La présente invention concerne des micro- emulsions aqueuses de fluorocarbures. Elle a égale¬ ment pour objet un procédé pour l'obtention de ces icroémulsions et leur application à titre de transporteurs de gaz, notamment à titre de transpor¬ teur d 'oxygène. II est connu que les fluorocarbures conviennent comme transporteurs d'oxygène dans les corps vivants /_ L . Clark et al. Triangle XIII n° 2 p. 85 1973_7 et que des emulsions de fluorocarbures ont déjà été utilisées comme substituts du sang /_Proceedings of the IV Inter- national Symposium on Perfluoroche icals blood substitutes. Ed. Excerpta Medica. 1979 _7.

Dans cette application des fluorocarbures , il est nécessaire de fabriquer des emulsions aqueuses stables de ces fluorocarbures de manière à véhiculer l'oxygène dissous dans le fluorocarbure et les sels et métabolites qui sont normalement présents dans le plasma. Il est connu que la toxicité des emulsions varie avec le pourcentage de particules égales ou supérieures à 0,4 _j ^ . Par ailleurs, plus les parti- cules sont fines, plus les emulsions sont efficaces. Il est important d'avoir des emulsions ayant des dimensions de particules relativement faibles, en tout état de cause inférieures à 0,2 >j.m , ou mieux encore inférieures à 0,1 u.m, de manière à ce qu'elles puis- sent ^' itre compatibles avec la circulation dans l'orga¬ nisme et être administrées par injection ou perfusion intra-veineuse.

On a déjà proposé des procédés pour l'obten¬ tion de telles emulsions. Par exemple, le brevet FR 71.31.983 (publié sous le n° 2.105.287) concerne un

procédé pour l'obtention d'une émulsioπ d'un fluoro- carbure pour injection capable de transporter de l'oxygène, qui consiste à emulsionner une solution aqueuse d'un fluorocarbure avec un agent tensio-actif, à centrifuger l'é ulsion aqueuse résultante de façon à diviser les particules de fluorocarbure dans l'émul¬ sion et à stériliser l'émulsion résultante. L'agent tensio-actif mis en oeuvre est un copolymère polyé- thylène-polyoxypropylèπe ayant un poids moléculaire compris entre 8200 et 10500, associé à la lécithine du jaune d'oeuf ou à la lécithine des graines de soja. Ce procédé nécessite une opération de centrifugation et ne convient pas à tous les fluorocarbures.

Le brevet FR 7 .03. 4* (publié sous le numéro 2.246.262) concerne une emulsion stable de composé fluorocarboné pouvant transporter de l'oxygène. Cette emulsion stable dans un milieu aqueux physiologique- ment acceptable comprend : un composé perfluorocar¬ boné, un phospholipide et au moins un composé d'acide gras comme adjuvant d 'é ulsification. Cette emulsion est préparée par mélange sous pression élevée.

La demande de brevet DE-OS 2.224.182 concerne un procédé pour la fabrication d'émulsion stable de particules de fluorocarbures ; ce procédé consiste à emulsionner sous pression élevée une solution dispersée contenant un fluorocarbure, un ou plusieurs agents tensio-actifs non ioniques et un ou plusieurs polyal- cools pour former une emulsion de fluorocarbure ayant une dimension de particules inférieure à 0,2 u.m. D'autre part, le brevet US 3.778.381 concerne des microé ulsions de fluorocarbures qui nécessitent pour leur fabrication la mise en oeuvre d'un fluoro- halogénocarbure à faible point d' ébullition. Elles sont obtenues par mélange d'un fluorocarbure avec un fluorohalogénocarbure, addition du mélange résultant

à un système aqueux contenant un agent tensio-actif et agitation jusqu'à ce que la microemulsion soit formée, puis élimination dudit fluorohalogénocarbure par évaporation. Le brevet FR 73.39.533 (publié sous le numéro

2.249.657) concerne un procédé de préparation de liquides à application biologique et transporteurs d'oxygène. Ce procédé consiste à emulsionner un composé fluoré en présence de deux é ulsionnants dont l'un est à caractère hydrophile et l'autre à caractère lipophile. Les émulsionnants mis en- oeuvre dans ce procédé sont des agents tensio-actifs fluorés non ioniques du type polyoxyéthylène-fluoro-alkyl-éther. Les brevets US 4.105.79S et FR 7.537.587 (publié sous le n° 2.313.024) concernent des emulsions aqueuses de composés polycycliques perfluorés, utilisa¬ bles comme produits de remplacement du sang. Ces composés polycycliques comportent 9 à 18 atomes de carbone et au moins deux carbones tête de pont. Il ne s'agit pas de microé ulsions.

La demande de brevet 3P 73.36.514, publiée sous le n° 123.184/74 concerne l'obtention d'émulsions aqueuses contenant un dérivé fluorocarboné, comme constituant principal, un agent tensio-actif non ionique et de l'eau. La préparation de ces emulsions nécessite la mise en oeuvre d'une part d'agents sta¬ bilisants d'émulsions, d'agents régulateurs de pH ou d'autres agents et d'autre part des moyens mécaniques, tels qu'agitateurs, homogénéisateurs et similaires. II faut noter que les emulsions préparées selon le procédé décrit dans cette demande de brevet 3P 73.36.514 sont stables au maximum pendant un moeitsà,/2c5o°mCme le montrent les exemples illustratifs figurant dans cette demande de brevet 3P. Par ailleurs on notera que les agents tensio-actifs mis en oeuvre dans ce procédé

sont obtenus, conformément aux procédés décrits dans cette demande de brevet 3P sous la forme de mélanges ayant une répartition conforme à une courbe de Gauss et non pas sous la forme de produits purs. Cet état de la technique montre que la fabrication de microémulsions de fluorocarbures est complexe et que les solutions proposées jusqu'à présent sont insatisfaisantes, soit qu'elles fassent appel à des sonications qui libèrent des ions fluor toxiques, soit qu'elles utilisent une homogénéisation mécanique qui nécessite de très grandes précautions pour obtenir des particules suffisamment fines, sans éliminer totalement les risques de libération d'ions fluor. II est, de plus, nécessaire d'utiliser des mélanges de divers tensio-actifs dont la composition n'est pas toujours connue avec précision ou de faire appel à un- artifice de fabrication (par exemple selon le brevet US 3.778.381). Par ailleurs, ces emulsions sont Instables et doivent être conservées congelées jusqu'au moment de l'utilisation.

Dans la thèse présentée à l'Université de NANCY I le 15 décembre 1978 par Monsieur MATHIS, il est indiqué que pour formuler des microémulsions aqueuses avec le minimum de tensio-actif non ionique, il faut choisir un agent tensio-actif fluoré non ionique possédant un point de trouble voisin de 37°.C pour réaliser des microémulsions de fluorocarbures utilisables comme substituts du sang. Contrairement aux enseignements de cette thèse qui laissait supposer que le comportement des systèmes ternaires eau/tensio- actifs fluorés non ioniques/fluorocarbures devait être identique à celui des systèmes ternaires conte¬ nant des composés hydrogénés homologues, on a trouvé que pour obtenir une microemulsion dans l'eau pure stable à une température donnée ne contenant qu'un seul

agent tensio-actif fluoré non ionique, il est indis¬ pensable d'utiliser un agent tensio-actif fluoré non ionique ayant un point de trouble nettement inférieur à la température de stabilité de la micro- emulsion souhaitée et plus particulièrement inférieur d'au moins 5 à 10°C à cette température de stabilité.

On a maintenant trouvé de nouvelles micro¬ émulsions qui peuvent être obtenues facilement par simple mélange de trois constituants définis ci-après et chauffage jusqu'à une température qui correspond à la température de stabilité de la microemulsion désirée.

La présente invention a donc pour objet des microémulsions aqueuses de fluorocarbures indéfini- ment stables à une température donnée qui sont constituées de :

1) un milieu aqueux ;

2) un fluorocarbure ;

3) un seul agent tensio-actif fluoré non ionique, ledit agent tensio-actif ayant un point de trouble inférieur d'au moins 5 à 10°C à la température de stabilité de la microemulsion lorsque le milieu aqueux est constitué par de l'eau pure.

Par "microémulsions" on désigne dans la suite de la description de la présente demande des solutions isotropes limpides et stables composées d'une solution aqueuse d'agent tensioactif dans laquelle une huile est dispersée sous la forme de globules dont la taille peut varier de quelques dizaines à quelques centaines d'Angstrδm.

Le terme "milieu aqueux" désigne dans la présente description aussi bien l'eau pure que les solutés de remplissage et tous les milieux aqueux physiologiquement acceptables par exemple l ^' es solutions aqueuses salines ou les solutions aqueuses amylacées.

A titre de tels milieux, on peut citer notamment la solution physiologique de Ringer lactate et les solutions contenant de l'amidon soluble (H.E.S.) ou de la gélatine modifiée ainsi que le "Plas ion". Dans les microémulsions selon l'invention, on peut utiliser un fluorocarbure quelconque c'est- à-dire un produit organique entièrement ou presque entièrement fluoré, non miscible à l'eau.

Toutefois, dans le cadre d'applications bio- logiques des microémulsions selon l'invention, c'est- à-dire à titre de transporteurs d'oxygène, il convient d'utiliser des composés fluorés, chimiquement iner¬ tes, non toxiques. D'autre part, pour ces applications biologiques, ces composés fluorés ne doivent pas ou pratiquement pas s'accumuler dans l'organisme; ils doi¬ vent posséder une tension de vapeur suffisamment faible pour qu'ils n'entrent pas en ébullition dans l'orga¬ nisme et avoir une aptitude importante à transporter 'oxygène,par exemple d'au moins 30%. A titre d'exemples de tels fluorocarbures, on pourra citer les fluorocarbures cités dans les brevets FR 71.31.983, 74.06.360 et 74.03.244.

Parmi les fluorocarbures appropriés on ci¬ tera plus particulièrement : - les perfluorocycloalcanes ou les perfluoro- alkylcycloalcanes ;

- les perfluoroalcanes et les fluoroalcanes partiellement hydrogénés saturés ou insaturés, tels que les produits de formules : les produits de formule g ³ énérale CnF2-n+l. -CH≈CHCmF2-m+l, i et jn étant des nombres entiers, les composés hétérocycliques perfluorés alkyl-substi- tués, les aminés tertiaires perfluorées, les éthers

perfluorés.

A titre d 'exemple≤préférés de tels fluoro- carbures, on mentionnera les composés ci-après :

- perfluorodé câline,

- perfluorotributylamine,

- perfluorotripropylamine,

- perfluorométhyldécaline,

- perfluoroadamantane,

- perfluorodi éthyladamantane et

- perfluorodécane.

A titre d'agents tensio-actifs fluorés non ioniques appropriés aux fins de l'invention, on cite¬ ra les agents tensio-actifs du type polyoxyéthylène- fluoro-alkyléther.

Lorsque les microémulsions selon l'invention sont utilisées comme transporteurs d'oxygène dans l'organisme il importe de choisir des agents tensio- actifs fluorés non ioniques non toxiques et pharma- ceutiquement compatibles et une température de stabi¬ lité voisine des températures atteintes par le corps humain, c'est-à-dire comprise entre environ 35 et 40°C.

Une classe particulièrement préférée d'agents tensio-actifs du type polyoxyéthylène-fluoro-alkyl¬ éther est celle des composés répondant à la formu¬ le générale :

R _F (CH ₂ ) (0C ₂ H^) _n 0H, dans laquelle - est une chaîne fluorocarbonée ou fluorocarbonée partiellement hydrogénée, j est un nombre entier au moins égal à 1. Ces composés peuvent être obtenus par le procédé qui fait l'objet de la demande de brevet FR S0.22.S74 dé¬ poséele 24 Octobre 1980 au nom du demandeur et intitulée "procédé pour la synthèse de composés hydrogénés et/ou

fluorés du type polyoxyéthylène-alkyl-éthe , composés de ce type et application à titre d'agents tensio- actifs non ioniques". Parmi ces composés, on citera tout particulièrement les composés de formules :

0H _;

On a trouvé de façon surprenante que l'on pouvait obtenir une. microemulsion stable à une température donnée en mélangeant simplement des quant _^ i . t _^ é * s ad Jé'quat _^ es d _ιes J t_rois const _^ i . t _* .uan détsin ciie-d .essus et en chauffant le mélange résultant jusqu'à la température de stabilité de la microemulsion désirée.

On a en effet trouvé qu'il existe des zones de concentrations relatives de ces trois constituants pour lesquelles on obtient, à une température donnée, une microemulsion stable. Si la température de la microemulsion obtenue est modifiée, par exemple au cours du transport ou lors' de la conservation au réfrigérateur ou de la stérilisation, la microemul¬ sion limpide se reforme de la même façon par agitation à la température de stabilité de la microemulsion considérée. Cette microemulsion est stable indéfini¬ ment dans le temps au voisinage de sa température de stabilité. On a également trouvé que pour un fluorocarbure donné la zone de stabilité de la micro¬ emulsion à une température donnée se déplace vers les fortes teneurs en fluorocarbure et les faibles teneurs en agent tensio-actif lorsque l'on diminue 1 'hydrophilie de l'agent tensio-actif. Il se produit un effet iden¬ tique lorsque l'on ajoute des sels ou des macromolé¬ cules de type amidon soluble (H.E.S.), ou gélatine modifiée.

Il convient d'utiliser aux fins de l'invention, lorsque le milieu aqueux est de l'eau pure, un agent

tensio-actif fluoré non ionique présentant un point de trouble inférieur à la température de stabilité de la micro-émulsion désirée et plus particulière¬ ment inférieur d'au moins 5 à 10°C à cette tempéra- ture de stabilité.

L'écart entre le point de trouble de l'agent tensio-actif et de la température de stabilité dépend d'une part du fluorocarbure, par exemple, dans le cas de fluorocarbures linéaires de même type, de la longueur de la chaîne fluorocarbonée et d'autre part, des différents additifs présents dans.la phase aqueuse (sels, macromolécules).

Comme on l'a indiqué ci-dessus, cet écart doit être d'au moins 5 à 10°C lorsque le milieu aqueux est constitué uniquement d'eau pure. Par contre, lorsqu'on ajoute des sels ou des macromolécules dans le milieu aqueux constitué d'eau pure, le tensio-actif, néces¬ saire pour obtenir une microemulsion occupant une position sensiblement comparable à celle de la micro- emulsion sans sel ni macromolécule (c'est-à-dire ayant sensiblement la même concentration en fluorocarbure et la même température de stabilité), doit être plus hydrophile (HLB plus élevé) c'est-à-dire avoir un point de trouble supérieur à celui du tensio-actif mis en oeuvre pour obtenir la micro-émulsion dans de l'eau pure. Si on utilise le même agent tensio-actif dans les deux cas, la température de stabilité de la microemulsion contenant la même proportion de fluo- rocarbure et d'agent tensio-actif mais contenant plus de sels ou de macromolécules, sera, si la concentra¬ tion en additifs est notable, inférieure à celle de la microemulsion formée avec de l'eau pure.

Il sera aisé à l'homme de l'art de déterminer, pour un fluorocarbure et un agent tensio-actif fluoré non ionique donnés, par des essais de routine, la

OMPI

température à laquelle se forme la microemulsion. Pour obtenir une microemulsion dudit fluorocarbure stable à une autre température,il y aura lieu de modifier les proportions relatives des trois consti- tuants du mélange ou de choisir un agent tensioactif fluoré non ionique ayant une hydrophilie supérieure ou inférieure à celui utilisé pour la détermination ci-dessus,suivant que la température de stabilité de la microemulsion souhaitée est supérieure ou inférieu- re à celle définie ci-dessus.

A titre indicatif on précisera que lorsque le ten¬ sio-actif fluoré non ionique est du type polyoxyéthy- lène-fluoro-alkyl-éther,ayant un nombre bien défini de motifs éther,on peut obtenir des microémulsions de perfluorodécaline,du fluorocarbure de formule

CgF._CH=CH ₂ ou de perfluorotributylamine stables à 37°C et pouvant incorporer des quantités notables d'oxygène,en utilisant des agents tensio-actifs de ce type ayant un point de trouble inférieur ou voisin de 0°C.Des exemples de tels tensio-actifs sont ceux ayant 6 7 atomes de carbone dans le radical Rp et 5 ou 6 motifs éther.

Il importe alors de déterminer pour chaque fluoro¬ carbure et pour un agent tensio-actif donné la zone de concentrations qui procure une microemulsion stable à une température donnée.

Il sera aisé à l'homme de l'art de déterminer ces zones par des essais de routine et d'établir pour chaque fluorocarbure le diagramme ternaire comportant ladite zone de concentration appropriée pour un agent tensio-actif donné.

Pour déterminer ces zones de concentration, on

forme par exemple des mélanges binaires avec deux des trois constituants de la microemulsion et, à la tempé¬ rature souhaitée de stabilité, on ajoute des quantités croissantes du troisième constituant et on note la quantité qui permet l'obtention de la microemulsion limpide ; cette quantité constitue la limite infé¬ rieure de la zone de concentration pour le système binaire considéré. On augmente ensuite la concentra¬ tion du troisième constituant jusqu'à la démixtion pour fixer la limite supérieure de ladite zone. Ensuite, on fait varier la concentration relative du système binaire de départ et on opère de la même façon. Ce mode opératoire est répété un nombre suffisant de fois pour obtenir avec précision la zone de concentration appropriée et on établit ainsi le diagramme pour chaque système ternaire correspondant.

Les figures 1 à 4 annexées sont les diagrammes spécifiques pour les systèmes ci-après : Fig. 1 : eau/perfluorodécaline/C-F. ₅ CH_ (OC-H. )-OH Fig. 2 '. eau/CgF^CH = CH ₂ / C ₇ F ₁₅ CH ₂ (OC _j H^OH

Fig. 3 : solution de Ringer lactée /C _a F, ₇ CH = CH _? /

C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0 _{W ό} 0H Fig. 4 : eau/perfluorodécaline / C.F. _^ CH-fOC-H^)cOH Ces diagrammes ont été déterminés selon le mode opératoire ci-dessus ; les zones hachurées cons¬ tituent les zones de concentrations appropriées pour des températures de stabilité d'environ 37°C et 25°C respectivement.

Ainsi, comme on peut le voir sur la figure 1, pour obtenir une microemulsion stable à environ 37°C avec la perfluorodécaline et l'agent tensio-actif de formule C-F _{j ς} CH-COC^ H^) OH il faut utiliser en poids : environ 0 à 55 % de la perfluorodécaline, environ 0 à 15 % de l'agent tensio-actif C ₇ F, ₅ CH (OC H^) ₅ 0H, le complément étant de l'eau.

Pour obtenir une micro mulsion stable à environ 37°C avec le fluorocarbure de formule (voir figure 2) il faudra utiliser 0 à 60% dudit fluorocar¬ bure, 0 à 20% de l'agent tensio actif C^^CH^OC^Jg OH, le complément étant de l'eau.

Pour obtenir une microemulsion stable à envi¬ ron 25°C avec les mêmes constituants, il faudra uti¬ liser 0 à 45% dudit fluorocarbure, 0 à 25% de l'agent tensio-actif C ₇ F. ₅ CH ₂ (0C ₂ H. ) _≤ 0H, le complément étant de l'eau.

Pour obtenir une microemulsion stable à envi¬ ron 47°C avec le fluorocarbure de formule Cg ._ CH=CH ₂ , le milieu aqueux étant constitué de la solution lactée de Riπger il faudra utiliser (voir figure 3):

0 à 20% de l'agent tensioactif de formule ~ ^e c° ^m Plément étant constitué de la solution de Ringer-lactate.

Pour obtenir une micro mulsion stable à 37°C de perf luorodécaline dans l'eau (voir figure 4) il con¬ vient d'utiliser :

0 à 45% de perfluorodécaline 0 à 50% de l'agent tensio-actif CgF,-CH ₂ (OC-H^-OH le complément étant de l'eau. Pour obtenir une microemulsion stable à 25°C, il faudra utiliser pratiquement les mêmes gammes comme on peut le voir sur la figure 4.

Lorsque l'on a déterminé le diagramme ternaire d'un système eau/fluorocarbure/agent tensio-actif, à une tempéra- ture donnée, par exemple à 37°C, il est alors possible de prévoir l'évolution de la position de la zone de la microemulsion, à cet¬ te même température, lorsque l'on modifie l' hydrophilie de l'agent tensio-actif mis en oeuvre . On a trouvé en effet que lorsque l'on utilise un agent tensio- actif second plus hydrophile que l'agent actif premier, utilisé pour établir la zone de microemulsion d'un fluorocar-

ÎÎRË

bure donné à une température donnée, on obtient à la même température, une zone de microemulsion déplacée vers la base H_0 / agent tensio-actif du diagramme c'est-à-dire que le rapport massique fluorocarbure / agent tensio-actif second est plus faible que le rapport massique fluorocarbure/agent tensio-actif premier. Inversement, lorsqu'on utilise un agent tensio-actif second moins hydrophile que l'agent tensio-actif premier la zone de microemulsion s'éloi- gne de la base H-0/agent tensio-actif.

A cet effet on peut se référer aux diagrammes des figures 1 et 4 ; pour le.- système ternaire H_0/ perfluorodécaline / C ₇ F,,-CH_ (OC-H. ) -OH, la zone de microemulsion à 37°C existe dans une gamme de composition au voisinage d'un rapport fluorocarbure/ agent tensio-actif voisin de 80/20, soit 4 alors que pour le système ternaire H_0/perfluorodécaline/ .F.,

CH ₂ (0C-H. ) ₅ 0H la zone de microemulsion à 37°C est au voisinage d'un rapport fluorocarbure / agent tensio-actif compris entre 65/35 et 60/40,soit de 1,35 à 1,50.

On notera que l'augmentation de 1 ' ydrophi ie d'un agent tensio-actif donné peut être obtenue soit par augmentation du nombre de motifs éther, soit par diminution du nombre de motifs CF_ . Comme on l'a indiqué précédemment la présence de sels ou de macromolécules modifie la position de la zone de microemulsion pour un système ternaire donné. On a trouvé que la présence de sels ou de macromolécules de type gélatine modifiée dans la phase aqueuse, a un effet comparable à celui engendré par une diminution de 1 'hydrophilie du tensio-actif, ce qui s'explique par un effet de "salting out" ou de déstructuration de l'eau bien connu pour les tensio-actifs non ioniques hydrogénés (voir à cet effet les références ci-après :

OMPI

- Friberg S. and Lapczynska I. Ptogr. Colloîd Polymer Sci. 5__, 16-20, 1975.

- Shinoda K., Takeda H., 3. Coll. Interf. Sci. 32 _, , p. 642, 1970). Ainsi, si l'on examine 'les microémulsions de perfluo- rodécaline obtenues à partir d'une solution de 20 % de C _ô F ₁₃ CH ₂ (0C ₂ H. ) ₅ 0H dans l'eau ou le Ringer Lactate, on remarque que dans le premier cas, la microemulsion à 37°C est obtenue pour des compositions de perfluo- rodecaline comprises entre 21 et 27 % alors que dans le deuxième cas elle se situe entre 24 et 29 % de perfluorodécaline, cet effet étant comparable à une diminution de 1 'hydrophilie du tensio-actif.

De la même façon, avec les microémulsions de perfluorodécaline obtenues à partir de solutions de

20 % de C _? F ₅ CH ₂ (0C ₂ H _> ) ₆ 0H dans l'eau ou le "Plasmion", on remarque que dans le premier cas la microemulsion à 37°C est obtenue pour des compositions en perfluoro- décaline comprises entre 9 et 16% alors que dans le deuxième cas, la microemulsion est obtenue pour des compositions en perfluorodécaline comprises entre 14 et 20 % , ce comportement étant encore une fois parallèle à celui qui serait engendré par une dimi¬ nution de 1'hydrophilie du tensio-actif. Ces résultats d'essais sont indiqués respectivement sur les diagram¬ mes ternaires :

- eau ou Ringer-lactate/perfluorodécaline/C-F. ,CH_ (0C-H. )_0H de la figure 5 annexée et

- eau ou "Plasmion"/perfluorodécaline/C ₇ F ₁₅ CH (0 ₂ H^) ₆ 0H de la figure 6 annexée .

On notera que le produit connu sous la dénomi¬ nation commerciale "Plasmion" est un substitut du plasma sanguin constitué par l'addition d'une macro¬ molécule (gélatine fluide modifiée) à un soluté ioni- que équilibré du type Ringer-lactate.

L'utilisation des emulsions de f luorocarbures selon l'art antérieur comme substituts du sang, néces¬ site le mélange de l'émulsion aqueuse de fluorocarbu¬ re avec des solutés de remplissage. Selon l'inven- tion on peut obtenir des microémulsions prêtes à l' emploi, c ' est-à-dire des microémulsions contenant le fluorocarbure comme transporteurs d'oxygène et le soluté de remplissage qui constitue le milieu aqueux utilisé pour la fabrication de la microemulsion. Il peut être avantageux de fabriquer des formulations pharmaceutiques constituant des unités de micro-émul- sions de 300 ml par exemple, puisqu ' il est courant d'utiliser dans les transfusions sanguines des unités de sang ou de substituts de sang de 300 ml. Ces for- ulations pharmaceutiques sont réalisées selon des moyens connus de l'homme de l'art pour satisfaire à la législation pharmaceutique. Des exemples d'unités de 300 ml seront donnés ci-après dans les exemples il- lustratifs. La taille et la forme des particules des microémul¬ sions selon l'invention peuvent être déterminées par diffusion des neutrons aux petits angles (S all angle neutron scattering). L'examen de la courbe de diffu¬ sion de la microemulsion permet de déterminer la valeur du nom- bre d'agrégation et du rayon de giration des particules à par¬ tir des expériences effectuées aux petits angles sur les micro¬ émulsions très diluées (région riche en eau).

La comparaison de la courbe obtenue aux plus grands angles avec un modèle théorique permet de déterminer la forme des particules .

Pour le système ternaire représenté sur le diagramme température de 25°C pour un rapport massique fluorocarbure/ agent tensioactif de 1,4 les particules étaient des ellipsoïdes possédant un nombre d'agrégation voisin de 2000 et ^' un grand axe de 200 A .

On a par ailleurs constaté que la taille et

la forme des particules ne varient pas lors de la dilution de la microemulsion dans un milieu aqueux. D'autre part, on a constaté que la stabilité de la microemulsion n'est pas altérée lors de la dilution dans un milieu aqueux. Ainsi, lors de l'utilisation des microémulsions à titre de substituts du sang, leur stabilité et la taille des particules de celles-ci ne seront pas altérées dans l'organisme, puisqu'au cours de la transfusion de ces microémulsions il se produit une dilution de celles-ci dans le sang du patient. Des essais effectués avec des microémulsions selon le diagramme de la figure 2 ont en effet montré que, lors de la dilution en milieu aqueux de celles-ci, la dimension des particules n'était pas modifiée et que la stabilité de ces microémulsions était conser¬ vée.

La présente invention permet de pallier les difficultés de mise en emulsion et de mauvaise sta¬ bilité des solutions aqueuses de fluorocarbures utilisées jusqu'à présent.

Les microémulsions de l'invention trouvent une application particulière dans le domaine médical, notamment à titre de transporteur d'oxygène. Dans ce cas particulier, il importe seulement d'utiliser un agent tensio-actif non toxique chimiquement inerte, ne s'accumulant pas dans l'organisme.

Les microémulsions selon l'invention ont une capacité de fixation de l'oxygène meilleure que celle des emulsions de l'art antérieur, ce qui permet de travailler à des pressions d'oxygène plus faibles comparativement à celles nécessaires avec les emul¬ sions de l'art antérieur, ces pressions d'oxygène plus faibles se rapprochant davantage des conditions physiologiques. Les microémulsions selon l'invention sont

également appropriées pour la perfusion d'organes isolés, le transport d'azote ou de gaz carbonique ou comme additifs dans les milieux de cultures de bactéries aérobies »ou anaérobies. L'invention va être maintenant décrite plus en détail dans les exemples illustratifs ci-après. Tous les pourcentages sont en poids aussi bien dans les exemples ci-après que sur les diagrammes des figures 1 à 6. EXEMPLE 1

Préparation d'une microemulsion

H ₂ 0/CgF ₁₇ CH = CH ₂ /C _y F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H _ψ ) ₆ OH stable à 37°C.

On a déterminé la zone de concentrations spécifique de la stabilité à 37°C du système ternaire ci ^' -dessus en opérant selon le mode opératoire défini précédemment et on a établi le diagramme ternaire de la figure 2.

Dans un tube à essais on a ajouté :.. 3,5 g de CgF ₁₇ CHCH ₂ 5,2 g d'eau

1,3 g de C ₇ F ₁₅ CH ₂ ( - ^-. H^ ) ₆ OH (point de trouble < 0°C) la solution a été portée à 37°C dans un thermostat ; après agitation manuelle, on a obtenu une solution limpide stable indéfiniment à 37°C.

On a refroidi la microemulsion ainsi obtenue jusqu'à 25°C. Le mélange ternaire était alors sous la forme deux phases, une phase supérieure limpide, une phase inférieure laiteuse. On a ensuite porté ce mélange à 37°C et on a obtenu à nouveau une micro- émulsion stable qui présentait les caractéristiques identiques à celles de la microémulsioçi obtenue après mélange des trois constituants et chauffage à 37°C. De la même manière on a mélangé dans un tube

a essai s :

4 , 5 g de CgF ₁₇ CHCH ₂

4 g d ' eau

1,5 g de C _? F ₁₅ CH ₂ (OC^^OH la solution a été portée à 37°C dans un thermostat ; après une agitation manuelle, on a obtenu une solu¬ tion limpide stable indéfiniment à 37°C.

On a également obtenu une microemulsion stable à 37°C en mélangeant selon le mode opératoire ci-dessus 2,5 g de CgF ₁₇ CHCH_, 6,5 g d'eau et 1 g de C ₇ F. ₅ CH ₂ (0C ₂ H. ) OH. On a déterminé que cette microemulsion dissolvait 12 ml d'oxygène pour 100 ml de microemulsion à 37°C. EXEMPLE 2

Préparation d'une microemulsion

Ringer lactate /CgF _χ7 CH = CH ₂ C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H^) ₆ 0H stable à 37°C.

On a déterminé la zone de concentration spécifique de stabilité à 37°C du système ternaire ci-dessus en opérant selon le mode opératσire défini précédemment et on a établi une partie du diagramme ternaire représenté sur la figure 3.

Dans un tube à essai on a ^: ajouté :

3,3 g CgF ₁₇ CHCH ₂

5,7 g de solution lactée de Ringer l _. g de C ₇ F _χ5 CH ₂ (0C ₂ H^) _ό 0H le mélange a été porté à 37°C ; après agitation manuelle on a obtenu une solution limpide stable indéfiniment à 37°C. EXEMPLE 3

Préparation d'une microemulsion eau/fluorodécaline/C ₇ F ₁₅ CH ₂ (OC ₂ H^) ₅ 0H

On a déterminé la zone de concentration spé¬ cifique de la stablilité à 37°C du système ternaire ci-dessus en opérant selon le mode opératoire défini

précédemment et on a établi le diagramme ternaire de la figure 1.

Dans un tube à essai on a ajouté : 3,8 g de perfluorodécaline 5,3 g d 'eau

0,9 g de C ₇ F ₁₅ CH ₂ (OC^^OH. Le mélange a été porté à 37°C ; après agita¬ tion manuelle, on a obtenu une solution limpide stable indéfiniment à 37°C. On a également obtenu une microemulsion indé¬ finiment stable à 37°C en mélangeant : 4,16 g de perfluorodécaline 2,88 g d'eau

0,96 g de _? F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H _{ψ 5} OH On a déterminé que cette microemulsion dissolvait

17,5 ml d'oxygène pour 100 ml de microemulsion à 37°C. EXEMPLE 4

Microemulsion système C ₇ F ₁₆ /H ₂ 0/C ₇ F ₁₅ CH ₂ (OC^)g0H On a utilisé un mélange constitué de : 1,3 g C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H^) ₆ 0H

1,2 g C _y F ₁₆ 7,5 g H _£ 0

On a opéré selon le mode opératoire défini précédemment et on a obtenu une microemulsion stable à 37°C.

EXEMPLE 5

Microemulsion système perfluorotributylamine/H.,0/C. _r F ₁ _

CH ₂ (0C ₂ H _i(> ) ₅ 0H

On' a utilisé un mélange constitué de : 1,8 g perfluorotributylamine

1,2 g C ₇ F ₁₅ CH ₂ (OC ₂ H^) ₅ OH 7 g H ₂ 0 on a obtenu une microemulsion stable à 37°C. EXEMPLE 6 Microemulsion système perfluorodécaline/H^O/C,F. ,CH ₂

On a utilisé un mélange constitué de : 2,5 g de perfluorodécaline 6 g 'eau

1 . 5 g de C ₆ F ₁₃ CH ₂ ( 0C ₂ H^ ) ₅ 0H

Après avoir porté le mélange à 37°C et agité manuel¬ lement on a obtenu une microemulsion indéfiniment stable. EXEMPLE 7 :

Système perfluorodécaline/Ringer lactate/C,F.-CH (0C ₂ H^) ₅ 0H

On a utilisé un mélange constitué de :

2,9 g de perfluorodécaline

5.6 g de Ringer Lactate 1,5 g de C ₆ F ₁₃ CH ₂ (0C ₂ H^) ₅ 0H

On a porté le mélange à 37°C et après agitation manuelle, une microemulsion indéfiniment stable a été obtenue.

EXEMPLE 8 :

Système perfluorodécaline/Plasmion/C F, _ς CH^OC^. )^OH

On a utilisé un mélange constitué de :

1,9 g de perfluorodécaline

6.5 g de Plasmion

1.6 g de C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H^) ₆ 0H

Après agitation manuelle du mélange à 37°C, une micro- émulsion limpide indéfiniment stable à 37°C a été obtenue. EXEMPLE 9

On a utilisé un mélange constitué de : 1,5 g de perfluorodécaline

6.7 g H ₂ 0

1.8 g C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H^) ₆ 0H.

Après agitation manuelle à 37°C, une microemulsion limpide et indéfiniment stable à 37°C a été obtenue.

EXEMPLE 10

CgF ₁₇ CH ₂ CH ₃ /Ringer Lactate/C ₇ F ₁₅ CH ₂ (OC^) OH On a utilisé un mélange constitué de : 1,1 g C ₈ F ₁₇ CH ₂ CH ₃ - _> 1 g Ringer Lactate

0,76 g C ₇ F ₁₃ CH ₂ (0C ₂ H _i ) ₆ 0H Après agitation manuelle à 37°C, une microemulsion indéfiniment stable à 37°C a été obtenue. EXEMPLE 11 Préparation d'unités de 300 ml

En opérant selon le mode opératoire défini dans l'exemple l.on a établi les zones de concentra¬ tions appropriées pour obtenir des microémulsions indéfiniment stables avec les systèmes ternaires ci-après :

CgF ₁₇ CH = CH ₂ / C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H^) _ô 0H/Ringer-Lactate perfluorodécaline/C _ό F ₁₃ CH ₂ (0C ₂ H. ) ₅ 0H/Ringer-Lactate perfluorodécaline/C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H _i ) _é 0H/"Plasmion" et on a formé les unités de 300 ml définies ci-après : (1) 130,4 g de CgF^CH = CH _£

35,5 g de C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H^) ₆ 0H La solution a été complétée à 300 ml avec du Ringer Lactate.

(2) 108 g de perfluorodécaline 55,9 g de C ₆ F _χ3 CH ₂ (OC^) ₅ 0H

La solution a été complétée à 300 ml avec du Ringer Lactate.

(3) 56,5 g C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H^) ₆ 0H 69 . 9 g perfluorodécaline La solution a été complétée à 300 ml avec du "Plasmion"

Essais d'hémocompatibilité in vitro

On a recherché si les microémulsions selon l'invention avaient une action sur le sang humain en effectuant un thromboélastogramme, en mesurant le temps de thro bine diluée et en évaluant l'hémolyse.

A - protocole d'essais :

- le sang humain était du sang de sujets normaux, prélevé le jour de l'essai, en flacon sili- coné, et sur citrate à 9 %, dans ^" le rapport du 1/20.

- les produits (microémulsions ou témoin) mis en présence de ce sang, en proportions variables, ont permis, après 10 minutes d'incubation à la température du laboratoire, de pratiquer un thromboélastogramme sur sang total, afin de mettre en évidence une action éventuelle sur la coagulation globale selon le mode opératoire décrit par RABY C. dans Biologie des Hémorragies et des Thromboses 1 vol., Masson et Cie, Edit. Paris 1966 p.187

- un temps de thrombine diluée a été effectué sur les plasmas des sangs ayant été en contact avec les microémulsions selon l'invention pendant 30 minutes à la température du laboratoire selon le mode opéra¬ toire décrit par RABY C. à la page 119 de l'ouvrage cité ci-dessus.

- L'hémolyse a été évaluée sur ces plasmas après centrifugation du sang à 2.000 g pendant 15 minutes.

B - Microémulsions testées et témoin

Dans ces essais on a utilisé les microémulsions selon l'Invention définies ci-après :

Microemulsion R 716 C 81 tensio actif C ₇ F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H ) ₆ 0H : 12 , 62S en poids /poids fluorocarbure C 0 _Q F1. -/CH..CH..J-, 0.S , 3 % en poids/poids solution de Ringer Lactate : 69 , 1% en poids/poids Microemulsion R 716 C 82 tensio actif C ₇ F. ₅ CH ₂ (OC ₂ H^) ₆ 0H 9 , 80 % en poids/poids

Fluorocarbure : C _a F._CH=CH ₂ 35,90% en poids/poids

Solution de Ringer Lactare : 54,30% en poids/poids Comme témoin on a utilisé l'agent tensio-actif seul EF 716 c'est-à-dire le produit de formule C-F ₁₅ CH ₂ (0C ₂ H. ) _≤ 0H, en solution dans de l'éthanol, puisque ce tensio-actif n'est pas soluble dans les solutés physiologiques. A des fins de comparaison, on a également utilisé les microémulsions ci-dessus d'une part en présence d'éthanol et d'autre part en l'absence d'éthanol.

Dans la détermination du temps de thrombine on a utilisé de l'eau physiologique comme témoin. C- Résultats :

- En présence d'éthanol (V/V), une solution limpide a été obtenue avec l'agent tensio-actif. Celle-ci, ajoutée dans les proportions de 0,2 ml à 1,8 ml d'eau physiologique, a donné, après agitation, une emulsion laiteuse, instable, s' éclaircissant en 15 minutes environ, tant à la température du labora¬ toire qu'à 37°C.

- Cette emulsion, mise en présence de quatre échantillons de sang humain, à raison de 0,1 ml pour 0,9 ml de sang, a permis d'effectuer les essais dé¬ finis ci-dessus.

- Aucune action directe n'a été observée après adjonction du tensio-actif C ₇ F. ₅ CH ₂ (0C ₂ H^) _≤ 0H à du sang normal. La fluidité n'a pas été altérée, et il n'existait aucune trace d'hémolyse.

- Après recalcification, déclenchant la co¬ agulation du sang total, et dont les phénomènes sont enregistrés par le thromboelastogramme, on a constaté un léger raccourcissement de la constante "r", un allongement de "k" et une diminution de l'amplitude "amx". Ces modifications mineures n'ont pas de signi-

OMPI

fication particulière.

Microémulsions R 716 C 81 - R 716 C 82

1) En présence d'éthanol

Des essais similaires à ceux pratiqués avec l'agent tensio-actif en présence d'éthanol, ont donné des résultats identiques.

2) Sans éthanol

Ces emulsions, troubles à la température du laboratoire, ont donné des microémulsions limpides lorsqu'elles ont été portées quelques instants à 37°C.

- Utilisés purs et dilués au 1/10 en eau physiologique, sans adjonction d'éthanol, et mis en présence de sang humain dans les mêmes proportions que précédemment et pendant un laps de temps identique, R 716 C 81 et R 716 C 82 ont produit les mêmes effets que ceux déjà observés avec éthanol.

- Le temps de thrombine diluée, pratiqué dans cet essai, est très légèrement allongé par rapport au témoin constitué dans cet essai par de l'eau physiologique, le R 716 C S2 produisant les temps les plus longs. Ces temps de thrombine diluée sont indiqués dans le tableau I ci-après.

TABLEAU I Temps de thrombine

Sang I Sang II

Témoin eau physiologique 26" 28"

R 716 C 81 non dilué 28" 31"

R 716 C 81 dilué 1/10 2S" 29"

R 716 C 82 non dilué 32" 33"

R 716 C 82 dilué 1/10 31" 32"

Ces essais montrent que l'agent tensio-actif seul et les microémulsions R 716 C 81 et R 716 C 82 sont sans effet in vitro sur le sang humain, non coagulé, ne produisent pas d'activité semblable à la thrombine et ne semblent pas apporter de modifications au niveau de la membrane érythrocytaire, étant donné l'absence d'hémolyse.