Epidermale Langerhans-Zellen (LC) gehören zur Familie der dendritischen Zellen (DC) des Blutes, die ein wesentlicher Bestandteil des peripheren Immunsystems sind (Simon, J. C. et al., Hautarzt43 : 241-249,1992). Durch ihre exponierte Lage in der Haut oder anderen peripheren Organen bilden sie die"Wachposten des Immunsystems" (Simon, J. C. et al., 1992,/oc. c//.).

Sie gehören zu den potentesten Immunzellen des Säugetiers bzw. des menschlichen Organis- mus und haben als einzige die Fähigkeit, primäre T-Zell-vermittelte Immunreaktionen einzu- leiten. Beispiele für solche Immunreaktionen sind Allergien vom verzögerten Typ, Tiansplan- tationsabstoßungen, sowie gegen Viren oder Tumoren gerichtete Immunantworten (Grabbe, S. et al., Immunology Today 16 : 117-121,1995 ; Moll, H., The immunefunctions of epidermal Langerhans cells, Heidelberg : Springer Verlag, 1995 ; Steinmann, R. M. et al., Adl. Exp. AAled.

Biol. 329 : 1-9-, 1993 ; Schuler, G. et al., Adv. Exp. Med. Biol. 329 : 243-249,1993).

Voraussetzung fiir diese Immunfunktion der LC/DC ist ihre Wanderung von der Haut oder von anderen Organen in die peripheren Lymphknoten (Romani, N. et al., J. Exp. Med 180 : 83-93, 1994 ; Kripke, M. L. et al., J. Immunol. 145 : 2833-2838,1990 ; Cumberbatch, M. et al., Immu- nology 81 : 395-401,1994). Dort haften sie in distinkten anatomischen Regionen an, den songez nannten parakortikalen T-Zell-Arealen, wo sie Antigen-spezifische ruhende"naive"T-Lym- phozyten aktivieren. Die Mechanismen, welche diese gerichtete Wanderung und Anheftung blockieren sind nicht bekannt.

Wegen ihrer außergewöhnlichen Fähigkeit, Immunantworten einzuleiten, werden auf3erhalb des Körpers hergestellte dendritische Zellen seit kurzem auch als Immuntherapeutika, zum Beispiel bei bestimmten Tumoren, eingesetzt (Grabbe, S. et al., 1995, loc. cit.). Jedoch erreichen die durch die bekannten Verfahren hergestellten DC nur selten die peripheren Lymphknoten, in denen sie eine Immunantwort auslösen können, sodaß die nach dem Stand der Technik ex vivo hergestellten DC nicht in dem gewünschten Maße als Immuntherapeutika wirksam sind.

Das Oberflächen Glykoprotein CD44 ist von zentraler Bedeutung fiir die Wanderung von akti- vierten Immunzellen und bestimmten Tumorzellen in die peripheren Lymphknoten (Zahalka, M. A. et al., J. Immunol. 154 : 5345-5355, 1995 ; Jalkanen, S. et al., J. Cell. Biol. 105 : 983-990, 1987 ; Seiter, S. et al., J. Exp. Med. 177 : 443-455,1993 ; Thomas, L. et al., J. InvesL DermatoL 100 : 115-200,1993 ; Thomas, L. et al., J. Cell. Biol. 118 : 971-977,1992). Ob CD44 und/oder dessen Isoformen für die Wanderung von LC und DC und ihre Anheftung an Lymphknoten sowie ihre Immunfunktion eine Rolle spielen, ist unbekannt. z Die DNA-und Aminosäuresequenz von der konstanten Form bzw. Standardform von CD44 des Menschen und verschiedener Tiere sind beschrieben, bespielsweise in Tölg, C. et al., Nucl.

Acids Res. 21 : 1225-1229,1993 ; Screaton, G. R. et al., Proc. Natl. Acad.-Sci. USA 89 : 12160- 12164,1992 ; Stamenkovic, I. et al., The EMBO Journal 10 : 343-348,1991 ; Günthert, U. et al., Cell 65 : 13-24,1991 ; Stamenkovic, I. et al., Cell 56 : 1057-1062,1991).

Bei CD44 handelt es sich um ein auf der Zelloberflächc lokalisiertes Glykoprotein, welches ursprünglich als"lymphocyte homing receptor"beschrieben wurde (Screaton, G. R. et al, 1992, loc. cit.). Es soll bei der Adhäsion von Lymphocyten an bestimmten mucösen Endothel- zellen von Venen (Peyer's patch oder Peyer-Plaques bzw. Folliculi lymphatici aggregati) bzw. postkapillaren Venen der Lymphknoten beteiligt sein (Jalkanen S. T. et al., Eur. J. Immunol.

16 : 1195-1202,1986 ; Camp, R. L. et al., J. Exp. Med. 173 : 763-766,1991). Darüber hinaus wird dem CD44 Glykoprotein eine Beteiligung bei der Reifung und Aktivierung von Lymphozyten zugeschrieben bzw. einen die erhöhte Migrationsfähigkeit aller Lymphoblasten (mit-) bedingen- den Effekt (z. B. Camp, R. L. et al., 1991, loc. cit ; Huet, S. et al., J. Immunol. 143 : 798-801, 1989) und soll eine Rolle als Ankerstelle für andere Adhäsionsmoleküle spielen (Shimizu, Y. et al., J. Immunol. 143 : 2457-2463,1989). Bis heute sind jedoch nicht alle diese Funktionen von CD44 eindeutig geklärt.

Es konnte bei Ratten-Tumorzellen, die über das lymphatische System metastasieren (BSp73- Zellen eines spontanen Ratten Pankreas-Adenokarzinoms), festgestellt werden, daß diese Zel- len Varianten von CD44 (vCD44) exprimieren und für die Verbreitung ("trafficking") von Tu- morzellen verantwortlich sind. An anderen Tumorzellinien konnten ebenfalls diese Verhältnisse nachgewiesen werden.

Es konnte ferner gezeigt werden, daß dieses vCD44 Glykoprotein einen a priori nicht metasta- sierenden Tumor Metastasefähigkeiten verleiht, während die Standardfrom von CD44 (sCD44) dazu nicht in der Lage ist. Somit kann heute davon ausgegangen werden, daß vCD44 gegen- über sCD44 ein metastasespezifisches Protein ist, welches Tumoren die Fähigkeit verleiht, über die Lymphbahnen zu metastasieren (Günthert, U. et al., 1991, loc. cit.).

Die weitere Aufklärung des vCD44 Glykoproteins der Ratte bis hin zur endgültigen Charakte- risierung der DNA-und Aminosäuresequenz gelang Günthert, U. et al., 1991, loc. cit., anhand des BSp73-Rattenzellsystems, welches aus zwei morphologisch bzw. phenotypisch verschiede- nen syngenen Zellvarianten besteht : einer nichtmetastasierenden Variante AS (BSp73AS) und einer metastasierenden Variante ASML (BSp73ASML) (Matzku, S. et al., Cancer Re. search 49 : 1294-1299,1989).

Zu diesem Zweck wurden monoklonale Antikörper (mAbs) hergestellt, die die antigene Deter- minante auf der metastasierenden Variante BSp73ASML erkennen.

Sowohl aus dem Primärtumor (subcutaner nicht-metastasierender Knoten bestehend aus BSp73AS-Zellen) als auch einer Metastase davon (BSp73ASML-Zellen, welche in Lymphknoten und Lunge metastasieren) wurden Zellinien gewonnen. Es wurden mAbs herge- stellt, die gegen die Membranproteine von BSp73ASML-Zellen gerichtet sind (Matzku, S. et al., 1989, loc. cit.). Einer von diesen mAbs, der nur Epitope auf BSp73ASML-, nicht jedoch solche auf BSp73AS-Zellen oder anderen nicht-tumorogenen Zellen erkennt, wurde dazu be- nutzt, um eine E. coli cDNA-Expressionsbibliothek, hergestellt aus poly (A) +RNA von BSp73ASML-Zellen und einem geeigneten Vektorsystem, zu durchsuchen. Auf diesem Weg konnte ein Klon identifiziert werden (pMeta-1) der die vollständige cDNA mit einer Lange von 3207 bp enthält und welche für eine zusätzliche Domäne von 162 Aminosäuren codiert. Diese Domäne ist weder in sCD44-Zellen noch in anderen nicht-metastasierenden Tumorzellen zu finden und enthält die mAb spezifische Epitop-codierende Region. Anhand von mRNA Präpa- rationen aus Zellen verschiedener Geweben und damit durchgeführter mRNA : DNA Hybridisie- rungen mit unterschiedlichen von den cDNA Klonen erhaltenen DNA Proben war festzustellen, daß vCD44 eine Spleiß-Variante von sCD44 darstellt und daß die Expression der vCD44 RNAs mit der Entstehung von Metastasen einhergeht. Damit steht fest, daß die durch die 486 bp lange Insertion codierte zusätzliche extrazelluläre Domäne (Aminosäuren 224 bis 385 in pMeta-1) der metastasenrelevante Anteil des Oberflächenglykoproteins vCD44 ist (Matzku, S. et al., 1989, loc. cit.).

Das metastatische Tumorwachstum (Adenokarzinom der Ratte) konnte nach Immunisierung mit monoklonalen Antikörpern, die das vorgenannte Epitop erkennen bzw. die spezifisch mit diesen extrazellulären Bereich von vCD44 reagieren, unterdrückt werden (Reber, S. et al., Int.

J. Cancer 46 : 919-927,1990).

Die Identifizierung dieser varianten extrazellulären Domäne in der Ratte (pMeta-1 bzw. rMeta- 1) ermöglichte, auch die dazu äquivalenten menschlichen Nukleotid-und Aminosäure-Sequen- zen aufzuklären :

Es wurde kürzlich gezeigt, daß die Expression von Varianten des Oberflächen-Glykoproteins CD44 notwendig und hinreichend ist, um sogenanntes spontanes metastatisches Verhalten so- wohl in einer nicht-metastasierenden Pankreas-Adenokarzinom-Zellinie der Ratte als auch in einer nicht-metastasierenden Fibrosarkom-Zellinie der Ratte auszulösen (Günthert, U. et al., 1991, loc. cit.). Während die kleinste CD44-Isoform, die Standardform sCD44, in einer Reihe verschiedener Gewebe, darunter Epithelzellen, ubiquitär exprimiert wird, werden bestimmte Spleißvarianten von CD44 (vCD44) nur auf einer Untergmppe von Epithelzellen exprimiert" Die CD44-Isoformen werden durch alternatives Spleißen so erzeugt, daß die Sequenzen von 10 Exons (vl-v10) in sCD44 komplett ausgeschnitten werden, jedoch bei den größeren Vari- anten in verschiedenen Kombinationen vorkommen können (Screaton, G. R. et al., 1992, loc. ciL ; Heider, K.-H. et al., J. Cell. Biol. 120 : 227-233,1993 ; Hofmann, M. et al., Cancer Res.

51 : 5292-5297,1991). Die Varianten unterscheiden sich dadurch, daß an einer bestimmten Stelle des extrazellulären Teils des Proteins unterschiedliche Aminosäuresequenzen inseriert sind. Solche Varianten konnten in verschiedenen menschlichen Tumorzellen und in menschli- chem Tumorgewebe nachgewiesen werden. So wurde kürzlich die Expression von CD44-Vari- anten im Verlauf der kolorektalen Karzinogenese untersucht (eider, K.-H. et al., 1993, loc. cit.). Die Expression von CD44-Varianten fehlt in normalem menschlichem Gewebe (z. B. Ko- lonepithel), und nur eine schwache Expression ist in den proliferierenden Zellen der Krypten nachweisbar. In späteren Stadien der Tumorprogression, z. B. in Adenokarzinomen, exprimie- ren alle malignen Entartungen Varianten von CD44. Weiter wurde kürzlich die Expression von CD44-Spleißvarianten in aktivierten Lymphozyten sowie in Non-Hodgkin-Lymphomen gezeigt (Koopman, G. et al., J. Exp. Med. 177 : 897-904,1993).

In der Publikation von Tölg, C. et al., Nucleic Acids Res. 21 (5) : 1225-1229,1993, wird be- schrieben, daß CD44 in verschiedenen Isoformen vorkommt. Die Aminosäuresequenzen von zehn verschiedenen Exons vl bis v 10 der Maus, Ratte und des Menschen werden offenbart : Die Aminosäure-Sequenz von Exon v4 von human vCD44 lautet (Einbuchstaben-Code) : ISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSNPEVLLLQTTTRMT Die Aminosäures-Sequenz von Exon v5 von human vCD44 lautet (Einbuchstaben-Code) : DVDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHMHHEEEETPHSTST Die Aminosäure-Sequenz von Exon v6 von human vCD44 lautet (Einbuchstaben-Code) : QATPS STTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTA

Die Aminosäure-Sequenz von Exon v9 von human vCD44 lautet (Einbuchstaben-Code) : QQSNSQSFSTSHEGLEEDKDHPTTSTLTSS Die WO 91/17248 beschreibt die Verwendung von anti-vCD44 Antikörper für die Therapie und Diagnostik von Tumoren. Die WO 95/00851 betrifft die Verwendung von gegen variante Exons von CD44 gerichtete Antikörper für die Diagnose und Analyse von Tumoren. In der WO 95/04547 wird die Verwendung von solchen Antikörpern für immuntherapeutische und immunszintigraphische Zwecke beschrieben, die insbesondere gegen das variante Exon v5 ge- richtet sind. Die WO 95/33771 beschreibt Antikörper gegen variantes Exon v6 von CD44. In der EP-A 0 538 754 wird die Verwendung von gegen variantes CD44 (vCD44) gerichtete An- tikörper für die Immunsuppression beschrieben.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung von Mitteln zu Behandlung be- stimmter Tumore und zur Unterdrückung von Immunantworten und die Entwicklung von Verfahren zur Herstellung solcher Mittel.

Die Aufgabe konnte mit der vorliegenden Erfindung im Rahmen der Beschreibung und der Patentansprüche gelöst werden, indem einerseits Antikörper gegen den konstanten Teil von CD44 (Standardform, sCD44) und/oder gegen die variante Formen von CD44 (vCD44) ver- wendet werden, um maligne Erkrankungen, die mit einer Entartung und Aktivierung von Lan- gerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) assoziiert sind, zu therapieren und in dem andererseits Antikörper gegen den konstanten Teil von CD44 (sCD44) verwendet wer- den, um unerwünschte oder überschießende Immunreaktionen zu unterdrücken und dadurch bedingte Erkrankungen und Ereignisse zu therapieren bzw. positiv zu beeinflussen.

In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung werden nach bestimmten Verfahren her- gestellte dendritische Zellen (DC) dazu verwendet, in vivo Immunreaktionen auszulösen oder einzuleiten, um beispielsweise eine adoptive Immuntherapie durchzuführen.

In diesem Zusammenhang wird auch ein ex vivo Kultivierverfahren zur Herstellung dendriti- scher Zellen, die vorzugsweise in periphere Lymphknoten einwandern, von der vorliegenden Erfindung umfaßt.

Mit einem solchen Kultivierungsverfahren wird auch die Aufgabe gelöst, dendritische Zellen mit der Fähigkeit auszustatten, gezielt in die peripheren Lymphknoten einzuwandern, dort in den T-Zell-Arealen zu haften und eine T-Zell-vermittelte Immunreaktion einzuleiten. Dies hat große Bedeutung fUr die Verwendung solcher dendritischer Zellen für immuntherapeutische Zwecke.

Als bevorzugte Antikörper kommen für die genannten, erfindungsgemäßen Verwendungen solche in Betracht, die mit Epitopen des N-terminalen Anteils des konstanten Teils von CD44 (sCD44) reagieren oder die Epitope, die durch die Varianten Exons v4, v5, v6 oder v9 kodiert werden, erkennen, wovon Antikörper gegen v6 ganz bevorzugt sind. Unter N-terminalem An- teil des konstanten Teils von CD44 sollen der Anteil des Proteins verstanden werden, der durch die konstanten Exons 1 bis 5 des CD44-Gens gemäß der Publikation von Screaton et 9-.

(Screaton G R et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 12160-12164,1992) kodiert wird. Insbe- sondere sind Antikörper bevorzugt, die spezifisch an ein Epitop binden, das durch Exon 2,3,4 und/oder 5 kodiert wird.

Beispielsweise kommen die monoklonalen Antikörper BU-52 (The Binding Site, Birmingham, England, Cat. No. MC114 ; Messadi, D. V and Bertolami, C. N., Am J. Pathol. 142 : 1041-1049, 1993 ; Spring, F. A. et al., In : Leucocyte typing V ; white cell diXferenfiation antigens, Schloss- man, S. F., Boumsell, L., Gilks, W., Harlan, J. M., Kishimoto, T., Morimoto C., Ritz, J. and Shaw, S. (Ed.), Oxford, New York, Tokyo : Oxford University Press, 1995), SFF-2 (Boehrin- ger Ingelheim Bioproducts, Cat. No. BMS113) oder MEM-85 (Boehringer Ingelheim Biopro- ducts, Cat. No. BMS5033FI. 01 ; Bazil, V. et al., Folia Biologica 35 (5) : 289-297,1989 ; Spring, F. A. et al., In : Leucocyte typing V, white cell differentiation antigens, Schlossman, S. F., Bo- umsell, L., Gilks, W., Harlan, J. M., Kishimoto, T., Morimoto C., Ritz, J. and Shaw, S. (Ed.), Oxford, New York, Tokyo : Oxford University Press, 1995) in Betracht, welche Epitope des N- terminalen Anteils des konstanten Teils von CD44 erkennen.

Ein bevorzugter Antikörper gegen den N-terminalen Anteil des konstanten Teils von CD44 (sCD44) ist der monoklonale Antikörper SFF-2, der von einer Hybridom-Zellinie sezerniert wird, die am 16.04.1997 unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2305 bei der DSM- Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D- 38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt wurde, oder Derivate dieses Antikörpers.

Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifR demzufolge die Verwendung von anti-sCD44 und/oder anti-vDC44 Antikörpern zur Herstellung einer Präparation für die prophylaktische und therapeutische Behandlung von malignen Erkrankungen, die mit einer Entartung, Aktivie- rung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) assoziiert sind. Beispielsweise Langerhans-Zell-Histiozytosen, Histiozytose X, Abt-Let- terer-Siewe-Syndrom, eosinophiles Granulom (Simon, J. C. et al., Hautarzt 43 : 241-249,1992).

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in der erfindungsgemäßen Verwendung von anti-sCD44 Antikörpern, welche N-terminale Epitope von sCD44, oder Teilen davon, erkennen, zur Herstellung einer Präparation für die prophylaktische und therapeutische Be-

handlung von malignen Erkrankungen, die mit einer Entartung, Aktivierung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) assoziiert sind.

Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung liegt in den oben genannten erfindungs- gemäßen Verwendungen von anti-sCD44 Antikörpern, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon sind.

In einem zusätzlichen Aspekt wird von der vorliegenden Erfindung die Verwendung von Anti- körpern, die gegen Epitope gerichtet sind, die durch variante Exons von vCD44 oder Teilen davon kodiert werden, zur Herstellung einer Präparation für die prophylaktische und therapeu- tische Behandlung von malignen Erkrankungen, die mit einer Entartung, Aktivierung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendritischen Zellen (DC) asso- ziiert sind, umEal3t.

In einer besonderen Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung die Verwendung von Antikörpern, die gegen Epitope gerichtet sind, die durch die Varianten Exons v4, v5, v6 und/oder v9 oder Teilen davon kodiert werden, zur Herstellung einer Präparation für die pro- phylaktische und therapeutische Behandlung von malignen Erkrankungen, die mit einer Entar- tung, Aktivierung oder massiven Vermehrung von Langerhans Zellen (LC) und/oder dendriti- schen Zellen (DC) assoziiert sind.

Insbesondere werden von der Erfindung die genannnte Verwendung von Antikörpern umfaßt, die mit den folgenden Aminosäuresequenzen oder Teilen davon zu reagieren vermögen : ISTTPRAFDHTKQNQDWTQWNPSHSNPEVLLLQTTTRMT DVDRNGTTAYEGNWNPEAHPPLIHHEHHEEEETPHSTST <BR> <BR> QATPSSTTEETATQKEQWFGNRWHEGYRQTPREDSHSTTGTA<BR> QQSNSQSFSTSHEGLEEDKDHPTTSTLTS S In einer weiteren besonderen Ausfiihrungsform werden für den genannten erfindungsgemäßen Zweck monoklonale Antikörper umfaßt, sowie Fragmente und Derivate davon.

In einer ganz besonderen Ausführungsform umfaßt die Erfindung die Verwendung des Anti- körpers VFF-18, der von einer Hybridom-Zellinie sezerniert wird, die am 7.6.1994 unter der Hinterlegungsnummer DSM ACC2174 bei der DSM-Deutsche Sammlung für Mikroorganis- men und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, Deutschland, hinterlegt wurde (WO 95/33771), oder Derivate dieses Antikörpers.

Ein zusätzlicher Aspekt der vorliegenden Erfindung betriffl die Verwendung von anti-sCD44 Antikörpern zur Herstellung einer Präparation für die Unterdrückung oder Linderung uner- wünschter oder überschießender Immunreaktionen für die Therapie oder Prophylaxe dadurch bedingter Erkrankungen oder um damit verbundene Ereignisse positiv zu beeinflussen.

Demzufolge umfaßt die Verwendung von anti-sCD44 Antikörpern alle diejenigen Erkrankun- gen und Zustände eines Säugetierorganismus, denen eine immunregulatorische Störung oder eine unerwünschte oder überschießende Immunreaktion zugrundeliegt, wie beispielsweise all- ergische Erkrankungen, insbesondere Allergien vom verzögerten Typ, Abstoßungen von Haut- oder Organtransplantaten, Autoimmunerkrankungen, Erkrankungen des rheumatischen For- menkreises, Multiple Sklerose, Psoriasis oder atopische Dermatitis.

Für diesen Zweck eignen sich die beschriebenen anti-sCD44 Antikörper sowohl für prophylak- tische Maßnahmen als auch für therapeutische Behandlungen.

In einem zusätzlichen Aspekt werden erfindungsgemäß monoklonale anti-sCD44 Antikörper für die oben genannten Verwendungen zur Beeinflussung von Immunreaktionen im Sinne pro- phylaktischer und therapeutischer Behandlungen umfaßt, wobei die Antikörper monoklonale Antikörper oder Fragmente oder Derivate davon sind.

In einer besonderen. Nusführungsform werden für die oben genannnten Verwendungen zur Beeinflussung von Immunreaktionen der gegen den durch v6 kodierten Epitop, oder Teilen davon, gerichtete Antikörper VFF-18 und solchen Antikörpern, die mit den von VFF-18 er- kannten Epitop oder Teilen davon zu reagieren vermögen, umfaßt.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Herstellung von dendritischen Zel- len und deren Verwendung zur Auslösung oder Einleitung einer Immunreaktionen in vivo für die Immuntherapie, insbesondere die adoptive Immuntherapie, beispielsweise die adoptive Im- muntherapie von Tumoren oder Viruserkrankungen.

Es wurde gefunden, daß im Verlauf ihrer Wanderung in die Lymphknoten LC und DC ihre Expression von CD44 Isoformen modulieren. Im Einzelnen kommt es zu einer Aufregulierung von Epitopen im N-terminalen konstanten Teil von CD44 sowie von Epitopen, die durch die varianten Exons v4, v5, v6 und v9 kodiert werden. Es wurde ferner gefunden, daß die stadien- hafte Modulation von CD44-Isoformen von großer Bedeutung für die Immunfunktion der LC und der DC sind. Erfindungsmäßig wurde nämlich festgestellt, daß die Aktivierung und Aus- wanderung von LC aus der Epidermis durch Antikörper, insbesondere monoklonale Antikör- per, gegen N-terminale Epitope im konstanten Teil von CD44 (sCD44), vollständig verhindert werden kann. Ferner wurde überraschenderweise gefunden, daß die spezifische Anheftung von

LC und DC in den T-Zell-Arealen der peripheren Lymphknoten durch Antikorper, welche Epitope auf varianten Exons, beispielsweise v6 bzw. CD44v6 (zum Beispiel VFF18, offenbart beispielsweise in der WO 95/33771), erkennen, vollständig inhibiert werden kann. Es konnte aber auch festgestellt werden, daß gegen ein N-terminales Epitop im konstanten Teil von CD44 (sCD44) gerichtete Antikörper die Adhäsion ebenfalls blockierte, wenn auch in geringe- rem Ausmaß gegenüber der Reaktion von Antikörpern gegen variante Exons.

Im Mausmodell konnte bestätigt werden, daß eine systemische Gabe von Antikörpern, insbe- sondere monoklonalen Antikörpern, gegen variante Epitope von CD44, beispielsweise CD44v6, die Fähigkeit von LC und DC hemmen, eine Allergie gegenüber einem Hapten, bei- spielsweise 2,4-Dinitrofluorbenzol, auszulösen. Diese Antikörper waren auch wirksam, wenn die Allergie bereits bestand. Überraschenderweise wurde gefunden, daß hier neben den CD44v6-spezifischen monoklonalen Antikörpern auch Antikörper gegen N-terminale Epitope des konstanten Teils von CD44 (sCD44) wirksam waren. Insofern eröffnet sich mit der Ver- wendung von gegen sCD44 gerichteten Antikörper sowohl eine prophylaktische als auch eine therapeutische Behandlung von Immunprozessen in vivo.

In einem entwickelten Zellkulturverfahren konnten DC hergestellt werden, die in periphere Lymphknoten einwandern und dort präferentiell in den T-Zell-Arealen anheften. Das Verfahren beruht erfindungsgemäß darauI ; daß Monozyten aus dem peripheren Blut von gesunden Blut- spendern oder von Patienten mit malignen Tumoren, beispielsweise Melanomen, oder aus dem Knochenmark, isoliert werden und die daraus gewonnenen Zellen in einem geeigneten Kultur- medium, beispielsweise RPMI 1640, supplementiert mit Serum, Antibiotika, nicht-essentiellen Aminosäuren, einem Puffer, beispielsweise mit einem im Bereich von pH 6.0 und pH 8.5 akti- ven Puffer, insbesondere mit einem organischen Puffer, und mindestens einem Cytokin, für einige Tage kultiviert und anschließend isoliert werden.

In einer besonderen Ausführungsform ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß die wie oben beschriebenen isolierten Monocyten in einem Kulturmedium, bestehend aus RPMI 1640, fetales Kälberserum, Penicillin/Streptomycin, einem aus einer N-substituierten Aminosulfon- säure, beispielsweise Hepes [4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäure] bestehender Puffer, nicht-essentielle Aminosäuren, L-Glutamin, GM-CSF (granulocyte/macrophage colony- stimulating factor, beschrieben beispielsweise in der W086/03225 oder von Cantrell, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 6250-6254,1985), fur einige Tage kultiviert und anschlie- ßend isoliert werden.

In einer ganz besonderen, beispielhaften Ausführungsforrn ist das Verfahren dadurch gekenn- zeichnet, daß die wie oben beschriebenen isolierten Monocyten in einem Kulturmedium, beste- hend aus RPMI 1640,10% FCS (fetales Kälberserum), 45ig Penicillin/Streptomycin, 25 mM

Hepes, 1 mM nicht-essentielle Aminosäuren, 2 mM L-Glutamin, 50 ng/ml human GM-CSF, vorzugsweise rekombinanter human GM-CSF, und 1000 U/ml Interleukin-4 (IL-4) für 8 Tage kultiviert und anschließend isoliert werden.

Es konnte überraschenderweise festgestellt werden, daß nach dem erfindungsgemäßen Kulti- vierungsverfahren die Kultur aus > 90% dendritischen Zellen bestand, welche das gleiche CD44-Isoformmuster aufwiesen wie LC oder DC, die in vivo in Lymphknoten gewandert sind" Die erfindungsgemäß kultivierten DC binden wie aktivierte LC in den parakortikalen T-Zell- Arealen von Lymphknoten. Diese Bindung ließ sich durch Antikörper, die Epitope, die durch die variante Exons v4, v5, v6 oder v9 kodiert werden, beispielsweise durch den monoklonalen Antikörper VFF18, oder die mit Antikörper gegen den konstanten Teil von CD44 (Standard- form, sCD44 reagieren, vorzugsweise mit Antikörpern gegen Epitope des N-terminalen Anteils des konstanten Teils von CD44 (sCD44), blockieren.

Aufgrund dieser ex vivo hergestellten dendritischen Zellen kann in vorteilhafter Weise eine Immuntherapie, insbesondere die adoptive Immuntherapie, beispielsweise die adoptive Im- muntherapie von Tumoren oder Viruserkrankungen, in vitro durchgeführt werden. Eine derar- tige Immuntherapie beruht demzufolge darauf, daß das Wanderungsverhalten der aus dem Blut oder dem Knochenmark erfindungsgemäß hergestellten DC so beeinflußt wird, daß die erfin- dungsgemäßen dendritischen Zellen in die peripheren Lymphknoten einwandern, wo sie ge- wünschte Immunreaktionen einleiten. Mit diesen Zellen kann in vorteilhafter Weise die Immu- nogenität von DC bei einem Einsatz in der adoptiven Immuntherapie von entzündlichen, infek- tiösen, proliferativen oder hyperproliferativen Erkrankungen, beispielsweise Virus-oder Tu- morerkrankungen optimiert werden.

Da sowohl die DNA-als auch die Aminosäuresequenzen von sCD44 und von vCD44 bekannt sind, kann der Fachmann somit jedes beliebige variante vCD44 Glykoprotein oder variante Formen davon (vCD44) tierischer oder menschlicher Herkunft und die sie codierenden Nu- kleinsäuren (DNAs und RNAs) dazu benutzen, um beliebige gegen sCD44 oder varianten Formen davon (vCD44) gerichtete Antikõrper, insbesondere monoklonale Antikõrper, Frag- mente und Derivate davon, für die erfindungsgemãße Verwendung herzustellen und zu benut- zen.

Unter den der vorliegenden Erfindung zugrundeliegenden Begriffen sCD44 oder vCD44 sind Proteine oder Teile bzw. Epitope davon zu verstehen, die durch für sCD44 oder vCD44 codie- rende RNA, DNA oder Transkripte kodiert werden, einschließlich solche, die durch Mutatio- nen, beispielsweise durch Deletionen, Insertionen, Substitutionen, Inversionen, Transitionen, Transversionen verändert sind und solche, die mit den im Stand der Technik beschriebenen DNA Sequenzen, beispielsweise in Tölg, C. et al., Nucleic Acids Res. 21 (5) : 1225-1229,1993,

oder in Srceaton, G. R. et al., Proc. Natl. Acad.-Sci USA 89 : 12160-12164,1992, unter den bekannten konventionellen Bedingungen hybridisieren. Dabei ist unerheblich, ob die Herstel- lung und Isolierung dieser Nukleinsäuren konventionell über Zellkulturen, oder über DNA- Rekombination, über synthetische oder semisynthetische Verfahren erfolgt.

Unter den Begriffen sCD44 und vCD44 sind ferner im Rahmen der vorliegenden Erfindung alle jene vom Tier oder vom Menschen abstammenden Glykoproteine zu verstehen, unabhängige von ihrer Herstellung oder Isolierung über konventionelle Zellkulturen oder über DNA Re- kombination oder über synthetische oder semisynthetische Verfahren.

Unter dem Begriff Antikörper sind mono-oder polyvalente Antikörper und poly-und mono- klonale Antikörper zu verstehen, aber auch solche, die Fragmente davon darstellen und Deri- vate davon, einschließlich der F (ab') 2, Fab'und Fab Fragmente, aber auch chimäre Antikörper oder Hybridantikörper mit mindestens zwei Antigen-bzw. Epitopbindungsstellen, (beispiels- weise Quadrome, Trime), Interspecies-Hybridantikörper, anti-idiotypische Antikörper und solche davon, die chemisch modifiziert wurden und als Derivate dieser Antikörper zu verstehen sind und die entweder über die bekannten konventionellen Verfahren der Antikörpergewinnung oder über DNA-Rekombination (beispielsweise Diabodys), via Hybridomatechniken oder An- tikörper-Engineering oder synthetisch oder semisynthetisch nach an sich bekannter Weise her- stellbar sind und an Epitope von sCD44 oder vCD44 zu binden vermögen. Humanisierte Anti- körper können beispielsweise durch CDR-grafting (EP 0239400) hergestellt werden. Auch Framework-Regionen können modifiziert werden (EP 0519596 ; WO 9007861). Zur Huma- nisierung von Antikörpern können heute Methoden wie PCR (s. z. B. EP 0368684 ; EP 0438310 ; WO 9207075) oder Computer-modelling (s. z. B. WO 9222653) angewendet wer- den.. Auf die seit Köhler, G. & Milstein, C., Nature 256 : 495-497,1975 erschienene, dem Fachmann bekannte, vielfältige Literatur sei hingewiesen.

Hinsichtlich der Herstellung von polyklonalen Antikörpern gegen Epitope von sCD44 und vCD44 stehen eine Anzahl Verfahren zur Verfiigung. Es können z. B. fiir diesen Zweck in ah sich bekannter Weise verschiedene Tiere durch Injektion mit sCD44 oder vCD44, welche na- türlichen Ursprungs, über DNA-Rekombination oder synthetisch hergestellt sein kann, oder Fragmenten davon, immunisiert werden und aus den danach gewonnenen Seren die ge- wünschten polyklonalen Antikörper nach bekannten Methoden gewonnen und gereinigt wer- den. Als Alternative können auch intakte Zellen benutzt werden. Verschiedene Adjuvantien zur Erhöhung der Immunantwort auf die sCD44-oder vCD44-Gabe können, abhängig von dem für die Immunisierung ausgewählten Tier, ebenfalls verwendet werden-beispielsweise Freund's Adjuvant, Mineralgele wie z. B. Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen wie z. B. Polyanionen, Peptide, Olemulsionen, Hemocyanine, Dinitrophenol oder Lysolecithin.

Die für die erfindungsgemäße Verwendung bevorzugten monoklonalen Antikörper gegen ein Epitop von sCD44 oder ein Epitop von vCD44 können durch jede beliebige Technik erhalten werden, die für die Herstellung von Antikörpern über Kultivierung von Zellinien zur Vertu- gung stehen. Zu derartigen bekannten Techniken zählen z. B. die von Köhler, G. & Milstein, C., 1975, loc. cit., oder Taggart & Samiloff, Science 219, : 1228-1230,1983, beschriebenen Verfahren mit Hybridomazellen oder solche mit humanen B Zell Hybridomen (Kozbor et al.

Immunology Today 4, : 72-79,1983). Chimäre Antikörper gegen sCD44 oder vCD44 oder- Teilen davon können beispielsweise aus einer Maus-Antigen-Bindungsdomäne und humanen konstanten Regionen zusammengesetzt sein (Morrison, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, : 6851-6855,1984 ; Takeda, et al., Nature 314, : 452-454,1985).

Die Antikörper können nach bekannten Methoden gereinigt werden, beispielsweise über Im- munoabsorptions-oder Immunoaffinitatschromatographie, über HPLC (High Performance Liquid Chromatography) oder Kombinationen davon. Antikörper Fragmente, welche den Idiotyp des Moleküls enthalten, können gleichermaßen nach bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können F (ab') 2 Fragmente durch Pepsin Verdauung des vollständigen poly-oder monoklonalen Antikörpers erhalten werden. Fab'Fragmente können erhalten wer- den, indem beispielsweise die Disulfidbrücken des betreffenden F (ab') 2 Fragments reduziert werden und Fab Fragmente können hergestellt werden beispielsweise durch Behandlung der Antikörpermoleküle mit Papain und einem Reduktionsmittel.

Zur Identifzierung und Selektion von Antikorpern, Fragmenten oder Derivaten davon, die mit einem Epitop von sCD44 oder vCD44 reagieren, kann jedes bekannte Verfahren verwendet werden. Beispielsweise, indem die betreffenden Antikörper nach entsprechender Markierung dedektierbar sind, wenn sie an isoliertes oder gereinigtes sCD44 oder vCD44 oder Teilen da- von gebunden haben oder über Immunpräzipitation des z. B. über Polyacrylamidgele gereinigtes sCD44 oder vCD44, oder dadurch, daß Antikörper gegen sCD44 oder vCD44 mit anderen anti-sCD44 oder anti-vCD44 Antikorpern um das Binden an sCD44 oder vCD44 oder Teilen davon konkurrieren.

Von der Erfindung mitumEaßt wird aber auch die Verwendung von Hybridomzellinien zur Her- stellung der in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Antikörper enthaltenen Präparationen für den der Erfindung zugrundeliegenden Zwecken.

Auf weitere Einzelheiten betreffend die generelle Verwendung von monoklonalen Antikörpern zur Immunsuppression und bei Autoimmunkrankheiten, von Hybridantikörpern für therapeuti- sche Zwecke und über DNA Rekombination hergestellte Antikörper sei beispielsweise verwie- sen auf Progress in Allergy Vol. 45,"Monoclonal AntibodyTherapy", 1988 und auf die Arbeit von Seaman, W. E. et al., Ann. Rev. Med. 39, : 231-241,1988.

Das CD44 Glykoprotein (Standardform, sCD44) einschließlich seiner Isoformen und Varianten (vCD44, vl bis v10) sind sowohl für das Tier (z. B. Ratte, Maus) als auch für den Menschen hinsichtlich ihrer Stoffparameter (DNA-und Aminosäuresequenzen, Lokalisation innerhalb des kompletten für CD44 codierenden Gens) und ihrer Herstellung vollständig literaturbeschrieben, sodaß es dem Fachmann anhand dieser Offenbarung ermöglicht wird, beliebige Antikörper bzw. monklonale Antikörper oder Teile und Derivate davon im Sinne der oben angegebenen Definitionen für jedes auf diesem Proteinen lokalisierte Epitop herzustellen und sie erfindungs- gemäß zu benutzen, sodaß ihre Verwendung nicht auf bestimmte spezifische Antikörper oder die sie produzierenden Hybridzellinien beschränkt ist.

Generell können Präparationen mit derartigen Antikörpern Verwendung finden bei den in der vorliegenden Beschreibung dargestellten Tumorerkrankungen und Immunprozessen bei Tier und Mensch, die die Prãvention oder Prophylaxe, oder die therapeutische Behandlung umfas- sen.

Aufgrund ihrer erfindungsgemäß festgestellten immunsuppressiven Wirkung sind die bezeich- neten Antikörper bzw. die sie enthaltenen Präparationen zur Verhinderung und Behandlung von Krankheiten und Zuständen geeignet, die einer vorübergehenden oder dauerhaften Verrin- gerung oder Unterdrückung einer Immunantwort bedürfen.

Insbesondere erstreckt sich ihr Einsatz in vivo zur Therapie und Prophylaxe unerwünschter oder überschießenden, für den betreffenden Säugetierorganismus schädlicher Immunantworten durch Verhinderung von LC und DC, an T-Zell-Areale peripherer Lymphknoten anzudocken.

Beispielsweise zur Verhinderung oder Behandlung von Autoimmunkrankheiten, wie z. B. Er- krankungen des rheumatischen Formenkreises, Multiple Sclerose, Psoriasis, atopische Derma- titis, oder zur Verhinderung der Abstoßung von transplantierten Geweben oder Organen wie z. B. Niere, Herz, Lunge, Knochenmark, Milz, Cutis oder Cornea, bei unerwünschten Reaktio- nen während oder nach Transfusionen, von allergischen Erkrankungen, beispielsweise solchen, die den gastro-intestinalen Trakt betreffen und dort endzündlich manifest werden können, oder von endzündlichen, proliferativen und hyperproliferativen Erkrankungen und cutanen Manife- stationen immunologisch bedingter Erkrankungen, wie z. B. ekzematöse Dermatitiden, Urtica- ria, Vasculitiden, Sclerodermie.

Abhängig von der Art und Ursache der zu behandelnden Erkrankung oder Störung oder des zu beeinflussenden Zustands in einem tierischen oder menschlichen Körper kann es wünschens- wert sein, die Antikörperpräparation systemisch, lokal oder topisch an das oder in das betref- fende Gewebe oder Organ zu applizieren. Eine systemische Wirkungsweise ist beispielsweise dann erwünscht, wenn unterschiedliche Organe oder Organsysteme behandlungsbedürftig sind,

wie z. B. bei systemischen Autoimmunkrankheiten oder Allergien oder bei Transplantationen fremder, größerer Organe oder Gewebe oder aber bei schlecht lokalisierbaren Tumoren. Dem- gegenüber wäre eine lokale Wirkung in Betracht zu ziehen, wenn nur örtliche Manifestationen eines neoplastischen oder immunologischen Geschehens zu beeinflussen sind, wie beispiels- weise bei lokalen Tumorgeschehen, kleinflächigen Transplantationen von Cutis, und Cornea oder bei lokalen immunologischen Reaktionen, beispielsweise der Haut, zum Beispiel eine lo- kale Dermatitis.

Die betreffenden Antikörper können über jede dem Fachmann bekannte enterale oder parente- rale Applikationsroute verabreicht werden. Für die systemische Applikation bietet sich bei- spielsweise die intravenõse, intravaskulãre, intramuskulãre, intraarterielle, intraperitoneale, orale oder intrathecale Route an. Eine eher lokale Verabreichung kann beispielsweise subcutan, intracutan, intrakardial, intralobär, intramedullär, intrapulmonal oder in oder an das zu behan- delnde Gewebe (Binde-, Knochen-, Muskel-, Nerven-, Epithel-oder Knochengewebe) erfol- gen. Abhängig von der zu erzielenden Dauer und Stärke der immunsuppressiven Wirkung kön- nen die Antikörperpräparationen einmal oder mehrmals, auch intermittierend, pro Tag über mehrere Tage, Wochen oder Monate und unterschiedlichen Dosen verabfolgt werden.

Zur Herstellung einer für die genannten Applikationen geeignete Antikörperpräparation kõn- nen die dem Fachmann bekannten injizierbaren, physiologisch verträglichen Lösungen in steri- ler Form verwendet werden. Zur Herstellung einer gebrauchsfertigen Lösung zur parenteralen Injektion oder Infusion stehen die bekannten wassrigen isotonischen Lösungen, beispielsweise Saline oder eine entsprechende Plasmaproteinlösung ohne Gammaglobulin, zur Verfügung. Die Praparation kann aber auch in Form eines Lyophilisates bzw. Trockenpräparates vorliegen, welches mit einer der bekannten injizierbaren Lösungenunmittelbar vor dem Gebrauch unter sterilen Bedingungen rekonstituiert werden kann, z. B. als kit-of-parts. Die endgültige Herstel- lung einer erfindungsgemäß zuverwendenden Antikörperpräparation für die Injektion, Infusion oder Perfusion erfolgt durch Vermischen von nach bekannten Methoden gereinigten Antikör- pern gemäß oben angegebener Definitionen mit einem der genannten physiologisch verträgli- chen Lösungen, welche gegebenenfalls supplementiert sein können mit bekannten Träger-oder Hilfsstoffen (z. B. Serumalbumine, Dextrose, Natriumbisulfit, EDTA).

Die Menge der zu verabreichenden Antikörper hängt ab von der Art und Schwere der zu be- handelnden Krankheit oder Störung oder des zu beeinflussenden Zustands und des betreffen- den Patienten, gleichgültig ob Tier oder Mensch. Auszugehen ist jedoch von einer zu verwen- denden Dosierung von 1 bis 1000 mg, vorzugsweise 5-200 mg des betreffenden Antikörpers pro Dosiseinheit, wie sie auch für andere Antikörper bzw. monoklonale Antikörper üblich ist, wobei zwischen 0.01 bis 20 mg/Tag und 0.1 bis 100 mg/kg Kõrpergewicht/Tag auch über langer Zeit (Tage, Wochen, Monate) gegeben werden kann, um die gewünschten Effekte zu

erreichen-je nachdem, wie intensiv und über welchen Zeitraum eine prophylaktische oder the- rapeutische Wirkung erzielt werden soll.

Um zu untersuchen, ob Langerhans-Zellen CD44 exprimieren und ob diese Expression wäh- rend der LC Aktivierung verändert wird, wurden frisch isolierte LC aus menschlicher Epider- mis in eine Kultur übertragen. Dieses Verfahren ahmt LC Aktivierung durch Antigen nach (Schuler, G & Steinman, R. M., J. Exp. Med. 161 : 526-546,1986). Mit LC angereicherte epi-~ dermale Zellsuspensionen wurden entweder unmittelbar nach der Isolierung aus der Haut oder nach 48 und 72 Stunden der epidermalen Gesamtzellkultur einer dreifarbigen FACS-Analyse [ "fluorescence activated cell sorting"] unterworfen. Die Zellen wurden mit monoklonalen Anti- körpern (mAbs) gegen HLA-DR, um LC zu identifizieren, und mit mAbs gegen CD44 Epitope gefärbt. Frisch isolierte HLA-DR+LC (fLC) exprimierten ein N-terminales Epitop von CD44 (als"pan CD44"bezeichnet) und ein Epitop, welches gemeinsam durch CD44 Exons v7 und v8 gebildet wurde (Fig. la). Epitope, die durch Exons v5 und v6 codiert werden, wurden nur schwach exprimiert, wohingegen durch v4, v9 und v10 codierte Epitope nicht detektierbar waren (Fig. la). LC, die für 48 und 72 Stunden kultiviert wurden, trugen erhöhte Werte (2- fach) an N-terminalen Epitopen. Die Epitope von v4, v5, v6 und v9 waren ebenfalls abreguliert (Fig. la). Demgegenüber ging das CFD44v7/8 wärend der Kultivierung verloren (Fig. la). Ein CD44 v10 Epitop konnte nicht detektiert werden. Daraus ist zu schlußfolgern, daß die LC Aktivierung durch eine erhöhte Synthese von CD44 und durch eine Veränderung von entweder der Zugãnglichkeit für das Epitop oder des Epitop-Splicing begleitet wird.

LC gehören zur Familie der dendritischen Zellen (Steinman, R. M., Annu. Rev. Immunol. 9 : 271- 296,1991). Um zu bestimmen, ob DC anderer Herkunft CD44 Epitope exprimieren, welche denen von LC gleichen, wurden DC aus peripherem Blut durch Kultivierung in einem Cytokin- Cocktail prapariert (Sallusto, F. & Lanzavecchia, A., J. Exp. Med. 179 : 1109-1118,1994).

FACS Analyse von CDla+ (DC Marker) Zellen ließ CD44 Epitop Muster erkennen, welche identisch waren zu jenen von kultivierten LC (Fig. lb). Ein sehr ahnliches Muster der CD44 Expression entstand auch in kultivierten LC aus Haut von BL/6 Mäusen (Fig. l c).

Um festzustellen, in welchem Stadium LC eine verãnderte Expression von CD44 Epitopen während der Kultivierung erfährt, wurde eine Hautexplantat-Kultur (Larsen, C. P. et al., J. Exp.

Med. 172 : 1483-1493,1990) verwendet, in die LC aktiv aus der Epidermis in die Dermis mi- griert. Vollständige, Vollhaut Stanzbiopsien ("whole thickness punch biopsies") aus Men- schenhaut wurden zwischen 0-72 Stunden kultiviert. In Gefrierschnitten wurden LC sowohl lichtmikroskopisch mit Lag mAb gegen Birbeck Granula (für menschliche epidermale LC spe- zifische zytoplasmatische Organellen (Kashihara, M. et al., J. Invest Dermatol. 87 : 601-607, 1986)) als auch durch Transmissionselektron-Mikrsokopie identifiziert. In frisch isolierter Haut waren nahezu alle Lag+-Zellen in den suprabasalen Schichten der Epidermis lokalisiert, mit

sehr wenig detektierbaren Lag+-Zellen in der Dermis, wohingegen nach 72-stündiger Kultur fast die Hälfte der LC die Epidermis verlassen hatten. Bereits 2 Stunden nach Beginn der Kul- tur begannen epidermale LC ihre Migration und es wurde nach 12 Stunden festgestellt, daß sie die Basalmembran der epidermo-dermalen Junctura penetriert hatten. Nach 24 Stunden hatten sich die LC in der Dermis in schnurähnlichen Strukturen innerhalb lymphatischer Gefäße ak- kumuliert, was durch ihre charakteristischen, ultrastrukturellen Merkmale eines"single layer" endothelialer Zellen mit herausgetretenen Nuclei elektronenmikroskopisch identifiziert wurde- Durch immunohistochemische Doppelmarkierung mit mAb Lag (FITC, grün) und CD44 spezi- fischen Antikörpern (Cy3, rot), wurde die Expression von CD44 an LC während der Migration verfolgt. Doppel-Färbung erschien gelb. Keratinozyten färbten sich rot da sie verschiedene CD44 Epitope (CD44v2-v10) tragen (Hofmann, M. et al., Cancer Res. 53 : 1516-1521,1993 ; Hudson, D. L. et al., J. Cell. Science 108 (Pt 5) : 1959-1970,1995), aber nicht die Lag Epitope.

Die meisten intra-epidermalen LC exprimierten sowohl N-terminale Epitope als auch die durch v7/8 codierten Epitope, wohingegen nur wenige (<5%) davon eine Färbung mit Antikörpern gegen von Exons v5, v6 oder v9 codierten Epitopen zeigten (Fig. 2a, b, c, e, g). Demgegen- über exprimierte die Mehrheit der LC, die in die Dermis migrierten (87.5-100%), v5, v6 und v9 Epitope (Fig. 2d, f, h). Somit findet der Wechsel in der Epitop-Präsentation offensichtlich bei der Transition von Epidermis zur Dermis statt. Um diese Beobachtungen zu bestätigen, wurde Spalthaut ("split thickness skin") auf Kulturmedium schwimmend aufgebracht und den LC wurde es ermöglicht, in das Medium zu migrieren. Letztere wurden nach Kultivierung von 48 Stunden gesammelt. Diese LC trugen Epitope des CD44 N-Terminus, v5, v6 und v9, aber nicht v7/8 (Fig. 2 1, m). Somit stimmt der CD44 Phenotyp von LC, die vollständig aus der Haut migrierten, exakt mit denen der in vitro aktivierten LC oder DC überein.

Um die LC Migration weiter zu verfolgen, wurden LC in Gefrierschnitten von axillaren Lymphknoten identifiziert, die via lymphatischen Gefäßen zu den regionalen Lymphkonten gewandert waren. In den parakorticalen T-Zell Zonen der Lymphknoten wurden Lag+ Zellen gefunden und die Mehrzahl exprimierte Epitope der Exons v4, v5, v6 und v9 (Fig. 2 k) zusätz- lich zum N-Terminus von CD44 (Fig. 2 i), jedoch nicht das v7/8 Epitop. Es kann daraus der Schluß gezogen werden, daß das während der Emigration aus der Epidermis erworbene CD44 Expressionsmuster solang bestehen bleibt, bis LC die Lymphknoten erreicht haben.

Es wurden anti-CD44 Antikörper verwendet, um die funktionelle Bedeutung der CD44 Protei- nexpression während der frühen Stadien der LC Aktivierung, während der Adhesion von LC und DC an Lymphknoten und während der Antigenpräsentation durch LC festzustellen.

Betreffend die Untersuchung der CD44 Funktion während der frühen LC Aktivierung wurden sowohl anti-CD44 N-terminale Antikörper, die einerseits die Hyaluronsäure (HA) Bindung

blockieren (beispielsweise MEM-85, Bennett, K. L. et al., J. Cell. Biol. 128 : 687-698,1995) und andererseits die HA Bindung nicht blockieren, als auch v5, v6 oder v9 spezifische mAbs zu dem Medium mit der schwimmenden Keratom-Spalthaut ("split thickness keratome skin") hinzugegeben und das Auftreten von LC im Medium über FACS gezählt. LC wurde in der Epidermis durch beide N-terminal spezifischen Antikörper zurückgehalten (60% bis 80% Inhi- bition), aber nicht durch die Exon spezifischen mAbs (Fig. 3). Andere Antikörper, die den N- Terminus erkennen, zeigten ebenfalls Inhibition, während Antikörper gegen das v7/v8 Epitop- nicht inhibitorisch wirkten. Diese Ergebnisse zeigen, daß CD44 in einem sehr frühen Stadium der LC Aktivierung involviert ist. Wenn LC erst aktiviert sind und von Exons v5, v6 und v9 codierte Epitope exprimieren, können Antikörper, welche diese Epitope erkennen, nicht mit der Auswanderung von LC aus der Epidermis interferieren.

Um die Rolle von CD44 während der Adhäsion von aktivierten LC und DC an paracorticale T Zell-Areale in Schnitten von Lymphknoten zu bestimmen, wurden zur Blockierung dieser Ad- häsion verschiedene anti-CD44 Antikörper verwendet (Fig. 4). NLACSO (Mikrospharen Akti- viertes Cell Sorting)-gereinigte frische LC, für 48 Stunden kultivierte (und aktivierte) LC und DC aus Blut wurden für einen Lymphknoten-Gefrierschnitt Bindungsassay (Butcher, E. C., et al., J,. Immunol. 123 : 1996-2003,1979) verwendet. LC oder DC wurden über Gegenfärbung mit einem geeigneten Antikörper (beispielsweise CDla mAb bzw. OKT-6, Ortho, Neckarge- münd) identifiziert und die spezifische Adhäsion an Lymphknoten wurde mikroskopisch be- stimmt. Frische LC oder immature DC, welche von peripherem Blut gebildet wurden, zeigten nur eine schwache Bindung an Lympknoten-Gefrierschnitten (Fig. 4a). Kultivierte LC und Cytokin-aktivierte DC adhärierten spezifisch und mit erhöhter Effizienz an die paracorticalen T-Zell Areale, aber nicht an die zentralen follikulären B-Zell Areale (Fig. 4b, c). Präinkubation mit den CD44v6 spezifischen VFF18 mAb inhibierte signifikant das Binden von kultivierten LC (bis 66%) und DC (bis 49%) an den T-Zell Zonen (Fig. 4d, e). Ein gegen das N-terminale Epitop im konstanten Teil von CD44 gerichteter Antikörper (zum Beispiel MEM-85, Boehrin- ger Ingelheim Bioproducts, Cat. No. BMS5033F1.01 ; Bazil, V. et al., Folia Biologica 35 (5) : 289-297,1989 ; Spring, F. A. et al., In : Leucocyte typing V, white cell differentiation antigens, Schlossman, S. F., Boumsell, L., Gilks, W., Harlan, J. M., Kishimoto, T., Morimoto C., Ritz, J. and Shaw, S. (Ed.), Oxford, New York, Tokyo : Oxford University Press, 1995) inhibierte ebenfalls die Bindung, obwohl weniger effizient. Andere mAbs, die gegen andere v Exon Epitope oder gegen ICAM-1 gerichtet waren, zeigten keinen Effekt. Die mit VFF18 er- haltenen Daten zeigen, daß CD44 die Bindung von LC und DC an einen nicht-identifizierten Partner in der T-Zell Zone der Lymphknoten vermittelt. Diese Wirkung, insbesondere von MEM-85, weist auf eine Bindungsfunktion an Hyaluronsäure hin (die vermutlich nicht auf die T-Zell Zonen beschränkt ist) oder, was wahrscheinlicher ist, an den selben Partner, auf den VFF 18 wirkt.

Der entscheidende Test für die LC Funktion stellt ab auf deren Rolle in vivo beim Präsentieren eines in der Haut mit T-Zellen zusammengekommenen Antigens. Dazu wurden Mäuse epicutan mit DNFB (Dinitrofluorbenzol) sensitiviert, welches über Stimmulation ("challenge") mit dem selben Hapten in Ohrhaut am Tag 6 in einer massiven DTH ("Delayed Type Hypersensitivity") Reaktion resultiert, die über die Ohrschwellung gemessen wurde (Fig. 5). Anti-CD44 mAbs wurden i. p. injiziert an den Tagen-1,0 und +1 hinsichtlich der Haptenapplikation (um auf In- terferenz mit der Sensibilisierungsphase von DTH zu testen, die LC Migration von der Eps dermis zu den Lympknoten und Hapten-Präsentation erfordert (Austyn, J. M., J. Exp. Med.

183 : 1287-1292,1996)) und an Tagen 5,6 und 7 (um auf Interferenz mit der Stimmulations- ("challenge") Phase zu testen, die Extravasation von Leukozyten erfordert (Camp, R. L. et al., J. Exp. Med. 178 : 497-507,1993). Die Stimmulationsdosis des Haptens wurde an Tag 6 gege- ben. Während Antikörper gegen den N-Terminus von CD44 und gegen das v6 Epitop die Ex- travasations-Phase von DTH inhibierte, inhibierten nur die v4 und v6 spezifischen Antikörper stark die Sensitisation (Fig. 5). Daraus ist zu schlußfolgern, daß CD44 Varianten eine wesent- liche Rolle bei der LC Funktion spielt, entweder während der Migration zu den Lymphknoten oder bei der Interaktion mit T-Zellen. Die Inhibition der Extravasationsphase von DTH durch N-terminale CD44 Antikörper ist bekannt (Camp, R. L. et al., 1993, loc. cit.). Das Unvermö- gen von N-terminal-spezifischen anti-CD44 Antikörpern, die LC Aktivierung in der Epidermis in vivo zu inhibieren (Fig. 5), es aber in vitro können (Fig. 3), ist wahrscheinlich auf die Basal- membran-Barrieren zurückzuführen, die einen wirksamen Eintritt von Antikörpern in die Epi- dermis nach systemischer Applikation verhindern (Camp, R L. et al., 1993, loc. cit.).

Die Interferenz von anti-CD44v6 Antikörpern mit der LC Funktion erklärt zumindest teils- weise ihre Wirkung auf die primäre Immunantwort (Arch, R., et al., Science 257 : 682-685, 1992 ; Moll, J. et al., J. Immunol. 156 : 2085-2094,1995). Die gefundene Parallele des LC Ver- haltens mit dem lymphatischen Ausbreiten metastasierender Tumorzellen und der Inhibition von beidem durch anti-CD44v6 Antikörpern offenbart eine gleiche Rolle von CD44 in beiden Prozessen. Demzufolge muß angenommen werden, daß die Selektion für die molekulare Funk- tion und die Nachahmung der molekularen Funktion von CD44 auf LC und DC während der Tumorprogession erfolgt.

Legenden zu den Figuren Fig. 1 : Anderung bei der CD44 Epitop Expression während der in vitro Kultivierung von epidermalen LC und Blut DC.

(a) Frisch isolierte human LC und nach 48 und 72 stündiger Kultivierung und (c) Maus BL/6 Haut-LC nach 72 stündiger Kultivierung wurden mit mAbs gegen HLA-DR oder Iab, 7-AAD und mAbs gegen CD44 Epitope gefärbt. Die mittlere Fluoreszenzintensitätw von HLA-DR+ Zellen wurde über FACScan bestimmt. Repräsentatives Ergebnis fur 6 Versuche mit Zellen verschiedener Spender. Niedrige Expression von CD44v Epitopen auf fLC wurde nicht durch die während des Isolationsverfahrens angewendeten Trypsinisierung verursacht, da identische Trypsinisierung von kultivierten LC nicht signifikant deren CD44v Expression beeinflußten. (b) Korrespondierende Analyse von DC aus humanen peripheren Blut Monozyten generiert, Selektive Bestimmung von CD l a positiven Zellen. Repräsentatives Ergebnis fur 4 Versuche mit Zellen verschiedener Spender.

Fig. 2 : Von der Epidermis in die Dermis und den Lymphknoten wanderende LC zeigen das selbe CD44 Expressionsmuster wie in vitro aktivierte LC/DC.

Gefrierschnitte von für 12 Stunden kultivierte Haut wurden mit FITC-konjugierten mAK Ziege-anti-Maus Lag (erkennt Birbeck Granula, spezifische zytoplasmatische Organelle von LZ, Kashihara, M. et al., J. Invest. Dermatol. 87 : 601-607,1986) mAbs gefärbt, um LC zu detektieren (grün), und mit Cy3-konjugierten Ziege-anti-Maus CD44 mAbs (rot). Doppelt-positive Zellen erschienen gelb-orange. Der Balken stellt 31 u. m dar. Selbe Vergrößerung von A bis K. (a) Färbung mit Lag und anti pan CD44 Antikörper (erkennen Standard Teil des CD44 Moleküls). Lag+ Zellen innerhalb der Epidermis (*) und solche, die in die Dermis (**) eingewandert waren, färbten doppelt positiv fiir Lag und pan CD44 (gelb). Keratinozyten exprimierten pan CD44, aber nicht Lag (rot). Lag+ intra-epidermale LC exprimierten ebenfalls das durch Exons v7/v8 (b) gebildete Epitop aber auf sehr niedrigem Niveau die Epidope von CD44 Exon v5 (c), v6 (e) und v9 (g). Lag+ Zellen, die in die Dermis eingewandert waren, exprimierten CD44v5 (d), v6 (f) und v9 (h). (i) Pan CD44 Färbung von Lag+ Zellen (gelb), welche in den paracorticalen T-Zell Arealen der axillaren Lymphknoten lokalisiert sind und die Haut dränieren. T-Zellen exprimierten ebenfalls CD44 aber nicht Lag (rot). (k) Das Exon v9 Epitop wird in der Mehrzahl exprimiert (gelb) aber nicht auf allen Lag positiven Zellen (Pfeil, grün). (1, m) LC, welche aus Spalthaut ("split-thickness skin") ausgewandert waren, wurden nach HLA-DR Expression selektiert und mit den angegebenen mAbs durch FACS analysiert wie in Fig. 1.

Fig. 3 : Antikörper gegen den CD44 N-Terminus verhindern LC Aktivierung und/oder Migration in vitro.

Antikörper wurden Spalthautkulturen ("split-thickness skin cultures") hinzugefügt und die Zellen, welche aus der Spalthaut in das Medium ausgewandert waren, wurden durch FACS analysiert. (a) Behandlung mit MEM-85 oder Kontroll mAb. CD1+, lebende (Propidiumjodid-negativ) LC sind umkreist. Die Fraktion dieser Zellen über die Gesamtzellzahl wird in der oberen Ecke von jeder Graphik als % angezeigt. (b) Inhibition der LC Emigration durch verschiedene anti-CD44 Antikörper. Die prozentuale Inhibition wurde aus 5 unabhängigen Experimenten berechnet (+/-SD, * statistisch signifikant bei p< 0.05,"one way ANOVA", Dunnett's Test, SigmaStat, Jandel Scientific Software).

Fig. 4 : Die Bindung von LC oder DC an paracorticale Lymphknoten Areale wird durch Antikörper gegen CD44 inhibiert.

Microbead-gereinigte frische LC (a), für 48 Stunden kultivierte LC (b, d) oder Cytokin- aktivierte DC (c, e) wurden auf gefrorene Schnitte von Lymphknoten (Balken = 3 I, m) plaziert. LC und DC adhärierten vorzugsweise an die paracorticalen T-Zell Areale, mit erhöhter Adhäsion über Aktivierung durch die Kultur, aber nicht an die zentralen B Zell Follikel. Die Bindung wurde ebenfalls in Anwesenheit von Antikörpern bestimmt (d, c) (quantifiziert in d und e, * = statistisch signifikant bei p< 0.05,"one way ANOVA", Dunnett's Test).

Fig. 5 : Antikörper gegen CD44v Epitope inhibieren die Sensibilisierungsphase von Kontakt- Hypersensitivität in vivo.

Die Gruppe 2 Mäuse wurden wie angegeben sowohl vor als auch während der Sensibilisierungsphase mit den angegebenen mAbs i. p. behandelt, und die Gruppe 3 Mäuse wurden gleichermaßen vor und während der Stimmulationsphase ("challenge phase") behandelt. Mäuse der Gruppe 1 wurden nicht mit mAbs behandelt. * statistisch signifikante Reduktion der Ohrschwellung bei p< 0.05 ("one way ANOVA", Dunnett's Test) Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel 1 : Isolierung der Langerhans-Zellen (LC) und der dendritischen Zellen (DC) Humane epidermale Zellsuspensionen wurden nach der Methode von Simon, J. C., et al., Exp.

Dermatol. 4 : 155-161,1995, durch begrenzte Trypsinisierung von humaner Haut, die bei einer plastischen Operation gewonnen wurde. Murine LC wurden aus der Rumpfhaut weiblicher C57/BL63 Mäuse (Harlan-Olac, Great Britain) gemäß Simon, J. C., et al., J. Immunol.

146 : 485-491,1991, gewonnen. LC wurden durch Dichtegradientenzentrifugation auf Lym- phoprep (Gibco) auf 5-20% angereichert. Sowohl frische LC als auch in supplementiertem RPMI (Simon, J. C., et al., Exp. Dermatol. 4 : 155-161,1995 ; Simon, J. C., et al., J. Inmunol.

146 : 485-491,1991) für 48 oder 72 Stunden kultivierte LC wurden durch FACS analysiert.

Humane DC wurden gemäß Sallusto, F. & Lanzavecchia, A., J. Exp. Med. 179 : 1109-1118, 1994, gebildet und enthielten 80-90% CDla+ Zellen.

Beispiel 2 : Immunofärbung und Flowzytometrie Zellen wurden gemäß Weiss, J. M., et al. Eur. J. Immunol. 25 : 2858-2862,1995, mit einem der folgenden Antikörper gefärbt : (a) human spezifisch : N-terminales Epitop = pan CD44, Leu 44 (Klon L178, Maus IggGl, Becton Dickinson) ; Exon v4, FW 11.10.3 (Maus IgGI, ECACC Nr.

93070776) ; Exon v5, VFF8 (Maus IgGI, Bender, Wien) ; Exon v6, VFF18 (Maus IgGl, Ben- der, Wien, WO 95/33771, DSM ACC2174) ; Exon v7/v8, VFF17 (Maus IgG2b, Bender, Wien) ; Exon v9, FW 11.24.7.36 (Maus IgGl, ECACC Nr. 93070775). (b) Mäuse-spezifisch : N-terminales Epitop = pan CD44, IM7.8.1 (Ratten IgGl, ATCC Nr. TIB-235, Lesley, J. et al., Cell. Immunol. 112 : 40-54,1988 ; Lesley, J. et al., Cell Immunol. 117 : 378-388,1988 ; Trow- bridge, I. S. et al., Immunogenetics 15 : 299-312,1982 ; Budd, R. C. et al., J. Immunol.

138 : 3120-3129,1987) ; ein gegen Exon v4 gerichteter monoklonaler Antikörper ; ein gegen Exon v6 gerichteter monoklonaler Antikörper ; Isotyp Kontrolle, IB7 (Ratten IgGI ; Dianova, Hamburg). Sekundäre Antikörper : FITC-markierte Schaf-anti-Maus (Fab) 2 und Schaf-anti- Maus (Fab) 2 (Dianova, Hamburg). Der Behandlung mit dem sekundären Antikörper folgte eine lOminütige Inkubation in 2% normalen Mäuse oder Ratten Serum und daraufhin eine In- kubation mit PE- (Phykoerythrin-) markiertem HLA-DR spezifischen Antikörper (L234, Mäuse IgGI, Becton Dickinson) oder Iab (Mäuse IgG2b, Pharmingen, Hamburg) oder entsprechende nicht-reaktive PE-markierte Kontroll-Antikörper (Dianova). Humane DC wurden durch FITC- konjugierte mAb gegen CDIa (Okt-6, Mäuse IgGI, Ortho, Neckargemünd) identifiziert. 7- Aminoactinomycin D (7-ADD) (2.5mg/ml, Sigma) wurde hinzugegeben, um tote Zellen auszu- schließen. Zell Quest Software (Becton Dickinson) wurde für die Analyse von jeweils 104 HLA-DR+, CDIa+ oder Iab lebenden Zellen angewandt.

Beispiel 3 : Vollhaut Organkultur 4 mm dicke Haut-Stanzbiopsien, die Dermis und Epidermis enthielten, wurden in 25 mm Ge- webekultur-Einsätze mit einer 0.02 mm Anopore Membran (Nunc) in 6-Loch Gewebekultur- platten, welche mit supplementiertem DMEM/HAMS-F12 (Gibco) bis zur epidermo-dermalen Grenze aufgefüllt wurden, inkubiert. Die Kultivierungen wurden zu den angegebenen Zeit-

punkten beendet und Proben in N2 schock-gefroren. Gewebeschnitte (5 mm) wurden präpa- riert (Cryocut 1800, Leica) und nach der Methode von Negoescu, A. et al., J Histocheni.- Cytochem. 42 : 433-437,1994, mit einer Immunfluoreszenz-Doppelmarkierung angefärbt. Als erstes wurden Gefrierschnitte mit Lag mAB für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend bei 4°C über Nacht mit FITC-konjugierten Ziege-anti-Maus monovalenten Anti- körpern (Fab) (Dianova). Zum zweiten wurden Gefrierschnitte mit mAbs gegen CD44 Epitope für 30 Minuten bei Raumtemperatur und anschließend mit Cy3-konjugierten Ziege-anti-Maus Antikörpern (Fab) inkubiert (4°C, 4 Stunden). Kreuzinterferenz der verschiedenen Färbe- schritte wurde durch entsprechende Kontrollen ausgeschlossen. Für die quantitative Analyse von gesamten und CD44+/Lag+ doppelt-positiven LC wurden 5 stark vergrößerte Felder mi- kroskopisch ausgezählt und die LC-ZahUmrn2 bestimmt.

Beispiel 4 : Spalthaut Organkultur 2 x 2 cm Spalthaut, welche Epidermis plus papillare Dermis enthielt, wurde über Dermatome (Aesculap, Tuttlingen) gemäß Pope, M. et al., J. Invest. Dermatol. 104 : 11-17,1995, präpariert und auf supplementiertes RPMI in 6-Loch Platten (Greiner, Nürtingen) gegeben. Nach 3 Ta- gen wurden die Zellen, die in das Kulturmedium gewandert waren, gesammelt. Die Keratino- zyten wurden durch Dermatom Manipulation in eine Suspension gezwungen. Die Anfärbung mit FITC-konjugierten mAbs gegen CDIa und FACS wurden wie oben beschrieben durchge- führt. Alle aus einem Loch erhaltenen Zellen (5-6 x 105) wurden analysiert. Der Prozentsatz an CDIa+ Zellen wurde anhand der Cell Qest Software (Becton Dickinson, Heidelberg) be- rechnet. Der Prozentsatz an emigrierenden LC aus unbehandelten Proben wurde als 0% Inhibi- tion definiert.

Beispiel 5 : Lymphkoten Adhäsions Assay Nach Simon, J. C. et al., Exp. Dermatol. _ : 155-161,1995, mit Antikörpern gegen HLA-DR oder CDIa angereicherte LC oder DC MACS (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach) wurden auf ihre Bindung an Lymphknoten-Gefrierschnitten getestet (Pope, M. et al., J. Invest. Der- matol. 104 : 11-17,1995). Frische, auf Objektträger aufgelegte Gefrierschnitte (10 mm) von humanen axillaren Lymphknoten wurden mit RPMI, mit 1% Rinderserumalbumin (BSA), bei 7°C für 1 Stunde geblockt. LC oder DC wurden in HBSS (Gibco)/1% BSA suspendiert (2 x 106 Zellen/ml) und die Gefrierschnitte bei Raumtemperatur für 40 Minuten aufgelegt. Die Ob- jektträger wurden mit HBSS gespült und in Aceton bei 4°C für 10 Minuten fixiert. Für die Blockierung der Antikörper wurden LC oder DC mit mAbs (jeweils 20 mg/ml für 30 Minuten bei 4°C) präinkubiert, welche gegen den N-Terminus von CD44 (SFF-2, MEM-85) gerichtet

waren, mit v Exon spezifischen Antikörpern (v5, VFF-8 ; v6, VFF-18 ; v9, FW 11.24.7.36), mit ICAM-1 mAb 84H10 (Immunotech Corp., Boston, USA ; Makgoba, M. W. et al., Nature 331 : 86-88,1988) oder mit Kontroll IgGl. Die Objektträger wurden anschließend gemäß Si- mon, J. V. C. et al., Europ. J. Cancer 32A : 1394-1400,1996, mit anti-CDIa mAb gefärbt. Die Codierung und Evaluierung erfolgte durch zwei unabhängige Untersucher. Die Hintergrund- Bindung von kultivierten LC/DC war ungefähr 1.5 Zellen/mm2, die Positiv-Bindung war 30 Zellen/mm2. Die Daten wurden als % Bindung im Vergleich zu Proben ohne Antikörper auf- getragen. Die Standartabweichung wurde anhand von drei Objektträgern, jeder mit 9 Zufalls- feldern pro Objekträger, durch Verwendung eines optischen Gitternetzes (Vergrößerung 10 x), berechnet.

Beispiel 6 : Kontakt Hypersensitivität 6 Wochen alte weiblichen C57/BL63 Mäusen (Harlan-Olac, Great Britain) wurden auf die ab- dominale Haut 20 ul 0.5% 2,4-Dinitrofluorbenzol (DNFB ; Sigma, Deisenhofen) in Aceton am Tag 0 und 1 gemäß Simon, J. C. et al., Photodermatol. Photoimmunol. Photomed 10 : 206- 211,1994, aufgetragen. Am Tag 6 wurde den Mäusen 10 pl 0.2% DNFB beidseitig auf das rechte Ohr aufgetragen. Die Ohrdicke wurde mit einem Ingenieur Mikrometer (Mitutoyo Corp., Takatsu-Ku, Kawasaki-Shi, 213 Kanagawa-Ken, Japan) vor und zum Zeitpunkt 24 Stunden nach der Stimmulation gemessen (Simon, J. C. et al., Photodermatol. Photoimmunol.

Photomed. 10 : 206-211,1994). Die Gruppe 1 Mäuse wurden entweder nur stimmuliert oder sensibilisiert und stimmuliert in Abwesenheit von mAbs. Die Injektion der mAbs (i. p.) wurde wie folgt durchgeführt : Gruppe 2 Mäuse erhielten 300 mg am Tag 1, jeweils 100 mg an den Tagen 0 und 1. Gruppe 3 Mäuse erhielten 300 mg am Tag 5 und jeweils 100 mg an den Tagen 6 und 7. Jeder Balken (Fig. 5) repräsentiert die von 8 Tieren gepoolten mittleren Werte der Ohrschwellungen.

SEQUENZPROTOKOLL (1) ALLGEMEINE ANGABEN : (i) ANMELDER : (A) NAME : Boehringer Ingelheim International GmbH (B) STRASSE : Rheinstrasse (C) ORT : Ingelheim (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 55216 (G) TELEFON : ++49- (0) 6132-77-2770 (H) TELEFAX : ++49- (0) 6132-77-4377 (A) NAME : Forschungszentrum Karlsruhe GmbH (B) STRASSE : Weberstr. 5 (C) ORT : Karlsruhe (E) LAND : Deutschland (F) POSTLEITZAHL : 76133 (ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG : Verwendung von anti-CD44 Antikoerpern ent- haltenden Praeparationen zur Behandlung bestimmter Tumore und zur Unterdrueckung von Immunreaktionen (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN : 4 (iv) COMPUTER-LESBARE FASSUNG : (A) DATENTRÄGER : Floppy disk (B) COMPUTER : IBM PC compatible (C) BETRIEBSSYSTEM : PC-DOS/MS-DOS (D) SOFTWARE : PatentIn Release #1.0, Version #1.30 (EPA) (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 1 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN : (A) LANGE : 39 Aminosäuren (B) ART : Aminosäure (C) STRANGFORM : Einzelstrang (D) TOPOLOGIE : linear (ii) ART DES MOLEKÜLS : Peptid.

(xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 1 : Ile Ser Thr Thr Pro Arg Ala Phe Asp His Thr Lys Gln Asn Gln Asp 1 5 10 15 Trp Thr Gln Trp Asn Pro Ser His Ser Asn Pro Glu Val Leu Leu Leu 20 25 30

Gln Thr Thr Thr Arg Met Thr 35 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 2 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN : (A) LANGE : 39 Aminosäuren (B) ART : Aminosäure (C) STRANGFORM : Einzelstrang (D) TOPOLOGIE : linear (ii) ART DES MOLEKÜLS : Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 2 : Asp Val Asp Arg Asn Gly Thr Thr Ala Tyr Glu Gly Asn Trp Asn Pro 1 5 10 15 Glu Ala His Pro Pro Leu Ile His His Glu His His Glu Glu Glu Glu 20 25 30 Thr Pro His Ser Thr Ser Thr 35 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 3 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN : (A) LANGE : 42 Aminosäuren (B) ART : Aminosäure (C) STRANGFORM : Einzelstrang (D) TOPOLOGIE : linear (ii) ART DES MOLEKÜLS : Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ ID NO : 3 : Gln Ala Thr Pro Ser Ser Thr Thr Glu Glu Thr Ala Thr Gln Lys Glu 1 5 10 15 Gln Trp Phe Gly Asn Arg Trp His Glu Gly Tyr Arg Gln Thr Pro Arg 20 25 30 Glu Asp Ser His Ser Thr Thr Gly Thr Ala 35 40 (2) ANGABEN ZU SEQ ID NO : 4 : (i) SEQUENZKENNZEICHEN :

(A) LÄNGE : 30 Aminosäuren (B) ART : Aminosäure (C) STRANGFORM : Einzelstrang (D) TOPOLOGIE : linear (ii) ART DES MOLEKÜLS : Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG : SEQ BD NO : 4 : Gln Gln Ser Asn Ser Gln Ser Phe Ser Thr Ser His Glu Gly Leu Glu 1 5 10 15 Glu Asp Lys Asp His Pro Thr Thr Ser Thr Leu Thr Ser Ser 20 25 30 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Boehringer Ingelheim International GmbH Postfach 200 55216 Ingelheim am Rhein EMPFANGSBESTÄTIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemäß Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1.KENNZEICHNUNGDESMIKROORGANISMUS VomHINTERLEGERzugeteiltesBezugszcichen:VonderINTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilteEINGANGSNUMMER: SFF-2 DSMACC2305 II.WISSENSCHAFTLICHEBESCHREIBUNGUND/ODERVORGESCHLAGENETAXONO MISCHEBEZEICHNUNG Mitdemunter1.bezeichnetenMikroorganismuswurde (X)einewissenschaftlicheBeschreibung ()einevorgeschiagenetaxonomischeBezeichnung eingereichL (Zutreffendesankreuzen). 111.EINGANGUNDANNAHME DieseintemationaleHinterlegungsstellenimmtdenunterIbezeichne tenMikroorganismusan,derbeiihram1997-04-16 (Datum der Ersthinterlegung)'eingegangenist. IV.EINGANGDESANTRAGSAUFUMWANDLUNG DerunterIbezeichneteMikroorganismusistbeidieserInternational enHinterlegungssteileameingegangen(DatumderErst- hinterlegung)undeinAntragaufUmwandlungdieserErsthinterlegung ineineHinterlegunggemmaBudapesterVertragistam eingegangen(DatumdesEingangsdesAntragsaufUmwandlung). V.INTERNATIONALEHINTERLEGUNGSSTELLE Name:DSMZ-DEUTSCHESAMMLUNGVONUnterschrift (en)derzurVertretungderintemationalenHinterlegungsstelle MIKROORGANISMENUNDZELLKULTURENGmbHbefugtenPerson(en)oderdes( der)vonihrermächtigtenBediensteten: Anschrift:MascheroderWegIb D-38124Braunschweig Datum:1997-04-25 'Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifR, ist dies der Zeitpunkt, zu dem der Status einer intemationalen Hinterlegungsstelle erworben worden ist BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Boehringer Ingelheim International GmbH Postfach 200 55216 Ingelheim am Rhein LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG ausgestellt gemäß Regel 10.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE 1.HINTERLEGERII.KENNZEICHNUNGDESMIICROORGANISMUS Name:BoehringerIngelheimVonderINTERNATIONALENHINTERLEGUNGSST ELLE InternationalGmbHzugeteilte EINGANGSNUMMER: Anschrift:Postfach200DSMACC2305 55216IngelheimamRheinDatumderHinterlegungoderWeiterleitung': 1997-04-16 Ill.LEBENSFÄHIGKEITSBESCHEINIGUNG DieLebensfåhigkeitdesunterfIgenanntenMikroorganismusistam19 9 7-04-16'geprltft worden. ZudiesemZeitpunktwarderMikroorganismus (X)'lebensfahig ()'nichtmehrlebensfahig IV. BEDINGUNGEN,UNTERDENENDIELEBENSFAHIGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRTWORDENIST' V.INTERNATIONALEHINTERLEGUNGSSTELLE Name:DSMZ-DEUTSCHESAMMLUNGVONUnterschrift (en)derzurVertretungderinternationalenHinterlegungsstelle MIKROORGANISMENUNDZELLKULTURENGmbHbefugtenPerson(en)oderdes( der)vonihrermächtigtenBediensteten: Anschrift:MascheroderWeglb D-38124Braunschweigt/> Datum:1997-04-25 Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine emeute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten emeuten Hinterlegung oder Weiterieitung.

2 In den in Regel 10.2 Buchstabe a Ziffer ii und iii vorgesehenen Fallen Angabe der letzten Lebensfahigkeitsprühng.

'Zutreffendes ankreuzen.

'Ausfilllen, wenn die Angaben beantragt worden sind und wenn die Ergebnisse der Prüfung negativ waren.

BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Boehringer Ingelheim Int. GmbH Postfach 200 55216 Ingelheim am Rhein EMPFANGSBESTATIGUNG BEI ERSTHINTERLEGUNG, ausgestellt gemaB Regel 7.1 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE I.KENNZEICHNUNGDESMIKROORGANISMUS VomHINTERLEGERzugeteiltesBezugszeichen:VonderINTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE zugeteilteEINGANGSNUMMER: VFF-18 DSMACC2174 II.WISSENSCHAFTLICHEBESCHREIBUNGUND/ODERVORGESCHLAGENETAXONO MISCHEBEZEICHNUNG MitdemunterI.bezeichnetenMikroorganismuswurde () einewissenschaftlicheBeschreibung ; () einevorgeschlagenetaxonomischeBezeichnung eingereicht. (Zutreffendesankreuzen). III.EINGANGUNDANNAHME DieseinternationaleHinterlegungsstellenimmtdenunterIbezeichn etenMikroorganismusan,derbeiihr am1994-06-07(DatumderErsthinterlegung)l eingegangenist. IV.EINGANGDESANTRAGSAUFUMWANDLUNG DerunterIbezeichneteMikroorganismusistbeidieserInternational enHinterlegungsstelleam eingegangen(DatumderErsthinterlegung)undeinAntragaufUmwandlu ngdieserErsthinterlegungineineHinterlegung gemma8PudapesterVertragistameingegangen(DatumdesEingangsdesA ntragsaufUmwandlung). V.INTERNATIONALEHINTERLEGUNGSSTELLE Name:DSM-DEUTSCHESAMMLUNGVONUnterschrift(en)derzurVertretung derinternationalen MIKROORGANISMENUNDZELLKULTURENGmbHHinterlegungsstellebefugte nPerson(en)oderdes(der)von ihrermächtigtenBediensteten: Anschrift:MascheroderWeglb D-38124Braunschweig-.,,-'"/ -r Datum:1994-06-17 1 Falls Regel 6.4 Buchstabe d zutrifft, ist dies der Zeitpunkt, ru dem der Status einer internationalen Hinterlegungsetelle erworben worden ist.

Formblatt DSM-BP/4 (einzige Seite) 12/93 BUDAPESTER VERTRAG ÜBER DIE INTERNATIONALE ANERKENNUNG DER HINTERLEGUNG VON MIKROORGANISMEN FÜR DIE ZWECKE VON PATENTVERFAHREN INTERNATIONALES FORMBLATT Boehringer Ingelheim Int. GmbH Postfach 200 55216 Ingelheim am Rhein LEBENSFÄHIG KEITSBESCHEINIG UNG ausgestellt gemäB Regel 10.2 von der unten angegebenen INTERNATIONALEN HINTERLEGUNGSSTELLE I.HINTERLEGERII.KENNZEICHNUNGDESMIKROORGANISMUS Name:BoehringerIngelheimInt.GmbHVonderINTERNATIONALENHINTERL EGUNGSSTELLE zugeteilteEINGANGSNUMMER: Am. chrift ; Postfach200DSMACC2174 55216IngelheimamRhein DatumderHinterlegungoderWeiterleitungi: 1994-06-07 111.LEBENSFAHIGKEITSBESCHEINIGUNG DieLebensfahigkeitdesunterIIgenanntenMikroorganismusistam199 4-06-07 geprüftworden. ZudiesemZeitpunktwardr Mikroorganismus (X)3lebensfähig ()3 nichtmehrlebensfähig IV.BEDINGUNGEN,UNTERDENENDIELEBENSFAHIGKEITSPRÜFUNG DURCHGEFÜHRT WGRDEN IST4 V.INTERNATIONALEHINTERLEGUNGSSTELLE Name:DSM-DEUTSCHESAMMLUNGVONUnterschrift(en)derzurVertretung derinternationalen MIKROORGANISMENUNDZELLKULTURENGmbHHinterlegungsstellebefugte nPerson(en)oderdes(der) vonihrermächtigtenBediensteten: Anschrift:MascheroderWeglb D-38124Braunschweig/'pi/. <t Datum:1994-06-17 Angabe des Datums der Ersthinterlegung. Wenn eine erneute Hinterlegung oder eine Weiterleitung vorgenommen worden ist, Angabe des Datums der jeweils letzten erneuten Hinterlegung oder Weiterleitung.

2 IndeninRegel10.2BuchstabeaZifferiiundiiivorgesehenenFällenA ngabederletstenLebensfahigkeitsprüfung.<BR> <P>3 Zutreffendes ankreuzen.<BR> <P>Ausfüllen,wenndieAngabenbeantragtwordensindundwenn dieErgebnissederPrilfungnegativwaren.