La vaccination est un moyen efficace de prévenir ou de réduire les infections virales ou bactériennes. Le succès des campagnes de vaccination dans ce domaine a permis d'étendre le concept de vaccin dans le domaine des maladies auto-immunes et du cancer.

L'hCG est une hormone dimérique qui appartient à la super famille des facteurs de croissance à coeur cystéine (TGF (3, NGF, PDGFß) et à la famille des gonadotropines.

Cette famille comprend d'une part les hormones pituitaires LH (luteinizing hormone ou interstitial cell stimulating hormone) et FSH (folliculestimulating hormone ou follitropin) responsables de la stimulation des fonctions testiculaires et ovariennes, et d'autre part, les hormones d'origine placentaire, parmi lesquelles l'hCG synthétisée durant la grossesse et dont le rôle physiologique est de maintenir la croissance du corpus luteus fonctionnel.

Toutes ces hormones, malgré la diversité de leurs fonctions physiologiques, sont proches de par leur structure et consistent en deux chaînes ou sous-unités a ou (3 glycosylées à des sites spécifiques et reliées par des ponts disulfures. Au sein d'une espèce donnée, la séquence de la sous-unité a est fondamentalement identique pour l'ensemble de ces hormones. L'activité hormonale de ces hybrides ap est dictée par la particularité de la sous-unité ß.

Outre son origine placentaire, une localisation pituitaire a été montrée pour l'hCG ou des molécules hCG-like. Cette source pituitaire (Hoermann et coll., J.

Endocrinal Metab., 71 : 179-186,1990) pourrait être à l'origine des très faibles concentrations de matériel"hCG like"présent dans le sérum d'individus sains des deux sexes (Odell et coll., N. Engl. J. Med., 317 : 1688-1691,1987 ; Odell et coll., J. Clin.

Endocrinol. Metab., 71 : 1318-1321, 1990).

Par ailleurs, l'hCG et ses fragments semblent être des produits de la transformation maligne. En effet, alors que les néoplasmes bénins n'expriment pas, ou ne produisent pas, ce genre de matériel, plusieurs auteurs ont montré que les tumeurs malignes, mais également les cellules embryonnaires et foetales, expriment l'hCG in vivo et in vitro. Il a été observé qu'une immunoréactivité envers l'hCG est présente chez 10 à 50 % des patients porteurs de différentes tumeurs non trophoblastiques parmi lesquelles des tumeurs de l'endomètre, l'ovaire, le pancréas, l'estomac, le colon, le foie, le poumon, le sein, les reins, la vessie ainsi que certains lymphomes (Braunstein et coll., Ann Intern Med., 78 : 39-45,1973 ; Kuida et coll., Arch. Pathol. Lab. Med., 112 : 282- 285,1988).

Dans les cellules tumorales, l'hCG, ses sous-unités ou ses fragments peuvent être associés à la membrane, constituant ainsi un pool insoluble de sialoglycoprotéines non extractibles sans destruction de la membrane. Elles peuvent également constituer un pool soluble hydrophile sécrété par les cellules et présent dans le sang et les urines.

Il est à noter que dans le cas de certains types tumoraux comme le poumon ou la vessie, l'existence d'une activité p-hCG est corrélée au stade d'avancement de la tumeur (Yoshimura et coll., Cancer, 73 : 2745-2752,1994 ; Norman et coll., Clinical Endocrinol., 23 : 25-34,1985 ; Olivier et coll., Molecular Biotherapy, 1 : 43-47,1988).

L'ensemble de ces données indique qu'un ciblage immunologique de la p-hCG ou de ses fragments peut avoir un intérêt tout particulier dans le traitement de certains types de cancer.

Des études précliniques menées chez la souris (Acevedo et coll., Cancer Detection and Prevention, suppl. 1 : 477-486,1987) ou chez le rat (Kellen et coll., Cancer, 49 : 2300-2304,1982) ont respectivement montré l'intérêt, en terme de

ralentissement de la croissance tumorale, de générer une réponse immunitaire de type anticorps dirigée contre la (3-hCG. De nombreux brevets ont été déposés dans ce sens.

Il est cependant à noter que dans ce type de stratégie, seul un ralentissement temporaire de la croissance tumorale est observé. Par ailleurs, l'importance des réponses immunitaires impliquant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) a aussi été fortement documentée dans les réponses anti-tumorales notamment celles dirigées contre les cellules de mélanome (Rivoltini et al., Crit. Rev. Immunol. 18,55-63, 1998).

Les lymphocytes T cytotoxiques reconnaissent des peptides provenant de la dégradation de protéines intracellulaires qui sont présentées par les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) de classe 1 à la surface des cellules. Après processing des protéines, les peptides CTL sont sélectionnés à partir du pool de peptides cytosoliques sur la base de leur longueur et de leur séquence en amino acide et transportés vers le réticulum endoplasmique puis associés aux molécules du CMH de classe I. Plusieurs études ont montré que ces peptides naturellement présentés par le CMH de classe 1 ont en général une longueur de 9i1 acides aminés et contiennent des résidus d'ancrage spécifiques qui possèdent des propriétés particulières en terme d'hydrophobicité et de charge (Falk K. et al., Nature, 351 : 291-6,1991 ; Hunt DF. et al., Science, 255 : 1261-3,1992). La qualité et la position de ces résidus d'ancrage sont dictées par « les poches du sillon de présentation d'antigène » spécifiques de chaque allèle du CMH classe 1 (Matsumara M. et al., Science, 257 : 927-34,1992) suggérant que les résidus d'ancrage sont essentiellement impliqués dans la fixation au CMH classe I.

Cette hypothèse semble confirmée par le fait que toute altération (remplacement ou délétion) des résidus d'ancrage de ces peptides CTL abroge la fixation de ceux-ci au CMH classe I, et que toute mutation des molécules de CMH classe 1 au niveau des poches de fixation modifie le répertoire des peptides liés (Ruppert J. et al., Cell., 1993, 74 : 929-37 ; Rohren EM et al., J. Exp. Med., 1993,177 : 1713-21).

Les résidus d'ancrage ne semblent pas engagés directement dans l'interaction avec le récepteur des cellules T (TCR) ce qui suggère qu'ils peuvent être remplacés sans affecter la reconnaissance des cellules T. Par ailleurs, il a été récemment montré, pour différents épitopes CTL, que la fixation et l'immunogénicité pouvaient être augmentées en remplaçant les résidus d'ancrage au CMH classe I, et ceci sans affecter la

reconnaissance de ces peptides par les CTL spécifiques (Bakker ABH et al., Int. J.

Cancer, 70 : 302-309,1997 ; Parkhurst MR et al., J. immunol., 157 : 2539-2548,1996). Le choix des modifications des résidus d'ancrage se fait selon des paramètres d'affinité entre les peptides et le CMH classe 1 et de stabilité du complexe peptide/CMH classe 1 (Van der Burg et al., J. Immunol., 156 (9) : 3308-3314,1996).

Il est cependant à noter que malgré ces modifications, une des difficultés de l'approche CTL réside dans la génération de CTL in vivo, du fait d'une immunogénicité souvent modeste de ces peptides (Melief, Adv. Cancer Res., 58 : 143-175,1992 ; Nandaz et Sercarz, Cell, 82 : 13-17,1995).

On peut citer le document Dangles Virginie et al (Cancer Immunol Immunother (2002-02) 50, no. 12 : 673-681) qui décrit en particulier trois déterminants antigéniques dérivés des peptides (40-48), (44-52) et (75-84) de la chaîne ß de l'hCG humaine qui sont capables d'induire une réponse lymphocytaire CD8+ in vitro.

On peut également citer le document Triozzi Pierre L et al (Clinical Cancer Research (1997) 3, no. 12, part 1 : 2355-2362) qui a pour objet une étude sur les effets cliniques (toxicité) et immunologiques d'une composition vaccinale constituée d'un peptide synthétique correspondant à la partie C-terminale (CTP) de hCG (3 conjugué à la protéine DT (toxoïde diphtérique) et combiné à un adjuvant de copolymère bloc synthétique non ionique.

Egalement, le document Housseau Frank et al. (Int. J. Cancer (1995) 63, no. 5, p. 633-638) concerne l'étude de la détection d'une réponse lymphocytaire cellules T Helper dirigée contre hCG (3 chez des patients présentant des tumeurs.

On peut également citer la revue générale Triozzi Pierre L. et al. (Oncology Reports (1999) 6, no. l, p. 7-17) qui a pour objet l'utilisation de hCG comme cible pour les vaccins anti-cancéreux. Cette revue décrit en particulier un nouveau vaccin peptidique anti-hCG de combinaison, à savoir hCG (3 (109-145) : DT + hCG (3 (38- 57) [R] : DT.

Le document Geissler Michael et al. (Laboratory Investigation (1997) 76, no. 6, p. 859-871) concerne une étude sur l'immunisation génétique en utilisant de l'ADN codant la sous-unité P de hCG pour induire une réponse lymphocytaire cytotoxique et protéger des souris contre la formation de tumeurs.

Ainsi, il existe aujourd'hui un besoin de disposer d'épitopes cytotoxiques potentiels présents sur la chaîne (3 de l'hCG pour générer une réponse CTL dirigée spécifiquement contre des cellules tumorales exprimant l'hCG.

Ceci est justement l'objet de la présente invention.

L'invention a ainsi pour objet l'utilisation d'épitopes cytotoxiques potentiels présents sur la chaîne ß de l'hCG, pour générer une réponse immunologique impliquant des lymphocytes T cytotoxiques, en particulier dirigés spécifiquement contre un peptide codé par la séquence génomique du gène codant pour la (3-hCG.

De préférence, l'invention a pour objet l'utilisation d'un peptide codé par un fragment génomique du gène codant pour la p-hCG humaine, ou l'un de ses analogues, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer des lymphocytes T cytotoxiques, ledit peptide étant capable de s'associer au CMH de classe 1 pour générer des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques dudit peptide.

Lesdits épitopes cytotoxiques potentiels dont la séquence est codée par un fragment génomique du gène codant pour la chaîne (3 de l'hCG pourront également présenter au moins une mutation pour l'un au moins de leurs sites d'ancrage aux molécules CMH de classe 1 dans le but d'augmenter leur affinité et seront éventuellement couplés ou mélangés à une protéine porteuse, en présence ou non d'un adjuvant de l'immunité, afin d'augmenter leur immunogénicité si nécessaire.

L'invention a donc pour objet l'utilisation d'un peptide d'au moins 8, de préférence 9 acides aminés codé par un fragment génomique du gène codant pour la ß- hCG humaine, ou l'un de ses analogues, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à générer des lymphocytes T cytotoxiques.

Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « protéine » également les peptides ou les polypeptides.

Par analogue d'un peptide codé par un fragment génomique du gène codant pour la p-hCG humaine, on entend désigner : - un composé comprenant au moins une séquence d'acides aminés présentant un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %,

85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence dudit peptide d'au moins 8 acides aminés codé par un fragment génomique du gène codant pour la (3-hCG humaine ; ou - un composé comprenant au moins une séquence d'acides aminés présentant un degré d'identité après alignement d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence rétroinversée dudit peptide d'au moins 8 acides aminés codé par ledit fragment génomique, lesdits composés analogues étant capables, lorsqu'ils sont mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présentés un taux significatif d'hCG, de générer des lymphocytes T de type cytotoxique, en particulier spécifique dudit peptide ou antigène codé par le fragment génomique du gène codant pour la p-hCG humaine dont ils sont issus.

Par « pourcentage d'identité » entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou de résidus d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement, ce pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le meilleur alignement ou alignement optimal est l'alignement pour lequel le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer, comme calculé ci- après, est le plus élevé. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée par segment ou par « fenêtre de comparaison » pour identifier et comparer les régions locales de similarité de séquence. L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Smith et Waterman (1981) (Ad. App. Math. 2 : 482), au moyen de l'algorithme d'homologie locale de Neddleman et Wunsch (1970) (J. Mol. Biol.

48 : 443), au moyen de la méthode de recherche de similarité de Pearson et Lipman (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 : 2444), au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA dans le Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI).

Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acides aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale par fenêtre de comparaison dans laquelle la région de la séquence d'acide nucléique ou d'acides aminés à comparer peut comprendre des additions ou des délétions par rapport à la séquence de référence pour un alignement optimal entre ces deux séquences. Le pourcentage d'identité est calculé en déterminant le nombre de positions identiques pour lesquelles le nucléotide ou le résidu d'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions dans la fenêtre de comparaison et en multipliant le résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Parmi lesdits composés analogues, on préfère notamment les composés comprenant une séquence d'acides aminés présentant au moins une mutation d'un acide aminé de la séquence d'acides aminés codé par un fragment génomique du gène codant pour la (3-hCG humaine dont il est issu, notamment par délétion, addition ou substitution.

De manière préférée, la séquence d'acides aminés dudit composé analogue présente une subsitution par un acide aminé naturel ou non naturel d'au moins un acide aminé de la séquence d'acides aminés codée par un fragment génomique codant pour la P-hCG humaine dont elle est issue, notamment au niveau d'un site d'ancrage au CMH de classe 1 de la séquence d'acides aminés dont elle est issue.

Egalement de manière préférée, la séquence d'acides aminés dudit composé analogue présente une modification de la partie N et/ou C terminales de la séquence d'acides aminés codée par un fragment génomique codant pour la p-hCG humaine dont elle est issue, notamment par modification de l'acide aminé N et/ou C terminales ou par addition d'un ou plusieurs acides aminés permettant le couplage de la séquence d'acides aminés dudit composé analogue avec un composé de nature peptidique, lipidique, d'un dérivé palmitoylé ou d'un dérivé acylé.

La présente invention concerne l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide d'au moins 8, de préférence 9 acides aminés codé par un fragment génomique du gène codant pour la p-hCG humaine, ou l'un de ses analogues, est choisi parmi les peptides de séquence suivante :

a) un fragment d'au moins 8 acides aminés consécutifs d'un peptide de séquence SEQ ID No. 1 ; b) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide tel que défini en a) ; et c) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence 80 %, 85 %, 90 % ou 95 %, avec la séquence d'un peptide tel que défini en a) ou b).

Par séquence d'acides aminés rétroinverso ou de la forme rétroinverso d'un peptide constitué de n résidus d'acide aminé, de séquence générale H2N-XI-X2- ......... Xn-i-Xn-COOH, H2N-correspondant au radical-NH2 de l'acide aminé Xi situé en position N terminale du peptide et-COOH correspondant au radical-COOH de l'acide aminé Xn situé en position C terminale du peptide, on entend désigner la séquence d'acides aminés du peptide H2N-Xn-Xn l-X2-Xl-COOH, H2N- correspondant au radical-NH2 de l'acide aminé Xn situé en position N terminale du peptide et-COOH correspondant au radical-COOH de l'acide aminé Xi situé en position C terminale du peptide.

L'invention concerne en particulier l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide d'au moins 8 acides aminés codé par un fragment génomique du gène codant pour la p-hCG humaine, ou l'un de ses analogues, comprend au plus 15 acides aminés, de préférence au plus 14,13, 12, 11 et 10 acides aminés.

De manière plus préférée, lesdits peptides selon l'invention sont choisis parmi les peptides de séquences SEQ ID Nos. 3 à 174 identifiés aux tableaux 1 à IV des exemples 1 et 2 de la présente description, ces derniers pouvant comprendre au moins une mutation, de préférence une substitution d'un acide aminé par un acide aminé naturel ou non naturel, de manière plus préférée au plus une telle substitution.

De manière plus préférée, lesdits peptides selon l'invention sont choisis parmi les peptides de séquences suivantes : a) les peptides de séquence SEQ ID Nos. 9,19, 50,72, 90,96 ou 104 ; b) un fragment d'au plus 15 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1 comprenant un peptide tel que défini en a) ;

c) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide tel que défini en a) ou b) ; et d) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 % avec la séquence d'un peptide tel que défini en a), b) ou c), ou encore parmi les peptides de séquences suivantes : e) les peptides de séquences SEQ ID Nos. 160,162, 165 et 173 ; et f) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide tel que défini en e).

De manière encore plus préférée, lesdits peptides selon l'invention sont choisis parmi les peptides de séquences suivantes : a) les peptides de séquence SEQ ID Nos. 9 ou 50 ; b) un fragment d'au plus 15 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1 comprenant un peptide tel que défini en a) ; c) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide tel que défini en a) ou b) ; et d) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 % avec la séquence d'un peptide tel que défini en a), b) ou c), de préférence les peptides de séquences SEQ ID Nos. 162 et 165 (dérivés du peptide de séquence SEQ ID No. 9) et 173 (dérivé du peptide de séquence SEQ ID No. 50) et les peptides de séquence de la forme rétroinverso des peptides de séquences SEQ ID Nos. 162, 165 et 173.

Lesdits peptides selon l'invention de séquences SEQ ID Nos. 165 et 173 sont tout particulièrement préférés, notamment le peptide de séquence SEQ ID No. 173.

L'invention comprend en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide d'au moins 8 acides aminés codé par un fragment génomique du gène codant pour la P-hCG humaine, ou l'un de ses analogues est capable de s'associer au CMH de classe 1 pour générer des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques dudit peptide.

L'invention comprend également l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide est modifié en sa partie N et/ou C terminales et couplé à un composé peptidique, lipidique, à un dérivé palmitoylé ou à tout dérivé acylé.

L'invention comprend en outre l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide est modifié par glycosylation au niveau d'un résidu sérine ou asparagine.

De préférence, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ledit peptide est couplé ou mélangé à une protéine porteuse choisie parmi la protéine TT (Toxoïde Tétanique) ou ses dérivés, la protéine DT (Toxoïde Diphtérique) ou ses dérivés, la KLH (Key Limpet Haemocyanin), les protéines de choc thermique ou HSP, les protéines de membranes bactériennes de type Omp, notamment d'entérobactéries, ou leurs fragments.

Dans la présente invention, on entendra désigner par le terme « Omp » (pour « Outer Membrane Protein »), les protéines de la membrane externe, et par « OmpA » celles de type A.

Par fragment ou composés dérivés d'une protéine porteuse, on entend désigner en particulier tout fragment de séquence d'acides aminés compris dans la séquence d'acides aminés de la protéine porteuse qui, lorsqu'il est associé à un immunogène, est capable de générer ou accroître une réponse immune, notamment humorale et/ou de type CTL, dirigée contre ledit immunogène et comprenant au moins 8 acides aminés consécutifs, de préférence au moins 10 acides aminés ou de manière plus préférée au moins 15,20, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de la séquence d'acides aminés de ladite protéine porteuse, leurs composés dérivés comprenant au moins l'un de ses fragments.

Dans un mode de réalisation particulier, l'invention comprend l'utilisation selon l'invention dans laquelle la protéine porteuse Omp d'entérobactérie ou l'un de ses fragments, est obtenue par un procédé d'extraction à partir d'une culture de ladite entérobactérie ou par voie recombinante.

Les procédés d'extraction de protéines de membranes bactériennes sont connus de l'homme de l'art et ne seront pas développés dans la présente description. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter le procédé d'extraction décrit par Haeuw J. F. et al. (Eur. J. Biochem., 255 : 446-454,1998).

Les méthodes de préparation de protéines recombinantes sont aujourd'hui également bien connues de l'homme de l'art. Parmi les cellules utilisables pour la

production de ces protéines recombinantes, on peut citer par exemple les cellules bactériennes (Olins P. O. et Lee S. C., Curr. Op. Biotechnology, 4 : 520-525,1993), mais également les cellules de levure (Buckholz R. G., Curr. Op. Biotechnology, 4 : 538-542, 1993), de même que les cellules animales, en particulier les cultures de cellules de mammifères (Edwards C. P. et Aruffo A., Curr. Op. Biotechnology, 4 : 558-563,1993) mais également les cellules d'insectes dans lesquelles on peut utiliser des procédés mettant en oeuvre par exemple des baculovirus (Luckow V. A., Curr. Op.

Biotechnology, 4 : 564-572,1993) ou encore des cellules végétales.

De manière tout à fait préférée, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que ladite protéine porteuse est une protéine OmpA de Klebsiella pneumoniae, en particulier la protéine P40 de séquence d'acides aminés SEQ ID No. 2, l'un de ses fragments d'au moins 8 acides aminés, de préférence au moins 10,15, 20,30 ou 50 acides aminés, ou un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 80 %, de préférence 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence SEQ ID No. 2 ou avec l'un de sesdits fragments.

La protéine porteuse nommée P40, dérivée de la membrane externe de type A de Klebsiella pneumoniae a été décrite en particulier dans les demandes de brevet WO 95/27787 et WO 96/14415 comme permettant d'augmenter la réponse immune notamment de type humorale, lorsque celle-ci était associée à un immunogène, et dans de nombreux documents mettant en évidence sa capacité à générer des réponses immunes de type CTL contre les antigènes qui lui sont associés.

La présente invention a aussi pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide d'au moins 8 acides aminés codé par un fragment génomique du gène codant pour la p-hCG humaine, ou l'un de ses analogues, est couplé par liaison covalente avec ladite protéine porteuse ou l'un de ses fragments, ledit couplage pouvant être réalisé par voie chimique ou par fusion génétique.

Dans un mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce qu'il est introduit un ou plusieurs éléments de liaison dans ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments, et/ou dans ledit peptide d'au moins 8 acides aminés codé par un fragment génomique du gène codant pour la (3-hCG humaine, ou

l'un de ses analogues, pour faciliter le couplage chimique, de préférence, ledit élément de liaison introduit est un acide aminé.

Selon l'invention, il est possible d'introduire un ou plusieurs éléments de liaison, notamment des acides aminés pour faciliter les réactions de couplage entre la protéine porteuse, ou l'un de ses fragments, et/ou ledit peptide. Le couplage covalent entre la protéine porteuse, ou l'un de ses fragments, et ledit peptide codé par un fragment génomique du gène codant pour la (3-hCG, ou l'un de ses analogues peut être réalisé à l'extrémité N-ou C-terminale de la protéine porteuse, de l'un de ses fragments, dudit peptide ou de l'un de ses analogues. Les réactifs bifonctionnels permettant ce couplage seront déterminés en fonction de la nature de ces extrémités N-ou C-terminales.

Dans un autre mode de réalisation particulier, l'utilisation selon l'invention est caractérisée en ce que le peptide hybride obtenu après couplage entre ledit peptide codé par un fragment génomique du gène codant pour la (3-hCG humaine, ou l'un de ses analogues, et ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments, est préparé par recombinaison génétique (fusion génétique).

Ledit peptide hybride peut être en effet produit par des techniques d'ADN recombinant par insertion ou addition à la séquence d'ADN codant pour ledit peptide codé par un fragment génomique du gène codant pour la (3-hCG humaine, ou l'un de ses analogues, d'une séquence codant pour ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments.

Les procédés de synthèse de ces peptides hybrides englobent les méthodes utilisées en génie génétique pour construire des polynucléotides hybrides codant pour les séquences polypeptidiques recherchées. On pourra, par exemple, se référer avantageusement à la technique d'obtention de gènes codant pour des protéines de fusion décrite par D. V. Goeddel (Gene expression technology, Methods in Enzymology, vol. 185 : 3-187, 1990).

L'invention a également pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ledit peptide codé par un fragment génomique du gène codant pour la P-hCG humaine, ou l'un de ses analogues, est véhiculé sous une forme permettant d'améliorer sa stabilité et/ou son immunogénicité.

Parmi les véhicules permettant d'améliorer la stabilité et/ou l'immunogénicité desdits peptides, on préfère notamment les liposomes ainsi que les vecteurs viraux ou bactériens contenant une construction nucléique codant pour ledit peptide et éventuellement en outre ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments.

Sous un autre aspect, l'invention concerne l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que la composition pharmaceutique contient un vecteur comprenant une construction nucléique codant pour le peptide hybride obtenue après couplage entre ledit peptide codé par un fragment génomique du gène codant pour la p-hCG humaine, ou l'un de ses analogues, et ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments, ou une cellule hôte transformée par ledit vecteur capable d'exprimer ledit peptide hybride.

Est également comprise dans la présente invention, l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que ladite composition pharmaceutique comprend en outre un adjuvant de l'immunité, cet adjuvant pouvant être mélangé ou lorsque la composition pharmaceutique comprend une protéine porteuse, ou l'un de ses fragments, éventuellement couplé à ladite protéine porteuse, ou l'un de ses fragments.

Sous un autre aspect, l'invention a pour objet l'utilisation selon l'invention, caractérisée en ce que les lymphocytes T cytotoxiques générés sont spécifiques de cellules antitumorales positives pour le marqueur hCG.

L'invention comprend en outre l'utilisation selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à la prévention ou le traitement des cancers associés à la présence de tumeurs positives pour le marqueur hCG.

L'invention comprend en outre l'utilisation selon l'invention pour la préparation d'une composition pharmaceutique, notamment vaccinale, administrable par voie systémique mucosale ou transdermique.

Sous un dernier aspect, la présente invention comprend les peptides choisis parmi les peptides de séquence suivante : a) un fragment d'au moins 8, de préférence 9 acides aminés consécutifs d'un peptide de séquence SEQ ID No. 1 ; b) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide a) ; et

c) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 %, de préférence d'au moins 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % avec la séquence d'un peptide a) ou b).

Parmi cesdits peptides selon l'invention, on préfère notamment les peptides constitués d'au plus 15 acides aminés, de préference au plus 14,13, 12, 11 et 10, en particulier les peptides de séquences SEQ ID Nos. 3 à 174 identifiés aux tableaux 1 à IV des exemples 2 et 3, ces derniers pouvant comprendre une mutation, notamment par substitution d'un acide aminé par un autre acide aminé naturel ou non naturel, de préférence au plus une telle substitution.

Parmi cesdits peptides selon l'invention, on préfère de manière plus particulière les peptides choisis parmi les peptides de séquences suivantes : a) les peptides de séquence SEQ ID Nos. 9,19, 50,72, 90,96 ou 104 ; b) un fragment d'au plus 15 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1 comprenant un peptide tel que défini en a) ; c) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide tel que défini en a) ou b) ; et d) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 % avec la séquence d'un peptide tel que défini en a), b) ou c), ou encore lesdits peptides selon l'invention choisis parmi les peptides de séquences suivantes : e) les peptides de séquence SEQ ID Nos. 160,162, 165 ou 173 ; et f) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide tel que défini en e).

Parmi cesdits peptides selon l'invention, on préfère de manière encore plus préférée, les peptides choisis parmi les peptides de séquences suivantes : a) les peptides de séquence SEQ ID Nos. 9 ou 50 ; b) un fragment d'au plus 15 acides aminés consécutifs de la séquence SEQ ID No. 1 comprenant un peptide tel que défini en a) ; c) un peptide dont la séquence d'acides aminés est la séquence de la forme rétroinverso d'un peptide tel que défini en a) ou b) ; et

d) un peptide dont la séquence présente un degré d'identité après alignement optimal d'au moins 70 % avec la séquence d'un peptide tel que défini en a), b) ou c), de préférence les peptides de séquences SEQ ID Nos. 162 et 165 (dérivés du peptide de séquence SEQ ID No. 10) et 173 (dérivé du peptide de séquence SEQ ID No. 50) et les peptides de séquence de la forme rétroinverso des peptides de séquences SEQ ID Nos. 162,165 et 173.

Les peptides selon l'invention de séquences SEQ ID Nos. 165 et 173 sont tout particulièrement préférés, notamment le peptide de séquence SEQ ID No. 173.

De préférence, lesdits peptides selon l'invention sont caractérisés en ce qu'ils sont capables de générer des lymphocytes T de type cytotoxique, en particulier spécifique desdits peptides, ou capables de générer une augmentation importante du taux de lymphocytes T CD8+ produisant de l'INF-y et du TNF-oc, lorsque cesdits peptides sont mis en présence de lymphocytes T de sujets ayant présenté un taux significatif d'hCG.

De préférence, les peptides selon la présente invention sont capables de s'associer au CMH de classe 1 pour générer des lymphocytes T de type cytotoxique.

L'invention comprend également lesdits peptides selon l'invention à titre de médicament, notamment destinés à la prévention et/ou le traitement de tumeurs, en particulier les tumeurs à marqueur hCG positif.

Enfin, la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant un composé choisi parmi : - un peptide selon l'invention, le cas échéant couplé ou mélangé avec une protéine porteuse ou l'un de ses fragments ; ou - une construction nucléique contenant un ADN codant pour un peptide selon l'invention, le cas échéant contenant en outre un ADN codant pour une protéine porteuse ou l'un de ses fragments.

Bien entendu, de telles compositions pharmaceutiques selon l'invention pourront comprendre également un adjuvant de l'immunité capable d'augmenter l'immunogénicité de tels peptides et/ou être véhiculées sous une forme permettant d'améliorer leur stabilité et/ou leur immunogénicité comme par exemple sous forme de liposomes, ou de vecteur viral ou bactérien pour les constructions nucléiques.

Les légendes des figures et exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans aucunement en limiter la portée.

Légendes des figures : Figures 1A et 1B : Mesure de la sécrétion de y interféron induite par le peptide 7.3 (SEQ ID No. 9) chez une patiente atteinte de cancer du sein (figure 1B) comparée à celle induite par un peptide non relevant (figure 1 A).

Figures 2A à 2E : Etude de la réponse CTL induite par le peptide 7.3 après immunisation de souris HLA A2/Kb (figure 2A) ou C57/B16 (figure 2B). Comparaison du peptide 7.3 et de trois de ses dérivés : 20.2 (SEQ ID No. 160) (figure 2C), 20.4 (SEQ ID No. 162) (figure 2D) et 20.7 (SEQ ID No. 165) (figure 2E) pour l'induction de la réponse CTL chez des souris transgéniques HLA A2/Kb. NC : Témoin cellules cibles non chargées.

Figures 3A à 3E : Etude de la réponse CTL induite par le peptide 8.6 après immunisation de souris HLA A2/Kb (figure 3A) ou C57/B16 (figure 3B). Comparaison du peptide 8.6 (figure 3B) et de son dérivé, le peptide 10.18 (SEQ ID No. 173) (figures 3C et 3D) pour l'induction de la réponse CTL chez des souris transgéniques HLA A2/Kb ou C57/B16 respectivement. Dans la figure 3E, les cellules de souris immunisées avec le peptide 10.18 sont mises en présence de cibles présentant le peptide natif 8.6.

NC : Témoin cellules cibles non chargées.

EXEMPLES Exemple 1 : Synthèse, purification et caractérisation de nonapeptides de la sous- unité ß de l'hCG.

La séquence de la sous-unité (3 de l'hCG (p gonadotropine chorionique humaine) (y compris la séquence signal en caractères gras) comprend 165 résidus (SEQ ID No. <BR> <BR> <BR> <BR> <P>1) :<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> [MEMFQGLLLLLLLSMGGTWA] SKEPLRPRCRPINATLAVEKEGCPVCITVNT TICAGYCPTMTRVLQGVLPALPQVVCNYRDVRFESIRLPGCPRGVNPVVSYAVA

LSCQCALCRRSTTDCGGPKDHPLTCDDPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTP ILPQ Les 157 nonapeptides (SEQ ID Nos. 3 à 159) de la sous-unité p de l'hCG ont été synthétisés à l'aide d'un synthétiseur multiple de peptides (Advanced ChemTech, modèle 348 oméga) en phase solide en utilisant la chimie Fmoc à l'échelle de 50 moles. Les résines de types Wang-ou 2-chlorotrityl-préchargées portant le résidu COOH-terminal des peptides à synthétiser ont été introduites dans les puits d'un réacteur comportant 96 puits. La fonction a-NH2 des acides aminés utilisés pour la synthèse était protégée par un groupement (Fmoc) et les fonctions des chaînes latérales des acides aminés étaient protégées par des groupes compatibles avec la chimie Fmoc [Cys (Trt) ; Arg (Pmc) ; His (Trt) ; Trp (Boc) ; Asn (Trt) ; Gln (Trt) ; Lys (Boc) ; Ser (tBu) ; Thr (tBu) ; Tyr (tBu) ; Asp (OtBu) ; Glu (OtBu)].

I. Protocole de synthèse Lavages préliminaires : DCM 1500 il/puits 3 fois 5 min DMF 1500 Ill/puits 3 fois 10 min 1. Déprotections : a. DMF 1125 u. l/puits pipéridine 375 µl/puits 1 fois 2 min rinçage : DMF 1500 Ill/puits vidange b. DMF 1125 u. l/puits pipéridine 375 µl/puits 1 fois 10 min 2. Lavages : DMF 1500 pl/puits 6 fois 2 min 3. Couplages : a. Aa/HOBt 0,5M 500 µl/puits HBTU 0, 5M 500 µl/puits DIEA 2M 250 µl/puits 1 fois 20 min Lavages DMF 1500 µl/puits 2 fois 2 min b. Aa/HOBt 0, 5M 500 u. l/puits HATU 0, 5M 500 µl/puits DIEA 2M 250 µl/puits 1 fois 20 min 4. Lavages DMF 1500 pl/puits 4 fois 2 min DCM 1500 µl/puits 3 fois 1 min

5. Acétylation mélange § 15001/puits 1 fois 10 min 6. Lavages DCM 1500 ul/puits 3 fois 1 min DMF 1500 pl/puits 4 fois 2 min § Mélange utilisé : Anhydride acétique 10 %, DIEA 5 % dans le DCM Le cycle comprenant les étapes 1 à 6 est répété n fois jusqu'à l'obtention des séquences désirées. Après le dernier cycle de couplage, la fonction α-NH2 du peptidylrésine est déprotégée à l'aide de pipéridine comme décrit dans l'étape 1.

En fin de synthèse, les peptidylrésines sont lavés : Lavages DMF 1500 tl/puits 4 fois 2 min DCM 1500 ul/puits 4 fois 3 min avant d'être séchés pendant 3 heures sous azote.

II. Clivage des peptidylrésines et récupération des peptides Les peptides sont ensuite clivés de la résine et les fonctions des chaînes latérales des acides aminés sont déprotégées par réaction pendant 3 h à température ambiante du peptidylrésine avec un mélange de clivage dont la composition est la suivante (100 mg de peptidylrésine pour 1,5 ml du mélange) : -TFA 82, 5 % ; - H20 5 % ; - EDT 2, 5 % ; - Thioanisol 5 % ; et - Phénol 5 %.

La résine est séparée du peptide par simple filtration. Le peptide est ensuite précipité par addition de diéthyléther à 4°C. Le peptide brut est récupéré par centrifugation à 3000 tr/min pendant 3 min. Après trois lavages à l'éther, le peptide est repris à l'aide d'une solution aqueuse d'acide acétique puis lyophilisé.

III. Purification des peptides

Les peptides sont repris dans un mélange d'acide acétique et d'eau et purifiés par RP-HPLC semi-préparative sur une colonne C4 ou C18. Le système d'élution étant un gradient H20 et acétonitrile en présence de 0,1 % de TFA.

IV. Analyses des peptides La pureté du peptide est vérifiée par RP-HPLC en phase inverse. L'identité du peptide est confirmée par spectrométrie de masse de type ES-MS.

Caractéristiques des nonapeptides synthétisés : pureté des peptides : > 85 % (RP-HPLC) identité des peptides : en accord avec la masse attendue (ES-MS) Abréviations : Aa : Fmoc acide aminé Boc Tertiobutyloxycarbonyl DCM : Dichlorométhane DIEA : Diisopropyléthylamine DMF : Diméthylformamide EDT : Ethanedithiol ES-MS : Electrospray Mass Spectrometry Fmoc : 9-Fluorénylméthoxycarbonyl HATU : 0- (7-azabenzotriazol-1-yl)-1, 1, 3,3,-tétraméthyluronium hexafluorophosphate HBTU : 2- (lH-Benzotriazole-1-yl)-1, 1, 3,3-tétraméthyluronium hexafluorophosphate HOBt : Hydroxybenzotriazole NMP : N-méthyl-2-pyrrolidone Pmc : 2,2, 5,7, 8-Pentaméthyl-chroman-6-sulfonyl RP-HPLC : Reverse Phase-High Performance Liquide Chromatography TBu (OtBu) : Tertiobutyl

TFA : Trifluoroacetic acid Trt : Trityl Tableau 1 : Séquences des nonapeptides de la sous-unité P de l'hCG synthétisés (SEQ ID Nos. 3 à 159)

1 Le nombre mis entre parenthèse pour chacun des nonapeptides représente le numéro de la séquence SEQ ID identifié dans la liste des séquences ci-après.

Tableau II : Dénomination et séquences des nonapeptides issus de la modification du peptide ci-après dénommée 7.3 (SEQ ID No. 9) en position 1,2, 4,6 ou 9 (en caractères gras)

Dénominatioin du Séquence du nonapeptide SEQ ID No. nonapeptide 20.2 IMFQGLLLL 160 20. 3 LMFQGLLLL 161 20. 4 FMFQGLLLL 162 20. 5 KMFQGLLLL 163 20. 6 MMFQGLLLL 164 20. 7 YMFQGLLLL 165 20. 8 VMFQGLLLL 166 20. 9 ELFQGLLLL 167 20. 10 EMFKGLLLL 168 20. 11 EMFEGLLLL 169 20. 12 EMFQGVLLL 170 20. 13 EMFQGLLLV 171 Tableau III : Dénomination et séquences des nonapeptides de la sous-unité de l'hCG modifiés en position 1 par une tyrosine Dénomination Séquence du nonapeptide SEQ ID No. du nonapeptide YLQGVLPAL 10.15 172 (peptide 7.2 (SEQ ID No. 96) modifié en position 1) YLPGCPRGV 10.18 173 (peptide 8.6 (SEQ ID No. 50) modifié en position 1) Exemple 2 : Identification de peptides de la ßhGC se fixant sur les molécules HLA A2.

Afin de faire un criblage rapide des 157 nonapeptides synthétisés, ces derniers ont été évalués, dans un premier temps, par l'étude de leur capacité à se fixer au

complexe HLA A2, propriété necessaire à toute initiation d'une réponse immunitaire de type cytotoxique. Pour ce faire, la lignée cellulaire T2 a été utilisée.

La lignée T2 est une lignée lymphocytaire humaine correspondant à un hybride cellules T/cellules B, exprimant constitutivement HLA A2.

Ces cellules, déficientes en transporteur TAP, expriment peu de molécules HLA A2 à leur surface. En absence de peptide, le complexe HLA A2-p2 microglobuline est en permanence recyclé dans la cellule et un niveau basal de complexe est observé à la surface de la cellule. La présence d'un peptide exogène se fixant sur les molécules HLA A2 stabilise le complexe plus ou moins longtemps, en fonction de son affinité, empêchant la réintemalisation des molécules HLA A2 et induisant ainsi une augmentation du nombre de molécules HLA A2 à la surface de la cellule T2.

Les 157 nonapeptides de la protéine p-hCG ont été testés pour leur capacité à induire une stabilisation des molécules HLA A2 à la surface des cellules T2.

Les résultats (tableau IV) montrent que 7 peptides natifs parmi les 157 synthétisés sont capables d'induire une augmentation de l'expression de HLA A2 à la surface des cellules T2.

Ces peptides sont : 7.2 ; 7.3 ; 7.11 ; 7.38 ; 8.6 ; 13.16 et 13.17.

Le tableau IV présente également 4 peptides mutés (les résidus mutés sont figurés en gras), le 20.7, 20.4, 20.2 (peptides mutés du 7.3) et 10.18 (peptide muté du 8.6) dont l'activité est significativement augmentée par rapport aux peptides natifs.

L'augmentation de l'expression de HLA A2 induite par les peptides de p-hCG a été comparée à celle induite par le peptide de référence Flu MlSg 66. Tableau IV : peptides de la P-hCG se fixant sur les molécules HLA A2 des cellules T2 Dénomination Séquence SEQ ID No. HLA A2 (MFI) des peptides 7.2 VLQGVLPAL 96 426 7. 3 EMFQGLLLL 9 198 20. 7 YMFQGLLLL 165 362 20. 4 FMFQGLLLL 162 348 20. 2 IMFQGLLLL 160 359 7. 11 KAPPPSLPS 104 211 7. 38 TMTRVLQGV 72 408 8. 6 RLPGCPRGV 50 343 10. 18 YLPGCPRGV 173 465 13. 16 RVLQGVLPA 90 222 13. 17 GVLPALPQV 19 527 Flu Mlss 66 GILGFVFTL 174 500

Exemple 3 : Mesure de la sécrétion de IFN-y par les lymphocytes T humain, induite par les peptides de la p-hCG Les peptides positifs, décrits dans le tableau IV ont ensuite été testés sur des cellules T cytotoxiques CD8+ de patients cancéreux, pour leur capacité à induire une sécrétion d'interféron y par ces cellules.

Brièvement, 106 cellules de sang périphérique, obtenues après Ficoll sont reprises en RPMI-10 % SVF dans des tubes de 15 ml en polypropylène et mises en présence de 100 u. l de peptide à tester, à une concentration de 10 Lg/ml (solution mère à 4 mg/ml) pendant 2 h à 37°C dans un incubateur. Huit cents microlitres de RPMI-10 % SVF contenant 12, 5 ug/ml de Bréfeldine A, bloquant la sécrétion de cytokines, sont ajoutés puis les tubes sont replacés pendant 4 heures dans l'incubateur, à 37°C.

A la fin de la période d'incubation, 100 ul de PBS-EDTA 20 mM froid sont ajoutés puis après 5 minutes, les cellules sont centrifugées et remises en suspension dans

100 u. l de PBS-1 % BSA-0,01 % NaN3, contenant 0,7 pl d'anticorps anti-CD8 couplé à l'allophycocyanine (APC).

Après transfert en plaque 96 puits à fonds coniques, les cellules sont incubées 20 minutes à 4°C puis fixées 10 minutes, à l'obscurité, à température ambiante avec 100 Ill de paraformaldéhyde (PFA) 2 % dans du PBS. Après deux lavages en PBS, 50 ni de PBS-Hepes 1 mM-Saponine 0,1 %, contenant 0,4 lil d'anticorps anti-IFN-y couplé au FITC (solution mère à 0,5 mg/ml) sont ajoutés sur les culots cellulaires, dans chaque puits. Après 30 minutes d'incubation à 4°C, les cellules sont lavées deux fois puis transférées dans des tubes Micronic, pour une analyse par cytométrie en flux.

L'analyse des 7 peptides de la p-hCG, sélectionnés sur les cellules T2, a montré chez une patiente, atteint d'un cancer du sein, une fréquence de cellules T CD8 sécrétant de l'IFN-y plus élevée, lorsque les cellules étaient incubées avec le peptide 7.3 (EMFQGLLLL, SEQ ID No. 9).

L'analyse par cytométrie en flux de la sécrétion de l'IFN-y par les lymphocytes T CD8, présentée dans les figures 1A et 1B, montre qu'en présence du peptide 7.3, 0,31 % des lymphocytes T CD8 sécrètent de l'IFN-y (figure 1B) alors qu'en présence d'un peptide irrelevant, 0,03 % des T CD8 sont positifs en sécrétion d'IFN-y (figure 1A).

Exemple 4 : Vérification de l'activité CTL des peptides décrits dans le tableau IV dans un modèle de souris transgéniques HLA A2/kb.

Parallèlement aux mesures d'interféron y chez les patients, chacun des peptides décrits ci-dessus dans le tableau IV et, certains de leurs analogues, ont été testés pour l'induction d'une réponse de type cytotoxique (CTL) chez la souris HLA A2/Kb. Pour ce faire, ces peptides ont été administrés individuellement, par voie sous cutanée. Deux injections constituées de 100 llg de peptide + 300 ig de P40 ont été effectuées, en présence d'adjuvant incomplet de Freund (AFI) (mélange volume à volume), à une semaine d'intervalle. Dix jours après la dernière injection, les cellules des ganglions inguinaux et para aortiques sont mises en culture en présence d'IL2 et de cellules présentatrices fixées et chargées avec le peptide à tester. Sept jours après cette première stimulation, une seconde stimulation des cellules effectrices est effectuée suivie, après 5 jours d'une évaluation de l'activité cytotoxique par un test de relarguage de"Cr. Ce test

consiste à incuber des cellules EL4 A2/kb chargées avec le peptide avec différents ratio de cellules effectrices issues de la mise en culture et d'évaluer l'activité cytotoxique de ces cellules effectrices par calcul de la quantité de slCr relarguée par les cellules cibles lors de leur lyse par les cellules effectrices selon la formule : (lyse des cellules cibles chargées-lyse spontanée)/ (lyse totale des cellules cibles chargées-lyse spontanée) x 100.

Dans cette formule, la lyse des cellules cibles correspond pour chaque ratio à la mise en contact des cellules cibles et des cellules effectrices ; la lyse spontanée correspond au relarguage spontané de slCr des cellules cibles en absence de toute autre cellule et la lyse totale correspond au relarguage maximum de 5lCr lors d'une lyse de la totalité des cellules cibles par addition de triton XI 00.

Afin de déterminer la spécificité de la réaction, un témoin est effectué en remplaçant les cellules cibles chargées avec le peptide par des cellules cibles non chargées qui ne doivent donc pas être reconnues par les cellules effectrices et par conséquent ne doivent pas être lysées par ces dernières.

Par ailleurs, les souris HLA A2/Kb étant des souris chimériques pour le complexe d'histocompatibilité de classe I, l'expérience ci-dessus a également été répétée sur des souris C57/B16 d'haplotype Kb afin de vérifier la part de la participation du classe 1 murin dans la présentation des peptides.

Les figures 2A à 2E et 3A à 3E ci-après montrent que parmi tous les peptides testés, seul un peptide natif, le 7.3 est capable de générer une réponse CTL significative chez les souris HLA A2 Kb (figure 2A). Les résultats obtenus avec le peptide 7.3 sont en parfait accord avec ceux observés chez l'une des patientes testées dans l'exemple 3.

Il faut cependant noter que ce peptide semble également capable d'être reconnu dans le contexte du classe 1 murin puisque l'induction d'une réponse CTL est observée chez la souris C57/B16 (figure 2B). Des peptides dérivés du 7.3 ont également été testés (figures 2C, 2D, 2E). Il s'agit des peptides 20.2, 20.4 et 20.7 modifiés en position 1 par remplacement du résidu acide glutamique par l'isoleucine, la phénylalanine et la tyrosine respectivement. Les données présentées dans les figures 2C, 2D et 2E montrent que le remplacement du glutamate par la tyrosine en position 1 (peptide 20.7) augmente significativement l'induction de la réponse cytotoxique du peptide muté par rapport au

peptide natif. Le remplacement du glutamate par la phénylalanine en position 1 (peptide 20.4) est sans effet sur la cinétique et l'intensité de la réponse CTL. En revanche, la substitution du glutamate par l'isoleucine (peptide 20.2) semble avoir un effet négatif sur l'induction de la réponse cytotoxique.

Un intérêt tout particulier a été apporté au peptide 8.6 qui, sous sa forme native n'est pas capable de générer une réponse cytotoxique, quel que soit le type de souris utilisé (figures 3A et 3B), mais qui en revanche sous sa forme mutée en position 1 (peptide 10.18, figures 3C et 3D) induit des réponses CTL fortes chez la souris HLA A2/Kb et nulles chez la souris C57/B16. L'importance particulière du peptide 10.18 réside en fait dans l'observation que des cellules effectrices issues de souris immunisées par ce peptide muté sont capables de lyser des cellules cibles chargées par le peptide natif 8.6. (figure 3E). Il est à noter que dans le cas du 8.6 comme dans le cas du 7.3, la présence d'une tyrosine en position 1 semble apporter un bénéfice particulier à l'induction de la réponse cytotoxique. Ces résultats sont en accord avec les données de la littérature publiées par l'équipe de Hans-gehorg Rammensee et al. (Immunogenetics, 41,178-228, 1995)