. Las drogas antiinflamatorias que se emplearon

fueron : prednisolona (0.5mg kg-1), L-NAME (30mg kg-1) y 2,4, 6-triyodofenol (BOBEL-24, 1-25mg kg-1), administrándose oralmente durante 3 días consecutivos.

La medición de la actividad de la sintasa del óxido nítrico en el tejido colónico se llevó a cabo mediante el ensayo de la citrulina, en le que se mide la conversión de L- [14C]-argenina monohidroclorhídrica a <BR> <BR> [14C] -citrulina, según el método descrito por Knowles et al. (Biochem. Biophys. Res. Commun., 1990, v. 172, 1042-1048).

Se obtuvieron muestras de tejido colónico a las 24 horas tras la administración de TNB y a los 2,3 y 4 días tras la administración de TNB. Estos tejidos se homogeneizaron en una solución tampón con HEPES, sucrosa, DL-dithiothreitol, leupeptina, inhibidor de tripsina de soja y aprotinina. Tras centrifugar los homogenizados, se añadió una muestra del sobrenadante a un tubo que contenía 100lit de solución tampón de incubación precalentado a 37 °C que a su vez contenía fosfato de potasio, L-valina, NADPH, MgCl2 y CaCl2, L- argenina y L- [14C]-monohidriclorídrica y fue incubado durante lOmin a 37 °C. La reacción se terminó mediante la adición de 500lut1 de una mezcla de H20 : Dowex-AG50W.

La mezcla de resina y solución incubada de la muestra se dispersó y se diluyó mediante la adición de 860ut de agua destilada. Tras la precipitación de la resina se sustrayeron 9751 de sobrenadante para contar en un contador líquido de centelleo (2ml de líquido EcoScint H; Packard).

En la Figura 1 se muestra el efecto del tratamiento con BOBEL-24, prednisolona y L-NAME una vez al día durante un periodo de 3 días, sobre el daño colónico inducido

tras una sola inyección de ácido sulfónico de trinitrobenzeno (TNB; 80 mg kg-1 administrado en el día 0), los resultados muestran la puntuación del daño en función del tiempo transcurrido tras la administración de TNB. Encontramos que BOBEL-24 inhibió el daño inducido por TNB en un 4614% a los tres días tras la administración de TNB en dosis de lOmg kg-1, mientras que prednisolona y L-NAME no tuvieron ningún efecto significativo sobre el daño inducido por TNB en ninguno de los tiempos estudiados.

La formación de L-citrulina que se puede inhibir mediante la incubación in vitro con L-NMMA se toma como índice de actividad de NOS, expresada como nmol min-lg-1 de tejido. Mediante incubación con EGTA, se determinó la dependencia de la actividad enzimática de la presencia de calcio, siendo la actividad que depende de la presencia del calcio bajo condiciones de control la considerada como NOS constitutiva (cNOS), mientras que la que no es inhibida por EGTA se toma como la forma inducible e independiente del calcio de NOS (iNOS).

En la figura 2 se puede observar el efecto del tratamiento con BOBEL-24 sobre la inhibición en el incremento en la actividad total de NOS. Encontrándose una inhibición del 687% de la actividad de NOS.

En la figura 3 se puede observar el efecto que el tratamiento con BOBEL-24 produjo sobre la actividad de NOS independiente del calcio (iNOS), la cual se pudo observar a los 2 y 4 días tras la administración de TNB. La inhibición de la actividad de iNOS fue de un 8211% y de un 4514% a los 2 y 4 días tras la administración de TNB respectivamente.

Ejemplo 2. Estudio del efecto sobre la actividad de los leucocitos polimorfonucleares in vivo en la rata mediante microscopía intravital.

El objetivo del estudio era determinar si la sustancia BOBEL-24, posee algún efecto sobre la actividad (velocidad de"rolling", adherencia) de los leucocitos polimorfonucleares activados in vivo en la rata, utilizando la circulación mesentérica como modelo y la técnica de microscopía intravital.

Tras la inducción de anestesia general conpentotal sódico (60mg kg-1, i. p.), se procedió a la exteriorización de un segmento de la porción ileo-cecal del mesenterio para su observación en el microscopio intravital. El resto del intestino que queda expuesto tras esta operación es cubierto con una gasa mojada en solución fisológica para prevenir la evaporación.

Una vez transcurrido un periodo de 30 minutos de estabilización tras la preparación del mesenterio, se seleccionaron vénulas mesentéricas sin ramificaciones de 25-40pm de diámetro, y sus arteriolas asociadas (15- 25pm) para su estudio.

La activación de los leucocitos polimorfonucleares se realizó mediante la administración de una dosis de 3mg kg-1 i. v. de endotoxina (LPS E. Coli 0.111 : B4) a los animales una vez han sido anestesiados y preparados para la observación intravital. Para determinar el efecto de las sustancias de ensayo y referencia sobre la activación de los leucocitos, éstas se administraron oralmente como un pre-tratamiento lh antes de la administración de la endotoxina.

La administración de la endotoxina resultó en un incremento en el número de neutrófilos adherentes determinado en una sección de 100pm de vénula a lo largo de un periodo de observación de 1 hora.

La administración de una dosis intravenosa de endotoxina resultó en una reducción de la velocidad del "rolling"de los neutrófilos en las vénulas post- capilares del mesenterio de la rata.

La administración oral de 3 dosis crecientes de 2,4, 6- triyodofenol (BOBEL-24), 1 hora antes de la administración de endotoxina resultó en una reducción, relacionada con la dosis administrada, en el aumento de la adherencia de neutrófilos inducido por la endotoxina en las vénulas post-capilares del mesenterio de la rata (ver Figura 4).

Del mismo modo, el pre-tratamiento con BOBEL-24 también resultó en una inhibición de la reducción del"rolling" de los neutrófilos inducida por la endotoxina, observándose un incremento en la velocidad de"rolling" que está relacionado con la dosis de BOBEL-24 administrada (ver Figura 5).