L'invention conceme l'utilisation d'une protéine de membrane OmpA d'entérobactérie, notamment la protéine P40 de Klebsiella pneumoniae, associée à un peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial (VRS) pour la préparation d'une composition pharmaceutique administrable par voie nasale destinée à induire une réponse immunitaire protectrice de la voie respiratoire supérieure et de la voie inférieure (poumons) d'un sujet contre l'infection par le VRS. L'invention comprend l'utilisation de ces composés pour la préparation de vaccin destiné à la prévention et le traitement d'infection par le VRS.

Le VRS est la cause la plus fréquente d'hospitalisation des nourrissons de moins d'un an pour les infections respiratoires aiguës. Les enfants atteints de laryngo- trachéo-bronchites, bronchiolites et pneumonies nécessitent des soins hospitaliers et chez les nourrissons présentant des maladies cardiaques congénitales, le taux de mortalité est supérieur à 37 %. D'autres troubles comme les dysplasies broncho- pulmonaires, les maladies rénales et l'immunodéficience sont autant de facteurs responsables de mortalités élevées. Les infections au VRS peuvent également tre une cause de mortalité chez les personnes âgées.

Dans les pays tempérés, l'épidémie du VRS se manifeste pendant la période hivemale de novembre à avril et la plus grande incidence de sérieuses maladies survient chez les nourrissons de 2 à 6 mois. On distingue deux types de VRS : VRS-A et VRS-B par la variation antigénique de la glycoprotéine G du VRS : sous-groupe A et sous-groupe B, qui circulent concurremment. Une étude récente en France de 1982 à 1990 a montré une altemance d'un sous-groupe à l'autre sur une période de 5 ans. La souche A est souvent la cause des atteintes d'infections plus graves que la souche B.

Le VRS humain appartient au genre pneumovirus, membre de la famille des Paramyxoviridae. Le génome du virus est constitué d'un brin d'ARN à polarité négative, non segmenté, codant pour 10 protéines distinctes : NS1, NS2, N ; P, M, SH (ou IA), G, F, M2 (ou 22K) et L (Murphy et al., Virus Res. 32 : 13-36,1994).

De nombreuses expériences publiées ont démontré que les protéines majeures impliquées dans la protection sont : F, G, et N. La glycoprotéine de fusion F

synthétisée comme précurseur FO est scindée en deux sous-unités F1 (48 kDa) et F2 (20 kDa) reliées par des ponts disulfures. La protéine F est conservée entre le VRS-A et le VRS-B (91 % homologie). A l'inverse, la glycoprotéine d'attachement G est très variable d'un sous-groupe à l'autre. Seulement une région de 13 acides aminés (aa164-aa176) est hautement conservée et en particulier la position de quatre résidus cystéines (173,176,182 et 186) est maintenue constante chez tous les VRS humains et bovins. II a été démontré sur les modèles animaux que les deux glycoprotéines F et G jouent un rôle majeur dans la protection contre le VRS. Les anticorps monoclonaux dirigés contre G et F sont capables de neutraliser le virus in vitro et passivement administrés, ils protègent le rat des cotonniers contre l'infection par le VRS. Dans les années 60, la tentative de mise au point de vaccins classiques, c'est-à-dire le VRS inactivé par le formol, analogue à des vaccins antirougeole et antirougeoleux, a échoué. Au lieu de conférer une protection chez l'enfant vacciné, ce type de vaccin a eu pour effet de potentialiser la maladie virale naturelle.

Les traitements actuels contre l'aggravation de la maladie due au VRS chez le nourrisson sont les dégagements de l'encombrement des voies respiratoires par aspiration de mucosités et l'assistance respiratoire par ventilation. Un antiviral, la Ribavirine semble tre efficace dans les cas gravement atteints. Cependant, son utilisation dans la thérapie pédiatrique est encore mal définie. L'immunisation passive avec des immunoglobulines anti-VRS est une voie alternative dans les traitements des infections graves au VRS : aucun effet secondaire indésirable n'a été observé.

Néanmoins, ce type de traitement est très coûteux et difficilement extrapolable à grande échelle.

Les différentes approches de vaccination contre le VRS humain ont été entreprises : soit te vaccin protège contre l'infection du VRS chez I'animal (rongeurs, primates) mais induit une pathologie pulmonaire, soit le vaccin n'est pas assez immunogénique et ne protège pas (Connors et al., Vaccine 10 : 475-484,1992). A t'état actuel, les vaccins sous-unitaires administrés par voie injectable ne peuvent conférer une protection efficace que dans les poumons et non pour la sphère ORL. On peut citer notamment la demande intemationale PCT de brevet publiée sous le numéro WO 96/14415 qui décrit un vaccin anti-VRS administrable par voie sous-cutanée comprenant un fragment de la protéine G du VRS couplée à la protéine P40 de la membrane exteme de Klebsiella pneumoniae ainsi que la demande intemationale PCT de brevet publiée sous le numéro WO 96/14416 qui décrit un vaccin anti-VRS

administrable par voie intrapéritonéale comprenant un fragment de la protéine G du VRS couplée à la protéine BB de la protéine G de Streptococcus.

Seuls les vaccins vivants à VRS atténués administrés par la voie nasale peuvent conférer la protection de la sphère ORL. Cependant, cette approche est hasardeuse due à un éventuel risque de révertance de la souche atténuée.

Ainsi, il reste aujourd'hui un grand besoin de disposer d'un vaccin administrable par voie nasale permettant d'induire une réponse protectrice contre le VRS humain dans les poumons et dans la sphère ORL.

Ceci est justement l'objet de la présente invention.

Ainsi, la présente invention est relative à l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, associée à un peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial (VRS) pour la préparation d'une composition pharmaceutique administrable par voie nasale destinée à induire une réponse immunitaire protectrice de la voie respiratoire supérieure eVou de la voie inférieure (poumons) d'un sujet contre l'infection par le VRS.

De préférence, ladite réponse immunitaire induite selon l'invention protège à la fois la voie respiratoire supérieure et la voie inférieure (poumons) d'un sujet contre l'infection par le VRS.

Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « protéine » également les peptides ou les polypeptides et par le terme « OmpA)) (pour « Outer Membrane Protein »), les protéines de la membrane exteme de type A.

Par fragment d'une protéine OmpA, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine OmpA qui, lorsqu'il est associé à un peptide immunogène du VRS, en présence éventuellement d'un adjuvant de l'immunité, est capable de générer ou accroître une réponse immune de type anticorps dirigée contre ledit peptide immunogène, ledit fragment de la protéine OmpA comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 15 acides aminés consécutifs ou de manière plus préférée au moins 20 acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA.

Par « peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial », on entend désigner en particulier tout peptide dont la séquence d'acides aminés comprend au moins 5 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 10 ou 15 acides aminés consécutifs de la séquence d'une protéine exprimée par le VRS, ledit peptide comportant dans sa séquence un déterminant antigénique ou épitope capable d'induire

une réponse immune de type anticorps (lymphocytes B dépendant) dirigée contre ledit épitope « B », notamment en présence de ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, dans un organisme préalablement immunisé avec ledit peptide immunogène.

De préférence, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite entérobactérie est Klebsiella pneumoniae.

L'invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la séquence d'acides aminés de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, comprend : a) la séquence d'acides aminés de séquence SEQ ID N° 2 ; b) la séquence d'acides aminés d'une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 97 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 2 ; ou c) la séquence d'acides aminés d'un fragment d'au moins 10 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID N° 2.

Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fentre de comparaison)) pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut tre réalisé, outre manuellement, au moyen de I'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) [Ad. App. Math. 2 : 482], au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) [J. Mol. Biol. 48 : 443], au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444], au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nuciéique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par « fentre de comparaison » dans laquelle la région de la séquence

d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calcule en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fentre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie.

Les procédés d'extraction de protéines de membranes bactériennes sont connus de I'homme de fart et ne seront pas développés dans la présente description.

On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J. H. et al. (Eur. J. Biochem, 255,446-454,1998).

Dans un autre mode de réalisation préféré, l'invention comprend également l'utilisation d'une protéine OmpA d'entérobactérie ou d'un de ses fragments selon l'invention, caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, ou ledit peptide immunogène est obtenue par voie recombinante.

Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui bien connues de I'homme de fart et ne seront pas développées dans la présente description, on pourra néanmoins se référer à la méthode décrite dans les exemples.

Parmi les cellules utilisables pour la production de ces protéines recombinantes, il faut citer bien entendu les cellules bactériennes (Olins P. O. et Lee S. C., 1993, Recent advances in heterologous gene expression in E. coli. Curr. Op. Biotechnology 4 : 520- 525), mais également les cellules de levure (Buckholz R. G., 1993, Yeast Systems for the Expression of Heterologous Gene Products. Curr. Op. Biotechnology 4 : 538-542), de mme que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifère (Edwards C. P. et Aruffo A., 1993, Current applications of COS cell based transient expression systems. Curr. Op. Biotechnology 4 : 558-563) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V. A., 1993, Baculovirus systems for the expression of human gene products. Curr. Op. Biotechnology 4 : 564-572).

En particulier, I'invention est relative à l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est choisi parmi les peptides dérivés de la protéine G, F, M2 ou N du VRS, de préférence la protéine G.

Dans un mode de réalisation préféré de la présente invention, ledit peptide immunogène est un fragment de la protéine G comprenant un épitope de type B.

Par « épitope de type B » compris dans un fragment de la protéine G du VRS, on entend désigner en particulier une séquence d'acides aminés d'au moins 5,10 ou 15 acides aminés consécutifs d'un fragment de la protéine G capable d'induire une réponse immune de type anticorps (lymphocytes B dépendant) dirigée contre ladite séquence d'acides aminés, notamment en présence de la protéine OmpA P40 de séquence SEQ ID N° 1.

Dans un mode de réalisation particulièrement préféré de la présente invention, ledit peptide immunogène est choisi parmi les peptides de séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9 ou SEQ ID N° 11, ou de séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 97 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ SEQIDN°9ouSEQIDN°11.

La présente invention a aussi pour objet l'utilisation seion l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est couplé ou mélangé avec ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments.

Sous un autre aspect, I'invention est relative à l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, et/ou une construction nucléique codant pour ledit peptide immunogène, ladite construction nucléique étant contenue dans un vecteur d'expression ou dans une cellule hôte transformée capable d'exprimer ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, et/ou ledit peptide immunogène.

L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide immunogène est couple par liaison covalente, notamment par couplage chimique, avec ladite protéine OmpA ou l'un de ses fragments, pour former une protéine hybride.

Dans un mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit peptide immunogène pour

faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.

Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit peptide immunogène. Le couplage covalent entre la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, et ledit peptide immunogène selon l'invention peut tre réalisé à l'extrémité N-ou C-terminale de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de l'extrémité de la protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, choisie pour effectuer le couplage et de la nature dudit peptide immunogène à coupler.

Dans un autre mode de réalisation particulier, I'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que la protéine hybride formée par couplage covalent entre ledit peptide immunogène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, est une protéine de fusion exprimée par une cellule transformée avec une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride.

Les protéines hybrides issues de couplage covalent entre ledit peptide immunogène et ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, peuvent tre préparées par recombinaison génétique. La protéine hybride ou chimérique peut tre produite par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, d'une séquence codant pour ledit peptide immunogène.

Les procédés de synthèse des molécules hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D. V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185,3-187,1990).

De préférence, l'invention est caractérisée en ce que ladite protéine OmpA d'entérobactérie, ou l'un de ses fragments, et ledit peptide immunogène dérivé du virus respiratoire syncytial utilisé pour la préparation d'une composition pharmaceutique administrable par voie nasale selon l'invention, sont sous la forme d'une protéine hybride obtenue par couplage covalent, par synthèse chimique ou par fusion génétique, entre la protéine p40 de Klebsiella pneumoniae de séquence SEQ ID N° 2, ou de séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 97 %, après alignement optimal avec la séquence

SEQ ID N° 2, et le peptide immunogène dérivé du VRS de séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 7, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 11, ou de séquence d'acides aminés présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80 %, de préférence 90 %, 95 % ou 97 %, après alignement optimal avec la séquence SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQIDN°7,SEQIDN°9ouSEQIDN°11.

Sous un autre aspect, l'invention concerne en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique comprend une construction nucléique codant pour ladite protéine hybride, notamment contenue dans un vecteur d'expression, ou dans une cellule hote transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ladite protéine hybride.

Les auteurs de la présente invention ont mis en évidence qu'une telle protéine OmpA, notamment ! a P40 de K. pneumoniae, associée en particulier par liaison covalente à un peptide immunogène dérivé du VRS, a la propriété surprenante de potentialiser la réponse immunitaire pour certains de ces peptides immunogènes sans qu'il soit nécessaire de recourir à l'addition d'un adjuvant.

Ainsi, selon la présente invention, ladite composition pharmaceutique comprendra le cas échéant un adjuvant de l'immunité.

L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique est véhiculée sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité, notamment encapsuiée dans un liposome.

De préférence, I'invention comprend l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit véhicule est un vecteur viral contenant une construction nucléique codant pour ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, pour ledit peptide immunogène, ou pour ladite protéine hybride, ou une cellule hôte transformée contenant ladite construction nucléique capable d'exprimer ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, ledit peptide immunogène, ou ladite protéine hybride.

De manière plus préférée, ladite cellule hôte transformée est une bactérie non pathogène pour les mammifères et ladite construction nucléique qu'elle contient comprend en outre les éléments nécessaires à ta sécrétion ou à l'expression à la surface de la membrane desdites bactéries de ladite protéine OmpA, ou l'un de ses fragments, dudit peptide immunogène, ou de ladite protéine hybride.

Enfin, la présente invention conceme l'utilisation selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique notamment vaccinale, destinée à prévenir ou à traiter les infections au VRS.

Les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Dans ces exemples, on se référera aux figures dont les légendes sont ci-après.

Légendes des figures : Figure 1 : Gel SDS PAGE 12 % dans des conditions dénaturantes de la protéine P40 recombinante (rP40) de séquence SEQ ID N° 2 (37 Kda), des marqueurs de tailles moléculaires (M) dans l'ordre décroissant (200,116,97.4,66,45,31,21.5 Kda), et de la protéine P40G2Na de séquence SEQ ID N° 4 (49 Kda).

Figures 2A à 2C : Evaluation de la réponse IgG systémique (figure 2A) et isotypage des IgG sériques chez des souris naïves (figure 2B) ou présensibilisées avec Klebsiella pneumoniae (figure 2C), ayant reçu 3 administrations par voie intra-nasale (i. n.) de 40 ug de protéine G2Na de séquence SEQ ID ? 9 fusionné à rP40.

Figures 3A et 3B : Immunogénicité des conjugués P40-G5, administrés par voie i. n. à des souris BABL/c. 10 ug d'équivalents G5 couplés à rP40 sont administrés 3 fois, à 10 jours d'intervalle, à des souris naïves (figure 3A) ou présensibilisées (figure 3B) par Klebsiella pneumoniae. 10 jours après la dernière immunisation les animaux sont ponctionnés et les IgG sériques dirigées contre G5 dosées par ELISA.

Figures 4A et 4B : Etude de la protection des voies supérieures (figure 4A) et inférieures (figure 4B) après immunisation de souris BALB/c avec la protéine de fusion P40G2Na.

Figures 5A et 5B : Etude de la protection des voies inférieures (figure 5A) et supérieures (figure 5B) après immunisation de souris BABL/c avec le conjugué P40- G5.

Exemple 1 : Clonage de I'ADN codant pour la protéine OmpA P40 de K/eës/e//a pneumoniae L'ADN codant pour la protéine P40 a été obtenu par amplification par PCR à partir de I'ADN génomique de Klebsiella pneumoniae IP 1145 (Nguyen et al., Gene 210 : 93-101,1998). Le fragment de gène codant pour la P40 est inséré dans divers vecteurs d'expression, en particulier un vecteur sous le contrôle du promoteur de l'opéron Trp : pvaLP40 (5,7 Kpb). La séquence nucléotidique et la séquence peptidique de la protéine P40 sont représentées respectivement par les séquences SEQ ID N° 1 et SEQ ID N° 2. Une souche productrice E. coli K12, a été transformée par un vecteur d'expression pvaLP40 (5,7 Kpb). La protéine rP40 est produite sous

forme de corps d'inclusion avec un rendement important (> 10 %, g de protéines/g de biomasse sèche). Cet exemple n'est qu'une illustration de l'expression de la protéine rP40, mais elle peut tre étendue à d'autres souches bactériennes ainsi que d'autres vecteurs d'expression.

Exemple 2 : Clonage de I'ADN codant pour la protéine P40G2Na L'ADN codant pour le fragment G2Na de séquence SEQ ID ? 9 de) a protéine G du VRS-A (correspondant à la séquence d'acides aminés aa 130-aa 230 de la séquence de la protéine G du VRS-A), a été obtenu par assemblage d'oligonucléotides de synthèse sur supports solides (Billes magnétiques Dynal, Oslo) comme décrit par Nguyen et al. (M. Uhlen, E. Homes, and O. Olsvik (eds.), Advances in biomagnetic separation. Eaton Publishing Co., Natick, p. 73-78,1994), les oligonuciéotides ont été conçus et optimisés avec le codon usuel de Escherichia coli. L'ADN G2Na a été cloné dans le vecteur pvaLP40 décrit dans l'exemple 1, le vecteur d'expression résultant est nommé pvaLP40G2Na (6 Kpb). La séquence nucleotidique et la séquence peptidique de P40G2Na sont représentées respectivement par les séquences SEQ ID N° 3 et SEQ ID N° 4. La souche E. coli K12, transformée par ce vecteur, dans des conditions de culture décrites ci-dessus, produit sous forme de corps d'inclusion, la protéine P40G2Na (49 Kda) en quantité abondante (> 5 %, g de protéines/g de biomasse sèche).

Le clonage de I'ADN codant pour le fragment G2Nb de séquence SEQ ID N° 11 de la protéine G du VRS-B (correspondant à la séquence d'acides aminés aa 130-aa 230 de la séquence de la protéine G du VRS-A) ainsi que la protéine de fusion P40G2Nb peuvent tre obtenus en utilisant les techniques décrites pour G2Na et P40G2Na.

Exemple 3 : Procédé de fermentation de la protéine rP40 et de la proteine de fusion P40G2Na La description du procédé de fermentation suivant est applicable à l'expression de la protéine rP40 et à celle de la protéine P40G2Na. Les conditions de culture sont données à titre d'exemple et pourront tre optimisées pour obtenir un meilleur rendement en protéines exprimées.

L'inoculation est réalisée avec la souche E. coli recombinante décrite ci-dessus dans un erlenmeyer contenant 250 ml de milieu TSB (Tryptic Soy Broth, Difco) renfermant de I'Ampicilline (100 ug/ml, Sigma) et de la Tétracycline (8 pg/ml, Sigma), qui est incubée pendant une nuit à 37°C. Puis 2 litres de milieu de culture dans un fermenteur (Biolafitte, France) sont ensemencés au moyen de 200 mi de la culture

précédemment obtenue. De manière assez classique, le milieu de culture peut tre composé d'agents chimiques, supplémentés par les vitamines, des extraits de levure, connus pour avoir une croissance à densité élevée de cellules bactériennes, telle que décrit par Nguyen et al. (Gene 210 : 93-101,1998).

Les paramètres contrôlés durant la fermentation sont : le pH, l'agitation, la température, le taux d'oxygénation, I'alimentation de sources combinées (Glycérol ou Glucose). De manière générale, le pH est régulé à 7,0, la température est fixée à 37°C.

La croissance est contrôlée en alimentant en glycérol (87 %) à un débit constant (12 ml/h) pour maintenir le signal de tension de l'oxygène dissous à 30 %. Lorsque la turbidité de la culture (mesurée à 580 nm) atteint la valeur de 80 (après environ 24 heures de culture), la production des protéines est déclenchée par addition de l'acide indole acrylique (IAA) à la concentration finale de 25 mg/I. Environ 4 heures après induction, les cellules sont récoltées par centrifugation. La quantité de biomasse humide obtenue est d'environ 200 gr.

Exemple 4 : Procédé d'extraction et de purification de la protéine rP40 A) Extraction de la rP40 Le procédé d'extraction et de purification a été décrit selon Haeuw et al. (Eur. J.

Biochem. 255 : 446-454,1998).

Après centrifugation du bouillon de culture (4000 tpm, 10 min, 4°C), les celluies sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5. Les insolubles ou corps d'inclusion sont obtenus après un traitement par le lysozyme (0,5 g/litre, 1 heure température ambiante/agitation douce). Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (15 min à 10 000 g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25 mM à pH 8,5 et 5 mM MgC12, puis centrifugé (15 min à 10 000 g).

Les corps d'inclusion à 37°C sont solubilisés pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant 7 M urée (agent dénaturant) et 10 mM dithiothréitol (réduction des ponts disulfures). Une centrifugation (15 min à 10 000 g) permet d'éliminer les particules non solubles.

Le surnageant obtenu est ensuite resuspendu dans 13 volumes de tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant du NaCI (8,76 g/1) et du Zwittergent 3-14 (0,1 %, p/v). La solution est laissée pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce au contact de I'air (afin de favoriser la renaturation de la protéine par dilution et la réoxydation des ponts disulfures).

B) Purification de la protéine rP40 -Etape de chromatographie d'échange d'anions

Après une nouvelle centrifugation, la solution est dialysée contre un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C.

Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Biorad Macro Prep High Q) équilibrée dans le tampon décrit ci-dessus à un débit linéaire de 15 cm/h. Les protéines sont détectées à 280 nm.

La protéine rP40 est éluée, avec un débit linéaire de 60 cm/h, pour une concentration de 0,2 M en NaCI dans le tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 à 0,1 % Zwittergent 3-14.

-Etape de chromatographie d'échange de cations Les fractions contenant la protéine rP40 sont mélangées et concentrées par ultrafiltration à I'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 kDa) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à I'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utiiisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à 4°C contre un tampon citrate 20 mM pH 3,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14.

Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Biorad Macro Prep High S) équilibrée dans le tampon citrate 20 mM pH 3,0 contenant 0,1 % de Zwittergent 3-14. La protéine rP40 est fluée (vitesse 61 cm/h) pour une concentration 0,7 M en NaCI.

Exemple 5 : Procédé d'extraction et de purification de la protéine P40G2Na A) Extraction de la protéine de fusion P40G2Na Après centrifugation du bouillon de culture (4000 tpm, 10 min, 4°C), les cellules de bactéries sont remises en suspension dans un tampon Tris-HCI 50 mM pH 8,5 contenant 1 mM EDTA, 0,2 M NaCI et 0,05 % Tween 20. Les insolubles ou corps d'inclusion sont obtenus après un traitement par le lysozyme (0,5 g/litre, 1 heure température ambiante/agitation douce). Le culot de corps d'inclusion obtenu par centrifugation (15 min à 10 000 g à 4°C) est repris dans un tampon Tris-HCI 25 mM à pH 8,5 contenant 5 mM MgCI2, puis centrifugé (15 min à 10 000 g).

Les corps d'inclusion sont solubilisés à 37°C pendant 2 heures dans un tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant 7 M chlorhydrate de guanidinium (agent dénaturant) et 10 mM dithiothréitol (réduction des ponts disulfures). Une centrifugation (15 min à 10 000 g) permet d'éliminer les particules non solubles.

Le sumagant est ensuite resuspendu dans 13 volumes de tampon Tris-HCI 25 mM pH 8,5 contenant du NaCI (8,76 g/1) et du Zwittergent 3-14 (0,1 %, p/v). La

solution est laissée pendant une nuit à température ambiante sous agitation douce au contact de I'air.

B) Purification de la protéine de fusion P40G2Na -Etape de chromatographie d'échange d'anions Après une nouvelle centrifugation, la solution est dialysée contre un tampon éthanolamine-HCI 20 mM pH 10,5 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 (100 volumes de tampon) pendant une nuit à 4°C.

Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur d'anions forts (gel Amersham Pharmacia Biotech Source Q) équilibrée dans le tampon décrit ci-dessus, et la protéine P40G2Na est éluée à I'aide d'un gradient de NaCI dans le mme tampon. Les protéines sont détectées à 280 nm.

-Etape de chromatographie d'échange de cations Les fractions contenant la protéine P40G2Na sont mélangées et concentrées par ultrafiltration à I'aide d'un système de cellule à agitation Amicon utilisé avec une membrane Diaflo de type YM10 (seuil de coupure 10 kDa) pour des volumes de l'ordre de 100 ml, ou à I'aide d'un système de filtration à flux tangentiel Minitan Millipore utilisé avec des plaques de membranes possédant un seuil de coupure 10 kDa pour des volumes supérieurs. La fraction ainsi concentrée est dialysée pendant une nuit à 4°C contre un tampon Tris-HCI 20 mM pH 8,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14.

Le dialysat est déposé sur une colonne contenant un support de type échangeur de cations forts (gel Amersham Pharmacia Biotech Source S) équilibrée dans le tampon précédent, et la protéine P40G2Na est é) uée à t'aide d'un gradient de NaCI dans le mme tampon. Les fractions d'intért sont mélangées avant d'tre concentrées par ultrafiltration à I'aide de l'un des systèmes décrits précédemment.

Exemple 6 : Couplage chimique pour obtenir P40-G5 A) Synthèse et caractérisation du conjugué P40-G5Cvsa -Synthèse des peptides G5aCys et CysG5a Le peptide G5a, représenté par la séquence SEQ ID N° 5, est un peptide de 16 acides aminés qui correspond au fragment aa144-aa159 de la protéine G du VRS-A. II est obtenu par synthèse chimique sur phase solide en partant du côté C terminal vers le côté N-terminal. Les peptides CysG5a et G5aCys, représentés respectivement par les séquences SEQ ID N° 6 et SEQ ID N° 7, correspondent respectivement à ce peptide avec une Cystéine supplémentaire du côté N-ou C-terminal qui permet un couplage univoque sur une protéine porteuse.

Les peptides ont été synthétisés à I'aide d'un synthétiseur automatique de peptide en phase solide du côté C vers le côté N-terminal (chimie FMOC à l'échelle de 0,1 ; 0,25 ou 1,0 mmole). La synthèse du peptide CysG5a est effectuée à partir d'une Proline préchargée sur une résine de type HMP, qui permet après clivage d'obtenir une fonction acide libre du côté C-terminal ou une résine de type Rink amide MHBA, qui permet après clivage d'obtenir une fonction amide du côté C-terminal. Celle du peptide G5aCys débute par une Cystéine préchargée sur l'une ou l'autre des résines. Les fonctions réactives des chaines latérales des acides aminés utilisés, sont protégées par des groupes compatibles avec la chimie FMOC [Cys (Trt) ; Arg (Pmc) ; Asn (Trt) ; Gin (Trt) ; Lys (Boc) ; Ser (tBu) ; Thr (tBu)]. Un cycle de couplage se déroule de la manière suivante : déprotection de la fonction amine N-terminale du premier acide aminé à l'aide de pipéridine, activation de la fonction acide du deuxième acide aminé à coupler à I'aide d'HBTU/HMP et couplage. En fin de synthèse, le peptide est clivé de la résine et les chaînes latérales sont déprotégées par réaction avec un mélange eau/ TFA. Le peptide est précipité à t'éther refroidi préalablement à-40°C et le mélange est centrifugé. Le culot est lavé à trois reprises avec de t'éther puis séché à I'azote. Le culot est repris avec de t'eau contenant 0,1 % de TFA. La suspension est à nouveau centrifugée et le sumageant qui contient le peptide est séparé du culot, qui contient la résine. Le peptide brut est purifié par HPLC en phase inverse semi-préparative.

L'homogénéité du peptide purifié est vérifiée par HPLC en phase inverse et par électrophorèse capillaire (FZCE). La structure théorique est confirmée par comparaison de la compatibilité de la masse mesurée par spectrométrie de masse de type ES-MS, avec la masse calculée à partir de la séquence théorique en acides aminés.

Peptide CysG5aNH2 -Synthèse : Poids théorique peptide-résine en fin de synthèse : 593 mg Poids mesuré après séchage à I'azote : 619 mg Clivage peptide-résine et analyse du peptide brut : 200 mg (1/3 du lot) Masse de peptide brut clivé après lyophilisation : 84 mg (75% de quantité nette de peptide soit 97% de rendement).

Homogénéité du peptide brut : 97 % (RP-HPLC ; UV 210 NM) 97 % (FZCE/Microcoat).

-Purification : Masse de peptide purifié après lyophilisation : 50 mg (75% de quantité nette de peptide soit 58 % de rendement).

-Caractérisation : Homogénéité du peptide purifié : > 99 % (RP-HPLC ; UV 210 NM) > 99 % (FZCE/Microcoat ; UV 200 nm) Spectrométrie de masse (ES-MS) Masse calculée : 1951.29 Da Masse mesurée : 1950.80 Da 0.31 -Abréviations : AA ou aa : acide aminé ; Boc : Tert Butoxycarbonyl ; BHA : Bromo hydrosuccimidyl acide ; CE : Capillary Electrophoresis ; ES-MS : Electrospray-Mass Spectrometry ; FMOC : Fluorénylméthoxycarbonyl ; FZCE : Free Zone Capillary Electrophoresis ; HBTU : 2- H-Benzotriazole-1-yl)-1, 1,3,3-trétraméthyluroniumhexafluorophosphate ; HMP : p-hydroxyméthylphénoxyméthyl polystyrène ; MBHA : méthylbenzhydrylamine ; NMP : N-méthyle-2-pyrrolidone ; Pmc : 2,2,5,7,8-Pentaméthyichroman-6-sulfonyle ; RP-HPLC : Reverse Phase-High Performance Liquide Chromatography ; SPPS : Synthèse Peptidique en Phase Solide ; tBOC : t-butyloxycarbonyle ; tBu : tertio Butyl ; TFA : trifluoroacetic acid ; Trt : trityl.

La méthode utilisée pour le couplage a été décrite par Haeuw et al. (Eur. J.

Biochem. 255 : 446-454,1998). Le réactif hétérobifonctionnel, N-hydroxysuccinimide bromoacétate ou HBA, utilisé permet une activation des résidus Lysine de la protéine par bromoacétylation, puis un couplage du peptide via le groupement thiol porté par le résidu Cystéine introduit en position C-terminale du peptide.

Brièvement, la protéine P40 est dialysée contre un tampon phosphate sodique 0, 1M pH 7,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant une nuit à 4°C. La protéine dialysée est ensuite activée à I'aide du réactif HBA. Celui-ci est ajouté à raison de 1,2 mg (dans 10 ut de diméthylformamide) par mg de P40, puis l'ensemble est placé sous agitation pendant 1 heure à température ambiante et à l'obscurité. La P40 activée est dessalée par chromatographie de tamisage moléculaire sur support Pharmacia Sephadex G25. L'élution de la protéine est réalisée à I'aide d'un tampon phosphate sodique 0, 1M pH 7,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14. Les fractions contenant la P40 activée sont rassemblées. Pour le couplage, 0,4 mg de peptide (dans le tampon précédent à une concentration de 10 mg/ml) sont ajoutés à 1 mg de P40

(concentration de l'ordre de 5 mg/ml). Après saturation de la solution sous courant d'argon, I'ensemble est placé sous agitation pendant 2 heures à température ambiante et à l'obscurité. Le conjugué est ensuite dialysé contre un tampon phosphate sodique 0,1 M pH 7,0 contenant 0,1 % Zwittergent 3-14 pendant 24 heures à +4°C avant caractérisation par SDS-PAGE et dosages.

Le nombre de peptides couplés est déterminé par dosage par HPLC des acides aminés après hydrolyse acide et dérivatisation à I'aide du PITC (méthode PicoTag Waters). La quantification du résidu carboxyméthylcystéine libéré selon la méthode décrite par Kolodny & Robey (Anal. Biochem. 187 : 136-140,1990) permet de déterminer avec précision le nombre de moles de peptide G5Cysa fixées par mole de protéine P40. Cette valeur est généralement comprise entre 5 et 10 G5Cysa/P40.

Exemple 7 : Réponse anticorps après immunisation par P40G2Na P40G2Na, à la dose de 40 ug d'équivalent G2Na (antigène dérivé de la protéine G du VRS aa130-230) a été administré 3 fois, à 10 jours d'intervalle, par voie intranasale (i. n.), chez des souris BALB/c présensibilisées ou non par deux administrations i. n. de Klebsiella pneumoniae. Cette présensibilisation a pour but de mimer naturellement la situation humaine dans la mesure où ce pathogène des voies respiratoires est fréquemment rencontré par l'homme qui possède de ce fait un titre anti-rP40 de base.

De manière surprenante, la figure 2A met en évidence un titre sérique IgG élevé contre G2Na consécutif à l'administration de la protéine de fusion par voie i. n. Ce titre est significativement plus élevé chez les animaux présensibilisés par Klebsiella pneumoniae et l'addition de CTB (toxine cholérique sous-unité B) à la protéine de fusion améliore également l'intensité de la réponse et son homogénéité. Un isotypage de la réponse IgG (figures 2B et 2C) sérique met en évidence une réponse IgG1 majoritaire en absence de CTB avec une augmentation des titres IgG1 et IgG2a chez les souris sensibilisées avec K. pneumoniae (figure 2C). L'effet de la présensibilisation sur l'isotypage n'est plus perceptible dès lors que la CTB est additionnée à la protéine de fusion. A noter que le CTB (Sigma, St-Louis, MO, USA) d'origine d'extraction, contient encore des traces de CTA (toxine cholérique sous-unité A) la partie toxique qui est responsable de l'induction de réponses d'anticorps. L'ensemble de ces données met en évidence l'immunogénicité du peptide G2Na lorsqu'il est fusionné à la protéine rP40 et administré par la voie intranasale.

Exemple 8 : Réponse anticorps après immunisation par P40-G5 L'évaluation de la réponse anticorps a également été réalisée avec un épitope B pur issu de la protéine G du VRS nommé G5 (Plotnicky-Gilquin et al., J. Virol.

73 : 5637,1999).

Comme attendu, le peptide G5 n'est pas immunogénique seul ou en présence de CTB. Etonnamment, le peptide G5 est immunogène lorsqu'il est couplé à la protéine rP40 et administré par voie i. n. (figure 3A). La présensibilisation des souris par Klebsiella pneumoniae (figure 3B) améliore sensiblement la réponse IgG sérique anti- G5.

Exemple 9 : Protection après immunisation par P40G2Na et challenge VRS Afin d'évaluer la qualité de la réponse immunitaire en terme de protection, les souris BALB/c sont immunisées par la protéine hybride P40G2Na puis infectées par voie i. n. avec le RSV-A.

La figure 4A montre que l'administration de la protéine porteuse rP40 seule, administrée par voie i. n. avec ou sans CTB est sans conséquence sur l'infection des souris par le RSV-A. De manière intéressante, I'administration de la protéine de fusion P40G2Na à des souris non sensibilisées par Klebsiella pneumoniae entraîne une réduction du titre viral de 2 log 10 pour 5 des 6 souris. De manière surprenante, la sensibilisation des souris par Klebsiella pneumoniae améliore de manière significative la protection des voies pulmonaires.

En ce qui conceme la protection des voies nasales (figure 4B), I'apport de la présensibilisation par Klebsiella pneumoniae est particulièrement net en présence ou en absence de CTB. Cette importance de la présensibilisation par Klebsiella pneumoniae peut s'expliquer par une plus grande homogénéité de la réponse IgG chez les souris présensibilisées mais également par l'augmentation de la réponse locale de type IgA chez ces animaux (données non communiquées).

Ces données expérimentales démontrent pour la première fois que l'administration par voie mucosale d'une protéine recombinante sous-unitaire dérivée de la protéine G du VRS fusionnée à une protéine porteuse P40 protège à la fois la voie pulmonaire et la voie nasale de I'animal.

Exemple 10 : Protection après immunisation par P40-G5 et challenge VRS De manière intéressante, la figure 5A montre que l'administration du peptide G5 couplé à rP40 par voie nasale entraîne une réduction de virémie significative (p<0,05) au niveau des poumons des souris contre une infection avec RSV-A. Concernant la protection des voies supérieures (figure 5B), les résultats obtenus montrent que les animaux immunisés par P40-G5 ont une virémie réduite après infection par le RSV-A particulièrement significative (p<0,05) lorsque ceux-ci ont été présensibilisés avec Klebsiella pneumoniae.