L'invention concerne aussi un procédé d'analyse d'une image numérique d'un échantillon cellulaire apte à être mis en oeuvre par un logiciel. L'invention concerne encore un dispositif d'analyse d'échantillons cellulaires.

Les applications industrielles et cognitives des cellules en culture sont toujours croissantes. Sans être exhaustif, on peut citer les applications suivantes : - cellules pour la production de protéines recombinantes, - cellules pour cribler des molécules pharmacologiques, -cellules pour des tests diagnostiques, - cellules pour construire une toxicologie prédictive, - cellules pour la thérapie cellulaire de réparation de reconstruction et régénération.

De nombreux facteurs rendent encore difficiles la pleine exploitation du potentiel des cellules en culture. Ces facteurs sont entre autres : - le caractère manuel de trop nombreuses opérations techniques rendant la notion de savoir-faire extrêmement critique, - l'utilisation de nombreux facteurs indéfinis entrant dans les milieux de culture, et - la pauvreté qualitative et quantitative de systèmes cellulaires les plus diffusés.

Ces raisons expliquent qu'à l'heure actuelle les techniques de culture cellulaire sont plus proches d'une somme de savoir-faire que d'une technologie pouvant être industrialisée.

La quantification du nombre de cellules et de leur analyse morphologique est un élément critique pour le suivi cellulaire. Actuellement, pour une grande part, cette activité est manuelle et dépendant d'un savoir-faire de l'opérateur. Par ailleurs, les méthodes usuelles pour déterminer le nombre de cellules attachées, sont associées à des étapes de détachement ou de lyse cellulaire. Ces techniques font, de ce fait, disparaître toutes notions morphologiques et conduisant à des pertes d'informations importantes.

Ainsi, il existe un besoin de faciliter et d'accélérer l'analyse quantitative et/ou qualitative-telle que l'analyse de morphologie ou de répartition-des noyaux dans les échantillons cellulaires. Lesdits échantillons cellulaires pouvant être soit des échantillons de tissu provenant d'une biopsie, soit des cultures primaires de cellules soit des cultures de lignées cellulaires et ne se limitent pas à une provenance particulière. L'invention a pour but de contribuer à satisfaire ce besoin et vise notamment à automatiser au moins partiellement cette analyse tout en permettant une procédure simple et économe en temps et en moyens.

A cette fin, la présente invention propose un procédé d'analyse d'un échantillon cellulaire, comprenant les étapes de : a) coloration des noyaux des cellules de l'échantillon ;

b) acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon ; c) analyse numérique de ladite image.

Suivant des modes de réalisation préférés, le procédé comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - l'étape a) de coloration comprend une coloration cytochimique - l'étape a) de coloration comprend l'utilisation d'une technique immunoenzymatique avec au moins un anticorps ; - l'étape a) de coloration comprend l'utilisation d'une technique d'immunoperoxidase avec au moins un anticorps ; - l'étape a) de coloration des noyaux des cellules est une coloration non spécifique à l'ADN ; - entre les étapes b) et c), le procédé comprend une étape de décomposition de l'image suivant une couleur donnée ; - l'étape de décomposition de l'image est faite suivant soit la couleur de la coloration, soit suivant la couleur complémentaire à la coloration ; - l'étape de décomposition est faite suivant une des couleurs primaires de l'espace normalisé de colorimétrie Nrgb ; - la coloration est magenta, l'étape de décomposition étant réalisée suivant la composante verte de l'espace normalisé de colorimétrie ; - préalablement à l'étape c), le procède comprend une étape de binarisation des pixels de l'image pour faire ressortir les noyaux des cellules sur un fond ; - l'étape de binarisation est effectuée par application de l'algorithme de Ridler sur l'image décomposée suivant ladite couleur donnée ; - préalablement à l'étape c), le procédé comprend une étape d'élimination dans l'image binarisée d'au moins un objet ayant un nombre de pixels inférieur à un premier seuil prédéterminé ; - préalablement à l'étape c), le procédé comprend une étape de division, dans l'image binarisée, d'au moins un objet présentant un nombre de pixels supérieur à un deuxième seuil prédéterminé, en autant d'objets que de noyaux de cellules correspondant à cet objet ; - l'étape de division comprend l'érosion ultime dudit au moins un objet pour fournir des germes, puis croissance desdits germes pour déterminer des lignes de division pour l'objet par application de la méthode dite ligne de séparation des eaux ; - l'étape c) comprend le comptage des objets de l'image.

Selon un autre aspect, l'invention propose aussi un procédé d'analyse d'une image numérique d'un échantillon cellulaire apte à être mis en oeuvre par un logiciel, chaque pixel de l'image étant défini par un niveau d'intensité d'au moins une composante de couleur ou

noir et blanc parmi un nombre de niveaux d'intensité possibles supérieurs à deux, le procédé comprenant les étapes de : - binarisation des pixels de l'image pour faire ressortir les noyaux des cellules sur un fond ; et - analyse de l'image binarisée.

Suivant des modes de réalisation préféré, le procédé comprend une ou plusieurs des caractéristiques suivantes : - chaque pixel de l'image numérique est défini par un niveau d'intensité de trois composantes de couleur différente, le procédé comprenant préalablement à l'étape de binarisation, une étape de décomposition de l'image suivant une couleur donnée associant à chaque pixel de l'image un niveau d'intensité parmi un nombre de niveaux possibles supérieur à 2 ; -la décomposition est faite suivant une des couleurs primaires de l'espace normalisé de colorimétrie Nrgb ; - l'étape de décomposition est réalisée suivant la composante verte de l'espace normalisé de colorimétrie ; - l'étape de binarisation est effectuée par application de l'algorithme de Ridler sur l'image décomposée selon une couleur donnée ; - le procédé comprend, préalablement à l'étape d'analyse, une étape d'élimination dans l'image binarisée d'au moins un objet ayant un nombre de pixels inférieur à un premier seuil prédéterminé ; - le procédé comprend, préalablement à l'étape d'analyse, une étape de division, dans l'image binarisée, d'au moins un objet présentant un nombre de pixels supérieur à un deuxième seuil prédéterminé, en autant d'objets que de noyaux de cellules correspondant à cet objet ; - l'étape de division comprend l'érosion ultime dudit au moins un objet pour fournir des germes, puis croissance desdits germes pour déterminer des lignes de division pour l'objet par application de la méthode dite ligne de séparation des eaux : - l'étape d'analyse comprend le comptage des objets de l'image.

Selon encore un autre aspect, l'invention propose un dispositif d'analyse d'échantillons cellulaires, comprenant : -une platine de réception d'une boîte multipuits d'échantillons à analyser ; - un microscope ; - une caméra numérique associée au microscope, la caméra fournissant des images sous forme de pixels, chaque pixel étant défini par un niveau d'intensité d'au moins une composante de couleur ou noir et blanc parmi un nombre de niveaux d'intensité possibles supérieurs à deux ;

- un système de déplacement de la boite placée dans la platine relativement au microscope ; - un ordinateur commandant le système de déplacement et la caméra et recevant des images numériques fournies par la caméra, l'ordinateur comprenant en outre un logiciel mettant en oeuvre le procédé d'analyse d'une image numérique d'un échantillon cellulaire selon l'invention précédemment décrite.

Selon un mode de réalisation préféré, l'ordinateur est programmé pour acquérir un nombre donné d'images pour au moins un puits de la boîte placée dans la platine par commande du système de déplacement et de la caméra, et pour analyser lesdites images par application dudit logiciel.

Selon un autre aspect, l'invention propose aussi un procédé de sélection d'un milieu de culture caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de plusieurs échantillons cellulaires chacun dans un milieu de culture différent puis une analyse comme précédemment décrit.

L'invention propose selon un autre aspect un procédé de mesure de la toxicité d'une substance caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'un échantillon cellulaire en présence de la substance puis une analyse comme précédemment décrit.

Selon encore un autre aspect, l'invention propose aussi un procédé de mesure des caractéristiques cytopathologiques d'un virus caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture d'un échantillon cellulaire en présence du virus puis une analyse comme précédemment décrit.

L'invention propose aussi un procédé de sélection de substances pharmacologiques intervenant dans les maladies du surpoids ou de l'obésité caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de cellules en présence des substances à tester, la coloration des acides gras intracellulaires, puis l'acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon et l'analyse numérique de ladite image.

L'invention propose finalement un procédé de sélection de substances pharmacologiques intervenant dans l'ostéoporose caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de culture de cellules en présence des substances à tester, la coloration des cellules, puis l'acquisition d'au moins une image numérique de l'échantillon et l'analyse numérique de ladite image.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit d'un mode de réalisation préféré de l'invention, donnée à titre d'exemple et en référence au dessin annexé.

La figure 1 illustre une boîte multipuits pour échantillon cellulaire utilisée avec le dispositif selon l'invention de la figure 2.

La figure 2 illustre schématiquement la partie matérielle d'un dispositif selon l'invention.

La figure 3 illustre un exemple d'image selon la composante verte de l'espace normalisé RGB d'un échantillon cellulaire coloré en magenta.

La figure 4 représente la répartition des pixels d'une image suivant leur intensité.

Les figures 5a et 5b illustrent les images obtenues à partir de l'image de la figure 3 après binarisation et sélection des objets de petite taille dans la première et de grande taille dans la deuxième.

La figure 6 illustre l'image des germes obtenue après érosion des objets de l'image de la figure 5b.

La figure 7 illustre le résultat de la croissance de région à partir des germes de la figure 6, en montrant également les objets initiaux de la figure 5b.

La figure 8 illustre l'image finale obtenue par combinaison des images des figures 5a et 5b après scission des noyaux accolés.

La figure 9 illustre les résultats d'un test de toxicité effectué selon un procédé revendiqué par l'invention.

La figure 10 illustre les résultats d'une mesure de densité de lipides effectuée selon un procédé revendiqué par l'invention.

La figure 2 illustre schématiquement la partie matérielle d'un dispositif selon l'invention. Il comprend un ordinateur (non représenté), un microscope 2 couplé à une caméra 3, un système d'éclairage 4 et une platine 5 pour recevoir une boîte multipuits 1 contenant des échantillons cellulaires à analyser.

La boîte multipuits 1 peut être d'un type connu en soi. Généralement, les puits d'une boîte 1 ont tous une même section. Un exemple de boîte multipuits 1 présentant 12 puits est illustré par la figure 1. Les puits sont, dans ce cas, disposés régulièrement suivant quatre colonnes présentant chacune trois puits. Alternativement, il peut s'agir d'une boîte multipuits 1 présentant 96 puits auquel cas les puits ont une section inférieure et sont disposés régulièrement suivant 12 colonnes présentant chacune 8 puits.

Chaque puits est prévu pour recevoir un échantillon cellulaire à analyser.

Le microscope 2 peut être un microscope optique connu en soi.

Le dispositif comprend une motorisation permettant de positionner l'objectif 2a du microscope 2 devant n'importe lequel des puits de la boîte et donc d'observer l'échantillon contenu dans le puits correspondant. Elle permet aussi de décaler l'objectif 2a devant un même puits dans le cas où il est souhaitable d'observer successivement une pluralité de zones distinctes de l'échantillon d'un même puits, le champ d'observation du microscope 2 ne couvrant qu'une petite partie de la surface d'un puits. Préférentiellement, le microscope 2 est

fixe horizontalement et son axe d'observation est vertical-axe z-tandis que la platine 5 est motorisée pour déplacer la boîte 1 dans un plan horizontal x-y devant l'objectif 2a du microscope 2.

Le dispositif comprend également une motorisation permettant la mise au point focale du microscope 2 sur l'échantillon dans le puits sélectionné. Préférentiellement, la platine 5 est fixe verticalement alors que l'objectif 2a est motorisé pour être déplacé verticalement suivant l'axe z.

Par ailleurs, le microscope 2 est préférentiellement du type inversé. Autrement dit, l'objectif 2a du microscope 2 est placé sous la boîte 1 et observe l'échantillon contenu dans le puits placé devant son objectif 2a à travers le fond de la boîte 1. Pour cela, la boîte 1 est fait dans un matériau transparent qui peut avantageusement être une matière plastique.

L'utilisation d'un microscope 2 de type inversé permet le respect de la distance focale pour la mise au point du microscope sur l'échantillon contenu dans le puits. Au contraire, dans le cas de l'observation par le dessus de la boîte, le respect de la distance focale peut nécessiter la pénétration de l'objectif 2a du microscope 2 dans le puits, ce qui est généralement exclu en raison de la taille de l'objectif 2a.

La. caméra 3 permet d'acquérir sous forme numérique l'image de l'échantillon fournie par le microscope 2. La caméra 3 fournit l'image numérique à l'ordinateur via une liaison 3a quelconque adéquate.

La caméra 3 est préférentiellement de type couleur codant pour chaque pixel trois couleurs primaires sur un certain nombre de niveaux d'intensité, de préférence au moins 16 niveaux pour chaque composante pour que les noyaux des cellules se distinguent suffisamment du fond et du cytoplasme.

En fait, la caméra 3 peut avantageusement être du type CCD ou tri-CCD fournissant une, image numérique en couleur, par exemple du type classique fournissant les composantes R, V et B de chaque pixel avec l'intensité de chaque composante codée sur 256 niveaux, et permettant donc de coder 2563 couleurs.

Le système d'éclairage 4 éclaire le puits de la boîte 1 situé devant l'objectif 2a du microscope 2. En l'occurrence, l'éclairage est réalisé par le dessus de la boîte 1. Autrement dit, le microscope 2 observe les échantillons contenus dans la boîte 1 en lumière transmise. Le système d'éclairage 4 peut avantageusement comprendre des filtres permettant de sélectionner un type de lumière donné en fonction de la nature de l'échantillon à analyser. Similairement, l'intensité de l'éclairage peut être réglable pour sélectionner une intensité donnée en fonction de la nature de l'échantillon à analyser.

Le temps de pose et l'ouverture de diaphragme de la caméra 3 pour acquérir une image fournie par le microscope 2 peuvent également être variables et sélectionnés en fonction de la nature de l'échantillon à analyser.

Pour une automatisation complète du dispositif, il est avantageux que l'ordinateur commande tous les éléments décrits grâce à un logiciel de pilotage adéquat. Ainsi, l'ordinateur peut commander le déplacement de la platine 5, la mise au point focale et le grossissement du microscope 2 et la caméra 3. Concernant la caméra 3, l'ordinateur commande le déclenchement de la prise de vue ainsi que les réglages du temps de pose et de diaphragme Le réglage du système d'éclairage 4 est éventuellement manuel. car l'intensité d'éclairage et le ou les filtres sélectionnés sont généralement les mêmes pour tous les puits d'une même boîte 1 et ne nécessitent donc pas d'intervention au cours de l'analyse successive de l'ensemble des puits de la boîte. Néanmoins, le système d'éclairage 4 peut avantageusement être piloté par l'ordinateur, ce qui permet une automatisation plus complète et évite d'éventuelles erreurs de réglage manuel concernant l'intensité lumineuse ou le ou les filtres sélectionnés.

A titre d'exemple, il peut être utilisé le matériel disponible dans le commerce suivant : - microscope 2 : Nikon TE 2000-E avec une platine 5 motorisée x-y du type PRIOR ; - caméra 3 CCD : Nikon DMX 1200.

L'ordinateur peut être d'un type classique tel qu'un compatible PC muni des interfaces entrées/sorties requises pour commander le dispositif et recevoir les images numériques de la caméra 3. De façon classique, il comprend aussi des interfaces utilisateurs telles que clavier et écran d'affichage.

Le logiciel de pilotage du microscope 2, de la caméra 3, du système d'éclairage 4 et de la platine 5 peut être le logiciel LUCIA-G de la société Laboratory hnaging (République Tchèque).

Nous allons maintenant décrire la préparation des échantillons cellulaires à analyser qui sont placés dans les puits d'une boîte multipuits 1.

Des cellules sont cultivées dans les puits de la boîte multipuits 1 dans différentes conditions de culture pour analyser les conséquences de ces conditions expérimentales par exemple sur la croissance cellulaire, sur des paramètres de cycle cellulaire ou sur la fréquence de différenciation. A la fin du temps expérimental, les cellules sont colorées et éventuellement fixées, l'analyse pouvant être pratiquée au choix sur des cellules vivantes ou fixées. Si les cellules sont fixées, on procède préférentiellement à leur fixation avant de procéder à leur coloration.

La fixation des cellules stoppe l'évolution cellulaire des échantillons afin d'assurer que le temps expérimental défini soit respecté notamment dans le cas où l'analyse de l'échantillon n'intervient pas immédiatement à l'issue de ce temps. Par ailleurs, la fixation des cellules permet aussi de figer leur répartition dans l'échantillon dans un souci de fiabilité de l'analyse

dans le cas où des zones distinctes de l'échantillon sont observées successivement au microscope 2.

Les cellules sont colorées pour révéler les noyaux naturellement translucides. A cette fin, s'agissant des colorations, il est avantageux de recourir à une coloration de cytochimie notamment après avoir recouru à une fixation alcoolique. Les colorants de cytochimie présentent l'avantage de la simplicité de mise en oeuvre, de la robustesse, d'un bon rapport signal sur bruit et de la très bonne conservation. De plus, les analyses peuvent se faire simplement en lumière blanche. Quant à la fixation alcoolique, elle est avantageuse car elle constitue une forme de fixation rapide, qui n'interfère pas avec les techniques de coloration.

Le fait de révéler les noyaux permet au dispositif de l'invention d'acquérir des images de l'échantillon et traiter automatiquement celles-ci pour déterminer par exemple le nombre de noyaux de l'échantillon, leur morphologie et caractériser leur distribution. Par voie de conséquence, il permet aussi de quantifier le nombre de cellules dans l'échantillon à partir du nombre de noyaux observés. La majorité des cellules de mammifères ne possèdent qu'un seul noyau.

Pour une analyse plus fiable, plusieurs puits de la boîte 1 peuvent contenir des échantillons cultivés dans des conditions identiques. Ainsi, il peut être tenu compte des variations intrinsèques aux systèmes biologiques et expérimentales entre échantillons de même condition. Cela de permet notamment de moyenner les analyses faites sur ces puits et donc d'avoir un résultat plus fiable. De façon simple, il peut être convenu que chaque colonne de puits de la boîte 1 soit dédiée à une même condition de culture. Le nombre de puits contenant des échantillons d'une même condition-autrement dit, le nombre de puits effectivement utilisés dans chaque colonne dans notre exemple-peut être choisi en fonction du taux d'erreur admissible pour le résultat de l'analyse, ce taux diminuant avec l'augmentation du nombre d& puits avec une même condition de culture.

Nous allons maintenant décrire le procédé d'analyse mis en oeuvre par un logiciel de commande et d'analyse exécuté par l'ordinateur du dispositif selon l'invention décrit précédemment. Ce logiciel de commande et d'analyse commande la partie matérielle du dispositif par le biais du logiciel de pilotage précité et réalise l'analyse des images numériques fournies par la caméra 3. Avant de lancer l'analyse d'échantillons par l'ordinateur, un opérateur place dans la platine 5 une boîte multipuits 1 contenant des échantillons cellulaires à analyser dans ses puits.

Dans une première étape, l'ordinateur sollicite l'opérateur pour que celui-ci indique le type des échantillons cellulaires à analyser. Cela peut être réalisé par choix de l'opérateur

dans un catalogue prédéfini de types proposé par l'ordinateur. Le type d'échantillon prend en compte à la fois le type de cellules à analyser et le type de colorations histologiques appliquées à celles-ci.

Dans le cas où le dispositif est prévu pour fonctionner avec différents types prédéterminés de boîtes multipuits 1 tels que les boîtes 12 puits et 96 puits précités, l'ordinateur sollicite l'opérateur pour que celui-ci indique le type de boîte 1 placé dans la platine 5. Alternativement, il peut être prévu une reconnaissance automatique du type de boîte 1 par le dispositif par exemple à l'aide d'une marque de couleur spécifique au type de la boîte et placé à un endroit prédéterminé de celle-ci. L'ordinateur pilote la platine 5 pour faire observer la marque au microscope 2 et fournir l'image numérique correspondante à l'ordinateur par le biais de la caméra 3. En déterminant la couleur de la marque, l'ordinateur détermine le type de boîte 1 concerné.

Comme indiqué, il peut être prévu que la boîte 1 ait, pour chaque condition de culture, un nombre de puits donné présentant des échantillons de cette condition de culture. Ce nombre peut être laissé au choix de l'opérateur pour lui permettre de sélectionner le taux d'erreur d'analyse acceptable. Dans ce cas, l'ordinateur sollicite l'opérateur pour qu'il lui indique ce nombre. La topologie de répartition des échantillons de même condition dans les puits de la boîte 1 est préférentiellement prédéfinie pour éviter à l'opérateur de devoir la fournir à l'ordinateur.

Dans une deuxième étape, si le dispositif le permet, l'ordinateur règle l'éclairage du système d'éclairage 4 en fonction du type d'échantillons cellulaires précédemment sélectionné par l'opérateur. A défaut, c'est l'opérateur qui règle le système d'éclairage 4 si celui-ci n'est pas commandé par l'ordinateur. Dans ce cas, l'ordinateur peut éventuellement , O , lui indiquer les réglages à faire.

Dans une variante simplifiée, le système d'éclairage 4 ne comprend pas de filtres sélectionnables et/ou de réglage d'intensité. En particulier, il peut être prévu que l'éclairage soit toujours le même quel que soit le type d'échantillon concerné, par exemple de la lumière blanche.

Dans une troisième étape, l'ordinateur procède à l'acquisition d'images des échantillons à analyser. Pour cela, il place successivement les puits de la boîte 1 contenant les échantillons devant l'objectif 2a du microscope 2 en commandant la platine 5.

Pour chaque puits, l'ordinateur fait prendre un nombre prédéterminé N d'images distinctes de l'échantillon par la caméra 3 en décalant à chaque fois le puits devant l'objectif 2a par commande de la platine 5. L'ordinateur commande la mise au point focal du microscope 2. Il procède aussi au réglage du diaphragme et du temps de pose de la caméra 3

ainsi qu'au grossissement du microscope 2, ces réglages peuvent être fonction du type d'échantillon sélectionné.

Ces images numériques sont transmises à l'ordinateur au fur et à mesure de leur acquisition. Dans l'exemple d'une caméra CCD ou tri-CCD classique à 2563 couleurs, l'ordinateur reçoit les valeurs des composantes R, V et B pour chaque pixel d'une image, l'intensité de chacune étant codée sur 8 bits et fournissant donc 256 niveaux d'intensité pour chaque composante. L'ordinateur stocke ces images de préférence sur son disque dur.

Les N images sont de préférence inscrites à l'intérieur du puits afin d'éviter que les images ne comprennent des parties extérieures au puits. A défaut, l'analyse des images nécessiterait des traitements supplémentaires pour distinguer l'intérieur du puits de l'extérieur.

Les N images peuvent être prises en des positions prédéterminées de l'échantillon ou en des positions aléatoires.

Préférentiellement, chaque image couvre une zone de l'échantillon qui lui est spécifique et qui ne recouvre pas tout ou partie d'autres images de façon à éviter la redondance qui viendrait diminuer la représentativité des images acquises par rapport à l'ensemble de l'échantillon.

Dans une quatrième étape, l'ordinateur décompose chaque image couleur en une image suivant une couleur unique donnée qui fournit une bonne distinctivité entre les objets à analyser-les noyaux-et le fond de l'image.

La couleur unique dans laquelle chaque image est décomposée est fonction du type d'échantillon à analyser, et plus particulièrement de la coloration histologique effectuée.

Typiquement, pour fournir une bonne distinctivité, la décomposition de l'image peut se faire soit suivant la couleur de la coloration histologique, soit suivant la couleur complémentaire à ? celle-ci.

Dans le cas d'une coloration de cytochimie en magenta, il est avantageux que l'ordinateur décompose chaque image couleur en une image suivant la composante verte de l'espace RGB normalisé (noté classiquement Nrgb). En effet, G le vert est la couleur complémentaire du magenta. De plus, l'espace RGB normalisé fournit une meilleure discrimination en comparaison des composantes R, V, B fournies par la caméra du fait que l'espace normalisé est moins sensible aux variations de luminosité. Ainsi, pour chaque pixel d'une image acquise, l'ordinateur calcule le niveau d'intensité de la composante verte'g'de l'espace RGB normalisé comme suit : g=G/ (R+G+B) avec R, G et B les valeurs des composantes rouge, verte et bleue fournies par la caméra 3.

La figure 3 illustre un exemple d'image selon la composante verte de l'espace normalisé RGB d'un échantillon cellulaire coloré en magenta. Plus le niveau d'intensité est faible, plus

la représentation du pixel est sombre. Ainsi, les pixels des noyaux présentent un niveau d'intensité nettement plus faible en comparaison des pixels du fond qui présentent un niveau d'intensité élevé.

Dans une variante simple, au lieu de décomposer chaque image suivant une composante d'un autre espace colorimétrique, l'ordinateur peur retenir chaque image suivant l'une des composantes R, V, B fournie par la caméra 3, par exemple l'image suivant la composante V dans le cas d'une coloration de cytochimie en magenta, bien que la distinctivité soit moindre.

Dans une variante encore plus simple, la caméra 3 fournit des images en noir et blanc au lieu d'être en couleur auquel cas cette quatrième étape est omise.

Dans une cinquième étape, l'ordinateur fournit une version binarisée de chaque image issue de la quatrième étape discriminant les noyaux et le fond. Pour cela, un seuil d'intensité est défini pour discriminer les pixels considérés comme appartenant aux noyaux des pixels considérés comme appartenant au fond. En d'autres termes, l'ordinateur compare l'intensité de chaque pixel de l'image issue de la quatrième étape à ce seuil et lui attribue une première valeur-0-ou une deuxième valeur-1-en fonction du résultat de la comparaison. Dans la suite, nous considérons que la valeur'l'correspond aux pixels de noyaux et'0'au reste.

Dans un souci de fiabilité de l'analyse, il est préférable pour l'ordinateur de déterminer à chaque fois ce seuil plutôt que d'appliquer une valeur fixe prédéterminée de ce seuil pour un type de coloration de cytochimie donnée, étant donné la variabilité de la coloration des noyaux. Autrement dit, il est préférable que l'ordinateur détermine ce seuil spécifiquement pour chaque image.

Pour déterminer le seuil à appliquer, l'ordinateur peut mettre en oeuvre une technique quelconque adéquate connue en soi pour déterminer automatiquement un tel seuil.

La technique appliquée par l'ordinateur peut être fonction du type de l'échantillon.

Dans ce but, l'ordinateur peut notamment appliquer à l'image issue de la quatrième étape un algorithme mettant en oeuvre la méthode itérative de Ridler qui est connu en soi. Cet algorithme procure un excellent résultat dans le cas d'un histogramme de répartition bi-modale des pixels suivant leur intensité. La répartition est bi-modale dans le cas où seuls les noyaux des cellules sont colorés par la coloration histologique. La figure 4 représente un tel histogramme pour l'image de l'échantillon cellulaire de la figure 3. L'axe des abscisses représente l'intensité lumineuse codée en 256 niveaux et l'axe des ordonnées le nombre de pixels.

Dans certains cas, la répartition est tri-modale. Ce peut être le cas lorsque le cytoplasme des cellules se colore également, mais à un degré moindre que les noyaux, lors de la coloration histologique. Dans ce cas, le seuil peut être déterminée par deux applications successives de l'algorithme de Ridler. La première application fournit le seuil permettant de discriminer le fond du reste : noyau et cytoplasme dans notre exemple. Une deuxième

application de l'algorithme à la partie de l'histogramme comprenant seulement le reste, c'est- à-dire la partie de l'histogramme limitée à ce seuil, permet de fournir un second seuil permettant de discriminer les noyaux de tout le reste : à la fois du fond et du cytoplasme dans notre exemple.

Le fait pour l'ordinateur d'appliquer une fois ou deux fois l'algorithme de Ridler peut être fonction du type des échantillons. Mais il est préférable que l'ordinateur détermine lui- même-de façon connue en soi-si une image présente une répartition bi-modale ou tri- modale afin d'appliquer soit une fois soit deux fois l'algorithme de Ridler.

Comme mentionné, il est préférable que l'ordinateur détermine ce seuil pour chaque image. Dans une variante simplifiée, l'ordinateur détermine ce seuil pour une seule image d'un puits et l'utiliser aussi pour les autres images de ce puits, voire encore pour les images des autres puits présentant des échantillons d'une même condition, voire en définitive pour l'ensemble des images relatives aux puits d'une même boîte 1.

Il est préférable que, dans une sixième étape, l'ordinateur élimine de l'image binarisée les objets de petite taille car ils correspondent non pas à des noyaux, mais à des artéfacts. Pour cela, l'ordinateur peut simplement compter le nombre de pixels de chaque objet et l'éliminer dans le cas où ce nombre est inférieur à un nombre prédéterminé de façon expérimentale, par exemple 50 pixels pour un grossissement de 150 fois du microscope 2. Ce nombre prédéterminé est avantageusement fonction du type d'échantillons cellulaires. Dans notre exemple, éliminer un objet consiste à placer la valeur des pixels de l'objet à'0'.

Dans une septième étape, l'ordinateur peut avantageusement effectuer un traitement sur l'image pour distinguer d'éventuels noyaux accolés de gros noyaux.

Pour cela, l'ordinateur peut créer deux images distinctes à partir de l'image binarisée issue de la sixième étape. L'ordinateur retient dans la première image tous les objets de l'image binarisée correspondant chacun à un noyau isolé en raison de la petite taille de l'objet.

Au contraire, l'ordinateur retient dans la deuxième image les objets plus grands qui peuvent en fait correspondre soit à un gros noyau isolé, soit à plusieurs noyaux accolés. Pour cela, l'ordinateur place dans la première image uniquement les objets présentant une taille inférieure à une valeur prédéterminée, par exemple 450 pixels pour un grossissement de 150 fois du microscope 2, et il place dans la deuxième image les autres objets. Là encore, dans notre exemple, les pixels des objets non repris dans une de ces images sont placées à la valeur'0'.

Cette valeur prédéterminée peut être déterminée expérimentalement. Elle peut être fonction du type des échantillons cellulaires. Les figures 5a et 5b illustrent respectivement la première image et la deuxième image obtenues dans le cas de l'image d'échantillon de la figure 3.

L'ordinateur traite ensuite la deuxième image pour diviser les objets correspondant à plusieurs noyaux. Un tel objet est divisé en autant de parties que de noyaux qu'il représente.

A cette fin, l'ordinateur peut avantageusement mettre en oeuvre la méthode connue en soi dite ligne de partage des eaux (ou « watershed » en anglais). Pour cela, à partir d'une copie de la deuxième image, l'ordinateur effectue une érosion ultime de chaque objet pour en fournir son ou ses germes. Chaque germe correspond à un noyau de cellule. La figure 6 illustre l'image des germes obtenue après érosion des objets de l'image de la figure 5b.

L'ordinateur procède ensuite à une croissance de région à partir des germes, la croissance étant stoppée lorsque deux régions se rencontrent. La figure 7 illustre le résultat de la croissance de région en montrant les objets initiaux de la figure 5b. Les frontières entre régions servent ensuite à segmenter les objets de la deuxième image. A cet effet, l'ordinateur place les pixels des frontières à la valeur du fond dans la deuxième image ; dans notre exemple, il affecte la valeur *0'à ces pixels. Par conséquent, les objets sont scindés en conséquence en autant de parties que de germes obtenus par érosion ultime.

La deuxième image après scission des noyaux le cas échéant est combinée avec la première image qui contient les objets de petites tailles réputés correspondre chacun à un noyau isolé. Il en résulte une image qui montre tous les noyaux de l'échantillon et qui sont chacun séparés des autres. La figure 8 illustre l'image résultante obtenue pour l'image d'échantillon de la figure 3 avec les flèches référencées'S'qui pointent quelques segmentations résultant de la septième étape.

Dans une huitième étape, l'ordinateur procède à l'analyse des objets contenus dans l'image issue de la septième étape par des techniques d'analyse d'image connues en soi.

En particulier, il compte le nombre d'objets contenus dans l'image, ce qui fournit le nombre de noyaux contenus dans l'échantillon puisque chaque objet correspond à un noyau.

A titre d'exemple non limitatif, l'ordinateur peut également déterminer pour chaque noyau l'une ou plusieurs des informations suivantes : - la surface du noyau ; - le périmètre du noyau ; - la direction principale ; - les coordonnées dans l'image ; - la longueur du petit axe et du grand axe de l'ellipse qui modélise le mieux l'objet.

L'ordinateur peut bien évidemment sauvegarder ces résultats dans un fichier.

Dans une neuvième étape, l'ordinateur peut déterminer des informations relatives à l'échantillon complet d'un puits à partir des données obtenues pour l'ensemble des images de ce puits. Ainsi, il peut estimer le nombre total de noyaux contenus dans le puits en fonction du

nombre de noyaux contenus dans les N images acquises de ce puits au vu du rapport prédéterminé entre la surface partielle du puits couverte par les N images et la surface totale du puits. I1 est aussi possible de déterminer la densité cellulaire en calculant le nombre de noyaux présents comme précédemment décrit et en divisant ce nombre par la surface de l'image.

L'ordinateur peut également établir des statistiques sur chaque puits concernant les autres caractéristiques déterminées, notamment celles listées précédemment.

Dans le cas d'une pluralité de puits contenant des échantillons d'une même condition, l'ordinateur peut moyenner les informations relatives à ces puits pour diminuer le taux d'erreur.

A partir de là, l'ordinateur peut aussi calculer le nombre de divisions cellulaires et le temps nécessaire pour que le nombre de cellules double si l'opérateur lui fournit le nombre de cellules ensemencés à l'origine dans les puits de la boîte 1 et le temps de culture en considérant que la croissance des cellules est exponentielle.

Bien entendu, l'ordinateur peut stocker, par exemple sous forme de fichiers, les résultats de l'analyse ainsi que les images acquises et/ou obtenues après traitement suivant les différentes étapes du procédé.

Pour chaque type de cellules considéré, il peut être déterminé expérimentalement les choix et paramètres procurant les meilleures résultats d'analyse qui sont ensuite mis en oeuvre de façon automatique par le procédé de l'invention. Ainsi, le procédé peut être mis en oeuvre avec des colorants cytochimies autres que le magenta. Pour chaque type de cellules, il peut être déterminé expérimentalement le colorant fournissant une bonne distinctivité des noyaux par rapport au reste. De même, le réglage de l'éclairage s'il est prévu et les réglages de la caméra-temps de pose et ouverture du diaphragme-prise de vue peuvent également être déterminés expérimentalement pour chaque type d'échantillons afin de fournir des images présentant un bon contraste des noyaux par rapport au fond.

Dans la troisième étape, le nombre N d'images prises pour l'échantillon d'un puits est au moins un. Mais, bien entendu, plus le nombre N est grand, plus la surface de l'échantillon couverte par les images est grande et plus les informations estimées par l'ordinateur pour un puits donné présenteront un taux d'erreur faible. Ce nombre N peut être déterminé de façon expérimentale pour obtenir un taux d'erreur acceptable d'analyse. A titre d'exemple, il est acquis 300 images distinctes de chaque puits d'une boîte 1 à 12 puits-chaque puits ayant un diamètre de 2.159 cm pour 1 puits et une aire de 3.66 cm2 avec un grossissement de 150 fois du microscope 2. Ces 300 images couvrent alors environ 90 % de la surface totale du puît.

A titre d'exemple, le procédé de l'invention peut être mis en oeuvre sur la base du logiciel Image JW mis à disposition par le National Institute of Health aux Etats-Unis.

Le recours aux noyaux marqués par des colorants histologiques perrnet avantageusement d'analyser avec le dispositif de l'invention de manière sensible et quantitative les conséquences des différentes conditions de culture sur la densité cellulaire et donc sur la croissance cellulaire. A ces résultats quantitatifs, il peut être associé une image numérisée des échantillons cellulaires fournie par le dispositif ainsi obtenue qui constitue alors un document d'archive et de référence. Cette manière de procéder permet de paramétrer les approches expérimentales et donc d'en augmenter la traçabilité. Un mode de réalisation avantageux utilise un colorant nucléaire tel que le Giemsa. permettant une coloration du noyau cellulaire qui n'est pas une coloration de l'ADN. D'autres réactifs nucléaires non- spécifiques à l'ADN peuvent être utilisés et sont bien connus de l'homme du métier, tels que les Carmin d'Orth, Cresyl violet, Safrinine Q, Vert de malachite, Violet crystal, Hematoxyline, Eosine, Colorant de Wright, Methyl green ou le Thionin. Il en résulte une plus grande homogénéité du signal provenant du noyau et une absence de variation de l'intensité du signal en fonction des étapes de réplication de l'ADN durant le cycle cellulaire.

Il est également possible d'utiliser le dispositif de l'invention et le procédé mis en couvre avec des techniques de coloration autres que les colorations de cytochimie.

Ainsi, il peut être recouru à des colorations spécifiques des cellules auquel cas il est avantageux de recourir aux techniques immunoenzymatiques avec des anticorps caractérisés du fait de leur spécificité et de l'existence d'un grand choix d'anticorps spécifiques. En particulier, il peut être recouru aux techniques d'immunoperoxidase dont les résultats sont observables sous lumière blanche. L'emploi de ces colorations spécifiques permet notamment d'analyser avec le dispositif de l'invention, soit des paramètres de cycle cellulaire, soit des paramètres de différenciation. A titre d'exemple, le nombre de cellules en phase S peut être déterminé après marquage des cellules par du BrdU et reconnaissance des noyaux positifs à l'aide d'un anticorps dirigé contre le BrdU. Des anticorps dirigés contre différentes protéines impliquées dans le contrôle du cycle cellulaire, comme PCNA, P21, P16 et la cycline A, sont aussi utilisables. L'analyse de la différenciation peut être effectuée en utilisant des anticorps dirigés contre des facteurs de transcription spécifique d'un état de différenciation particulier. A titre d'exemple, pour la différenciation musculaire, il est recouru à des anticorps dirigés contre les facteurs de transcription spécifique du tissu musculaire, les protéines de la famille MyoD.

La coloration des cellules peut également être obtenue par l'emploi de marqueurs fluorescents. Les colorants vitaux comme le bisbenzimide qui se lient avec une affinité importante à l'ADN permettent de suivre la croissance sur des cellules vivantes et d'analyser des modifications de l'organisation de l'ADN nucléaire qui sont associés à l'apoptose. Les marqueurs fluorescents associés à des anticorps dirigés contres des protéines membranaires permet de dénombrer les cellules possédant ce marqueurs.

Bien entendu, la présente invention n'est pas limitée aux exemples et au mode de réalisation décrits et représentés, mais elle est susceptible de nombreuses variantes accessibles à l'homme de l'art. En particulier, les images acquises peuvent être traitées chacune complètement selon les étapes quatre à huit avant de passer au traitement complet de l'image acquise suivante. Par ailleurs, il n'est pas nécessaire d'attendre que toutes les N images aient été acquises dans la troisième étape pour commencer le traitement de celles déjà acquises.

Concernant la méthode itérative de Ridler, l'on peut se référer à l'article de Ridler, Calvard, « Picture Thresholding Using an Interative Selection Method », IEEE transactions on Systems, Man and Cybernetics, 1978.

Concernant plus généralement la détermination de seuil (en anglais « thresholding »), l'on peut notamment se référer à : - T. Pun, « A new method for gray level picture thresholding using the entropy of the histogram », Signal Processing, 1980, vol. 2, p. 223-237 ; - N. Otsu, « A threshold sélection method from gray level histograms », IEEE Transactions on systems, man, and cybernetics, vol. 9, p. 62-66.

Concernant la méthode dite ligne de partage des eaux, l'on peut se référer à : - R. Gonzales, R. Woods, « Digital Image Processing », Addison Wesley, 1993, p.

443-458 - 0. Lezoray, « Histogram and watershed based segmentation of color images », Proceedings of CGIV'2002, avril 2002, p. 358-362.

L'ensemble des documents précités sont incorporés par référence dans la présente description.

Le dispositif de l'invention et le procédé mis en oeuvre reçoivent diverses applications.

Un premier exemple concerne la construction de test cellulaire de toxicité prédictive mise en oeuvre sous forme d'une machine de criblage à haut débit. Au niveau cellulaire, les conséquences de la toxicité sont multiples. Les plus fréquentes sont des modifications des paramètres de la croissance cellulaire, la mort cellulaire par apoptose ou par nécrose, des modifications morphologiques et fonctionnelles. La culture, puis l'analyse automatisée selon l'invention de cellules cultivées dans des plaques multiples de par exemple 96 puits-qui permet de multiplier le nombre d'analyses-permet de fournir des systèmes toxicologiques prédictifs à haut débit. Par l'analyse d'image, il est possible d'extraire des données quantitatives sur la croissance cellulaire, sur la mort cellulaire, la morphologie et les fonctions cellulaires. Les systèmes de cultures ex vivo permettent de contrôler l'environnement cellulaire et d'utiliser des cellules spécifiques. Ainsi, l'utilisation de cellules provenant des différents tissus-tels que foie, muscle, peau, système nerveux, vaisseaux-de l'organisme

permet de tester la toxicité de molécules sur ces différents tissus et donc de construire des tests toxicologiques spécifiques.

Différent modes de réalisation de la présente invention appliqués à des tests cellulaires sont décrites ci-dessous.

I Comptage cellulaire par analyse d'image pour la détermination de la densité cellulaire afin de sélectionner un milieu de culture La croissance cellulaire est dépendante de combinaisons de facteurs qui composent des codes de croissance spécifiques. La grande majorité des éléments nécessaires pour la culture cellulaire ex vivo est à la fois connue et facile d'accès. La question est de définir les combinaisons de ces éléments, qui constituent ces codes.

L'approche décrite permet de construire un système simple et versatile pour analyser la densité cellulaire de manière quantitative et la fréquence d'expression d'un marqueur et pour stocker des images cellulaires. Les méthodes usuelles pour déterminer le nombre de cellules sont associées à des étapes de détachement cellulaire (Coulter) ou à des étapes de lyse cellulaire (MTT). Ces techniques font, de ce fait, disparaître toute notion morphologique et résultent en une perte d'informations importantes.

Le procédé selon l'invention permet d'analyser le rôle de la présence de facteur de croissance sur la densité cellulaire et sur la morphologie nucléaire.

Les étapes sont les suivantes. Les différents types cellulaires sont cultivés sur des multipuits de 12 à 96 puits dans différentes conditions de culture pour analyser les conséquences de ces conditions expérimentales, soit sur la croissance cellulaire, soit sur des paramètres de cycle cellulaire et soit sur la fréquence de différenciation. A la fin du temps expérimental, les cellules sont fixées, puis colorées. Pour les colorations cytochimiques, nous utilisons les colorants histologiques nucléaires tel que le Giemsa après une fixation alcoolique. D'autres colorants histologiques pouvant être utilisés sont les Carmin d'Orth, Cresyl violet, Safrinine Q, Vert de malachite, Violet crystal, Hematoxyline, Eosine, Colorant de Wright, Methyl green ou Thionin.

Les cellules ainsi colorées sont observées à l'aide du dispositif et procédé d'analyse selon l'invention, et plus particulièrement avec le matériel donné en exemple.

Avec ce procédé simple, robuste, versatile et d'un bon rapport signal bruit nous pouvons analyser de manière sensible et quantitative les conséquences des différentes conditions de culture sur la densité cellulaire et donc sur la croissance cellulaire. A ces résultats quantitatifs,

nous associerons une image digitalisée de cellules ainsi obtenues qui constituera un document d'archives et de référence. Cette manière de procéder nous permettra de paramétrer nos approches expérimentales et donc d'en augmenter la traçabilité, gage de qualité.

Dans cette expérience les cellules utilisées sont des cellules musculaires humaines.

Dans un premier temps, les cellules sont amplifiées en culture en présence de sérum humain (laboratoire PAA) puis ensemencées dans les différentes conditions décrites. Des facteurs de croissance peuvent être ajoutés au milieu de culture afin de promouvoir la croissance cellulaire. Les cellules sont ensemencées sur des multiples de 12. Le substrat utilisé est la gélatine et la densité d'ensemencement est 5000 cellules par puits.

Conditions de l'expérimentation : - type de boîte : 2 multipuits de 12 (TPP) - substrat : Gélatine - densité : 5 000 cellules/puits Changement de milieu : 24/05/02 27/05/02 29/05/02 31/05/02 Temps de culture : 7 jours Coloration Giemsa : Après aspiration du milieu de culture, les cellules sont lavées avec du PBS puis fixées avec de l'éthanol à 100%. 10 minutes plus tard les cellules sont lavées à l'eau puis colorées avec une solution de Giemsa à 10% pendant 10 minutes. L'étape finale est un lavage à l'eau.

Prise de vue Les images sont obtenues avec le dispositif selon l'invention, plus particulièrement avec le matériel donné en exemple.

Les résultats de cette étude sont présentés dans la table 1. Numéro Nombre Nombre de Surface Périmètre Ellipse Ellipse Angle Noyaux par de puit de photos noyaux moyenne moyen L I moyen photol, raphie 11 33 4428 407, 32 81, 15 28, 68 16, 95 92,22 134,18 5,0 13 24 2516 428,78 83,99 29,03 17,54 87, 11 104,83 5,1 15 22 2859 327,34 76,66 27,92 14,05 89,64 129,95 4,2 17 38 4473 413,96 82,25 28,6 17,23 94,59 117,71 5,0 21 28 222 650,14 115,07 36,58 20,82 85, 44 7, 93 5,6 23 21 197 531,57 92,14 30,93 20, 58 90,56 9,38 5,7 25 26 2007 327,01 74,93 27,56 14,17 88,63 77,19 4,3 27 24 2644 338, 12 78, 03 28, 13 14, 42 100, 38 110, 174 Numéro composants de puit 11 DME/F12+1%Human serum+Ins+ composant X4 13 DME/F12+1% Human serum+lns +composant X3 15 DME/F12+1% Human serum+Ins+ composant X2 17 DME/F12+1% Human serum+composant XI 21 DME/F12+1% Human serum 23 DME/F12+1% Human serum+Ins 25 DME/F12+1% Human serum+FGF 27 DME/F12+1%Human serum+Ins+FGF

Table 1 : résultats de la sélection de milieux XI, X2, X3 et X4 sont différents additifs basés sur des mélanges de facteurs de croissance.

II Analyse d'image et tests toxicologiques Définir le profil toxicologique d'une molécule est une étape indispensable pour envisager une application thérapeutique. Les systèmes de cellules fournissent de bons outils dans cette perspective. o Les accidents mortels avec les inhibiteurs de la synthèse du cholestérol de la famille des statines ont remis le tissu musculaire au premier plan comme cible toxicologique. La mauvaise évaluation de ce risque connu par Bayer pour la Cerivistatin au eu des conséquences humaines et économiques considérables.

De très nombreuses drogues sont susceptibles d'entraîner des myopathies. Dans les cas aigus et graves, on assiste à une lyse importante du tissu musculaire (rhabdomyolyse) dont le mécanisme est encore mal connu. Plusieurs hypothèses ont été émises. Certaines invoquent une augmentation de la perméabilité membranaire et d'autres des anomalies au niveau des mitochondries.

Dans la grande majorité des cas, il s'agit d'accidents survenant dans un contexte de poly chimiothérapie suggérant le rôle d'interactions médicamenteuses (macrolides, immunosuppresseurs, anticancéreux, fibrates, cocaïne, antiprotéases du HIV, anesthésiques...).

Parmi les nombreux acteurs impliqués : les cytochromes P450, les molécules impliquées dans l'apoptose comme BCL2, les antioxydants, les protéines du complexe NFKb, les PPARs ou les interventions chirurgicales.

À l'exception des accidents aigus, menaçant le pronostic vital (rhabdomyolyse), les signes cliniques d'une atteinte musculaire sont frustres, douleurs musculaires (myalgies), fatigabilité, crampes et les signes biologiques en dehors des accidents aigus les CPK sont très fréquemment normaux. Dans les cas des statines, des données récentes indiquent que les sujets présentant des atteintes musculaires ne montrent ni de corrélations entre le niveau plasmatique de cet agent pharmacologique et l'atteinte toxique, ni d'élévation des CPK. Dans ces cas l'histologie révèle dans le tissu musculaire des modifications des mitochondries (gonflement) et des accumulations de gouttelettes lipidiques.

La multiplicité des hypothèses, le rôle des interactions médicamenteuses, la pauvreté des signes cliniques et des signes biologiques obligent à la création de nouveaux outils permettant de prévoir et comprendre la toxicité au niveau du tissu musculaire.

Dans ce cas, les modèles animaux sont lourds et donc difficiles à mettre en oeuvre. Pour résoudre ces questions nous avons construit des modèles cellulaires prédictifs de la toxicité musculaire.

Dans cette expérience, nous avons utilisé des cellules musculaires humaines normales pour tester la toxicité des statines commerciales Conditions de l'expérimentation : - type de boîte : 2 multipuits de 96 (TPP) - densité : 2 500 cellules/puit - milieu de culture standard contenant des doses croissantes de Lovastatine, Cerivistatine, Atorvastatine, Pravastatine, Fluvastatine ou Simvastatine à des concentrations de 0, 0,01, 0,05, 0,1, 0, 5 et 1 gM Suivi de l'expérimentation : - 11/07 : Changement des milieux - 13/07 : Coloration. Temps de culture : 5 jours Coloration Giemsa :

Après aspiration du milieu de culture, les cellules sont lavées avec du PBS puis fixées avec de l'éthanol à 100%. 10 minutes plus tard les cellules sont lavées à l'eau puis colorées avec une solution de Giemsa à 10% pendant 10 minutes. L'étape finale est un lavage à l'eau.

Prise de vue Les images sont prises par un dispositif selon l'invention, et plus particulièrement avec le matériel donné en exemple.

L'exploitation numérique est présenté sur la figure 9. Cette figure révèle la toxicité élevée de la Cérivisatine. Cette molécule de la classe des statines a provoqué un très grand nombre d'accident toxique musculaire.

Cette expérimentation montre que l'association de type cellulaire adapté avec des systèmes d'analyse automatisée permet de développer des tests de toxicologique spécifique. Les expériences étant menées en plaque multipuits de 96 puits permettent le développement d'analyse à haut débit.

III Analyse d'image et tests virologiques.

La fonctionnalité des virus est détectée par leur capacité cytopathologique sur des cellules cibles spécifiques. Une des conséquences de l'infection virale est la lyse cellulaire.

Cette propriété est utilisée pour un test qui permet de détecter le nombre de virus fonctionnel.

Brièvement les différentes étapes de ce test sont : - la culture en micro plaque de 6 puits des cellules cibles - l'infection virale par des croissante de virus dans la gélose. Cette étape peut durer plusieurs jours - la révélation des plages de lyse après fixation et coloration - le comptage manuel de ces plages de lyse.

Les principales limitations de ce test sont la complexité des différentes étapes dépendantes de savoir-faire. Comme pour les tests de toxicologie nous utilisons la culture en micro plaque de 96 associé à l'analyse d'image pour dénombrer les cellules et ainsi quantifier les résultats. Brièvement les différentes étapes de ce test sont : - la culture des cellules cible en micro plaque de 96 puits - l'infection virale directe (sans gélose) par des quantité croissante de virus - la fixation (alcoolique) et la coloration au Giemsa (ou alternativement les Carmin d'Orth, Cresyl violet, Safrinine Q, Vert de malachite, Violet crystal, Hematoxyline, Eosine, Giemsa, Colorant de Wright, Methyl green ou Thionin).

- l'analyse des cultures avec le dispositif et procédé d'analyse selon l'invention, et plus particulièrement avec le matériel donné en exemple.

Les avantages de ce test sont la simplification des étapes biologiques, l'automatisation de la lecture des résultats. De cette manière il est possible de construire des automates dédiés à la lecture de ce type de test.

IV Analyse d'image pour la détermination de l'accumulation cellulaire de lipides Le métabolisme des lipides est une source d'énergie vitale et ce particulièrement pour le tissu musculaire ou les mesures d'oxydations qui sont basées sur la production de C02 peuvent se pratiquer directement sur du tissu musculaire ou sur les cellules musculaires isolées et cultivées.

Les déficits oxydatifs des acides gras ne sont pas limités aux pathologies monogéniques.

Ces anomalies sont aussi observées dans des maladies de surcharge comme l'obésité. La réduction des capacités d'oxydation des acides gras, par les tissus périphériques comme le muscle, est associée à certaines formes de surcharge pondérale.

Dans ces conditions de déséquilibre de la balance énergétique, les acides gras non métabolisés en excès sont alors stockés par les adipocytes et par d'autres types cellulaires.

Non oxydés, les acides gras servent aussi de substrats pour la formation de molécules comme les céramides impliquées dans l'apoptose. Cette lipoapoptose a pour cibles les cellules B- Langerhans du pancréas et les cellules cardiaques et est l'un des mécanismes physiopathologiques de l'insuffisance cardiaque et pancréatique observés dans l'obésité et le diabète de type 2.

L'utilisation de colorant de cytochimie spécifique des lipides comme l'Huile Rouge permet de visualiser au niveau cellulaire l'accumulation intracytoplasmique des acides gras.

Ce procédé permet de rendre ce type de coloration quantitative.

L'acquisition numérique des images observées au microscope avec le dispositif selon l'invention permet ensuite leur analyse pour extraire des données quantifiables ; de telles données sont présentées sur la figure 10.

Ce type d'approche combinant des cellules cibles, des colorations histologiques spécifiques et des procédés d'analyses automatisables permet de développer des tests

cellulaires pour le criblage d'agents pharmacologiques intervenants dans l'obésité ou les maladies de surcharge.

En changeant de cellules cibles (cellules adhérentes de la moelle osseuse) et de coloration histologique (Von Kossa) ce test cellulaire permet de cribler des agents pharmacologiques intervenant dans la formation osseuse (ostéoporose).