La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie en introduisant une information génétique dans la cellule ou l'organe affecté. Cette information peut être introduite soit jn vitro dans une cellule extraite de l'organe et ensuite réinjectée dans l'organisme, soit jn vivo, directement dans le tissu visé. S'agissant d'une molécule de haut poids moléculaire et de charge négative, l'ADN a des difficultés pour traverser spontanément les membranes cellulaires phospholipidiques. Différents vecteurs sont donc utilisés afin de permettre le transfert de gène : les vecteurs viraux d'une part, les vecteurs chimiques et/ou biochimiques, naturels ou synthétiques, d'autre part. Les vecteurs viraux (rétrovirus, adénovirus, virus adéno- associés,...) sont très efficaces, notamment pour le passage des membranes, mais présentent un certain nombre de risques tels que la pathogénicité. la recombinaison, la réplication, l'immunogénicité, ... Les vecteurs chimiques et/ou biochimiques permettent d'éviter ces risques (pour revues, voir Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Ce sont par exemple des cations, (phosphate de calcium, DEAE-dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'A-DN, lesquels peuvent être "phagocytés" par les cellules. Il peut également s'agir de liposomes dans lesquels l'ADN est incorporé et qui fusionnent avec la membrane plasmique. Les vecteurs synthétiques de transfert de gènes sont généralement des lipides ou des polymères cationiques qui complexent l'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. Ces particules sont capables d'interagir avec les charges négatives de la membrane cellulaire, puis de franchir celle-ci. On peut citer comme exemples de tels vecteurs le dioctadécylamidoglycylspermine (DOGS, TransfectamTM) ₀ u le chlorure de N-[l- (2,3-dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triméthylammonium (DOTMA, LipofectLnTM). Des protéines chimères ont aussi été développées : elles sont constituées d'une partie polycationique qui condense l'ADN, liée à un ligand qui se fixe sur un récepteur membranaire et entraîne le complexe dans les cellules par endocytose. Il est ainsi théoriquement possible de "cibler" un tissu ou certaines populations cellulaires, afin d'améliorer la biodisponibilité jn vivo du gène transféré.

Toutefois, l'utilisation de vecteurs chimiques et/ou biochimiques ou d'ADN nu implique la possibilité de produire des quantités importantes d'ADN de pureté pharmacologique. En effet, dans ces techniques de thérapie génique, le médicament est constitué par l'ADN même et il est essentiel de pouvoir fabriquer, dans des quantités adaptées, des ADN ayant des propriétés appropriées à un usage thérapeutique chez l'homme.

Les plasmides utilisés actuellement en thérapie génique portent (i) une origine de réplication, (ii) un gène marqueur tel qu'un gène de résistance à un antibiotique (kanamycine, ampici-line...) et (ϋi) un ou plusieurs transgènes avec des séquences nécessaires à leur expression (enhanceur(s), ρromoteur(s), séquences de polyadénylation...). Ces plasmides, utilisés actuellement en thérapie génique (au niveau d'essais cliniques tels que le traitement de mélanomes, Nabel et al.. 1992, ou au niveau d'études expérimentales), présentent cependant certains inconvénients, liés notamment à leur dissémination dans l'organisme. Ainsi, en raison de cette dissémination, une bactérie compétente présente dans l'organisme peut, à une fréquence faible, recevoir ce plasmide. Ceci a d'autant plus de chances de se passer qu'il s'agit d'un traitement de i thérapie génique -a vivo dans lequel l'ADN peut être disséminé dans l'organisme du patient et peut se trouver au contact de bactéries qui infectent ce patient ou bien de bactéries de la flore commensale. Si la bactérie receveuse du plasmide est une entérobactérie, telle qu'E- -2Qli. ce plasmide peut se répliquer. Un tel événement conduit alors à la dissémination du gène thérapeutique. Dans la mesure où les gènes thérapeutiques utilisés dans des traitements de thérapie génique peuvent coder par exemple pour une lymphokine, un facteur de croissance, un antioncogène, ou une protéine dont la fonction fait défaut chez l'hôte et permet donc de corriger un défaut génétique, la dissémination de certains de ces gènes pourrait avoir des effets imprévisibles et préoccupants (par exemple si une bactérie pathogène acquérait le gène d'un facteur de croissance humain). De plus, les plasmides utilisés en thérapie génique non virale possèdent aussi un marqueur de résistance à un antibiotique (ampicilline, kanamycine...). La bactérie acquérant un tel plasmide a donc un avantage sélectif indéniable puisque tout traitement antibiothérapique, utilisant un antibiotique de la même famille que celui sélectionnant le gène de résistance du plasmide, va conduire à

la sélection du plasmide en question. A cet égard, l'ampicilline fait partie des β- lactames qui est la famille d'antibiotiques les plus utilisés au monde. Il est donc nécessaire de chercher à limiter au maximum la dissémination des gènes thérapeutiques et des gènes de résistance. Par ailleurs, les gènes portés par le plasmide, correspondants à la partie vecteur du plasmide (fonction (s) nécessaires (s) à la réplication, gène de résistance) risquent également d'être exprimés dans les cellules transfectées. Il existe en effet un bruit de fond de transcription, que l'on ne peut exclure, dû aux signaux d'expression de l'hôte sur le plasmide. Cette expression de protéines exogènes peut être tout à fait préjudiciable dans un certain nombre de traitements de thérapie génique, du fait de leur immunogénicité potentielle et donc de l'attaque par le système immunitaire des cellules transfectées.

Il est donc particulièrement important de pouvoir disposer de molécules d'ADN médicament ayant une pureté génétique appropriée à un usage thérapeutique. Il est également particulièrement important de disposer de méthodes permettant de préparer ces molécules d'ADN dans des quantités adaptées à un usage pharmaceutique. La présente invention apporte une solution à ces problèmes. r

La présente invention décrit en effet des molécules d'ADN, utilisables en thérapie génique, ayant une pureté génétique très améliorée et de grandes propriétés de biodisponibilité. L'invention décrit également une méthode particulièrement efficace pour la préparation de ces molécules, et pour leur purification.

La présente invention réside notamment dans la mise au point de molécules d'ADN utilisables en thérapie génique, pratiquement dépourvues de toute région non- thérapeutique. Les molécules d'ADN selon l'invention, également désignées minicercles en raison de leur structure circulaire, de leur taille réduite et de leur forme supere roulée, présentent de nombreux avantages.

Elles permettent tout d'abord d'éliminer les risques liés à la dissémination du plasmide, tels que (1) la réplication et la dissémination, pouvant entraîner une surexpression non contrôlée du gène thérapeutique, (2) la dissémination et l'expression de gènes de résistance, (3) l'expression de gènes présents dans la partie non-

thérapeutique du plasmide, potentiellement immunogènes et/ou inflammatoires, etc. L'information génétique contenue dans les molécules d'ADN selon l'invention se limite en effet essentiellement au(x) gène(s) thérapeutique (s) et aux signaux de régulation de son (leur) expression (ni origine de réplication, ni gène de résistance à un antibiotique, etc). La probabilité que ces molécules (et donc l'information génétique qu'elles contiennent) soient transférées à un microorganisme, et maintenues de manière stable, est quasiment nulle.

De plus, en raison de leur taille réduite, les molécules d'ADN selon l'invention ont potentiellement une meilleure biodisponibilité in vivo. En particulier, elles présentent des capacités de pénétration et de distribution cellulaires améliorées. Ainsi, il est reconnu que le coefficient de diffusion dans les tissus est inversement proportionnel au poids moléculaire (Jain, 1987). De même, au niveau cellulaire, les molécules de haut poids moléculaire ont une moins bonne perméabilité à travers la membrane plasmique. En outre, pour le passage du plasmide au noyau, indispensable à son expression, le poids moléculaire élevé est également un inconvénient, les pores nucléaires imposant une limite de taille pour la diffusion vers le noyau (Landford êl __., i 1986). L'élimination des parties non-thérapeutiques du plasmide (origine de réplication et gène de résistance notamment) selon l'invention permet également de diminuer la taille des molécules d'ADN. Cette diminution peut être estimée à un facteur 2, en comptant par exemple 3 kb pour l'origine de réplication et le marqueur de résistance

(partie vecteur) et 3 kb pour le transgène avec les séquences nécessaires à son expression. Cette diminution (i) de poids moléculaire et (ii) de charge négative, confère aux molécules de l'invention des capacités améliorées de diffusion et de biodisponibilité tissulaires, cellulaires et nucléaires.

Un premier objet de l'invention réside donc dans une molécule d'ADN double brin ayant les caractéristiques suivantes : elle est sous forme circulaire, et elle comprend essentiellement un ou plusieurs gènes d'intérêt. Comme indiqué ci-avant, les molécules de l'invention sont essentiellement dépourvues de régions non- thérapeutiques, et en particulier d'origine de réplication et/ou de gène marqueur. En outre, elles se présentent avantageusement sous forme superenroulée.

La présente invention découle également de la mise au point d'un procédé, de constructions et d'hôtes cellulaires spécifiques, particulièrement efficaces pour la production de ces molécules d'ADN thérapeutiques. Plus particulièrement, le procédé selon l'invention réside dans la production des molécules d'ADN thérapeutiques définies ci-avant par excision à partir d'un plasmide ou d'un chromosome par recombinaison site-spécifique. Le procédé selon l'invention est particulièrement avantageux puisqu'il ne nécessite pas d'étape de purification préalable du plasmide, est très spécifique, particulièrement efficace, ne diminue pas les quantités d'ADN produites et conduit directement à des molécules thérapeutiques d'une très grande pureté génétique et d'une grande biodisponibilité. Ce procédé conduit en effet à la génération de molécules d'ADN circulaires (minicercles) contenant essentiellement le gène d'intérêt et les séquences régulatrices permettant son expression dans les cellules, le tissu, l'organe, ou l'appareil, ou même l'organisme entier où l'expression est souhaitée. En outre, ces molécules peuvent ensuite être purifiées par des techniques classiques.

La recombinaison site-spécifique peut être réalisée grâce à divers systèmes qui entraînent la recombinaison site-spécifique entre des séquences. Plus préférentiellement, la recombinaison site-spécifique dans le procédé de l'invention est obtenue au moyen de deux séquences spécifiques qui sont capables de recombiner entre elles en présence d'une protéine spécifique, généralement désignée recombinase. Pour cette raison, les molécules d'ADN selon l'invention comprennent généralement en outre une séquence résultant de cette recombinaison site spécifique. Les séquences permettant la recombinaison utilisées dans le cadre de l'invention comprennent généralement de 5 à 100 paires de bases, et, plus préférentiellement, moins de 50 paires de bases.

La recombinaison site-spécifique peut être réalisée in vivo (c'est à dire dans la cellule hôte) ou in vitro (c'est à dire sur une préparation de plasmide).

A cet égard, la présente invention fournit également des constructions génétiques particulières appropriées à la production des molécules d'ADN thérapeutiques définies ci-avant. Ces constructions génétiques, ou ADN recombinants selon l'invention comprennent notamment le ou les gènes d'intérêt encadré(s) par les

deux séquences permettant la recombinaison site-spécifique positionnées en orientation directe. La position en orientation directe indique que les deux séquences suivent la même polarité 5'-3' dans l'ADN recombinant selon l'invention. Les constructions génétiques de l'invention peuvent être des fragments d'ADN double-brin (cassettes) composées essentiellement des éléments indiqués ci-dessus. Ces cassettes sont utilisables pour la construction d'hôtes cellulaires ayant ces éléments intégrés dans leur génome (figure 1). Les constructions génétiques de l'invention peuvent également être des plasmides, c'est-à-dire toute molécule d'ADN, linéaire ou circulaire, capable de se répliquer dans une cellule hôte donnée, comportant le ou les gènes d'intérêt encadré (s) par les deux séquences permettant la recombinaison site-spécifique positionnées en orientation directe. Il peut s'agir plus précisément d'un vecteur (tel qu'un vecteur de clonage et/ou d'expression), d'un phage, d'un virus, etc. Ces plasmides de l'invention peuvent être utilisés pour transformer tout hôte cellulaire compétent en vue de la production des minicercles par réplication du plasmide puis excision du minicercle (figure 2).

A cet égard, un autre objet de l'invention réside dans un ADN recombinant comprenant un ou plusieurs gènes d'intérêt encadrés par deux séquences permettant la recombinaison site-spécifique, positionnées en orientation directe.

L'ADN recombinant selon l'invention est préférentiellement un plasmide comprenant au moins : a) une origine de réplication et éventuellement un gène marqueur, b) deux séquences permettant une recombinaison site-spécifique positionnées en orientation directe, et, c) placés entre lesdites séquences b), un ou plusieurs gènes d'intérêt.

Le système de recombinaison spécifique présent dans les constructions génétiques selon l'invention peut être de différentes origines. En particulier, les séquences spécifiques et les recombinases utilisées peuvent appartenir à différentes classes structurales, et notamment à la famille de l'intégrase du bactériophage λ ou à la famille de la résolvase du transposon Tn-J.

Parmi les recombinases appartenant à la famille de l'intégrase du bactériophage λ, on peut citer notamment l'intégrase des phages lambda (Landy et al., Science 197 (1977) 1147), P22 et Φ80 (Leong _i al., J. Biol. Chem. 260 (1985) 4468), HP1 de Haernophilus influenzae (Hauser _t _l„ J. Biol. Chem. 267 (1992) 6859), l'intégrase Cre du phage PI, l'intégrase du plasmide pSAM2 (EP 350 341) ou encore la FLP recombinase du plasmide 2 μ. Lorsque les molécules d'ADN selon l'invention sont préparées par recombinaison au moyen d'un système site spécifique de la famille de l'intégrase du bactériophage lambda, les molécules d'ADN selon l'invention comprennent généralement en outre une séquence résultant de la recombinaison entre deux séquences d'attachement __ du bactériophage ou plasmide correspondant.

Parmi les recombinases appartenant à la famille du transposon Tn2, on peut citer notamment la résolvase du transposon Tn-$ ou des transposons , Tn21 et Tn522 (Stark gj gl., 1992) ; l'invertase Gin du bactériophage mu ou encore la résolvase de plasmides, telle que celle du fragment par de RP4 (Abert _Ê Î ai-, Mol. Microbiol. 12 (1994) 131). Lorsque les molécules d'ADN selon l'invention sont préparées par recombinaison au moyen d'un système site spécifique de la famille du transposon Tn-5, les molécules d'ADN selon l'invention comprennent généralement en outre une séquence résultant de la recombinaison entre deux séquences de reconnaissance de la résolvase du transposon considéré.

Selon un mode de réalisation particulier, dans les constructions génétiques de la présente invention, les séquences permettant la recombinaison site-spécifique sont dérivées d'un bactériophage. Plus préférentiellement, il s'agit des séquences d'attachement (séquences attP et attB) d'un bactériophage ou de séquences dérivées. Ces séquences sont capables de recombiner spécifiquement entre-elles en présence d'une recombinase désignée intégrase. Le terme séquence dérivée inclut les séquences obtenues par modification (s) des séquences d'attachement des bactériophages, conservant la capacité de recombiner spécifiquement en présence de la recombinase appropriée. Ainsi, il peut s'agir de fragments réduits de ces séquences ou au contraire étendus par addition d'autres séquences (sites de restriction, etc). Il peut également s'agir de variants obtenus par mutation (s), notamment par mutation (s) ponctuelle (s).

On désigne selon l'invention par séquences attP et attB d'un bactériophage ou d'un plasmide les séquences du système de recombinaison spécifique dudit bactériophage ou plasmide, c'est-à-dire la séquence attP présente dans ledite phage ou plasmide et la séquence attB chromosomique correspondante.

A titre d'exemples préférés, on peut citer notamment les séquences d'attachement des phages lambda, P22, Φ80, PI, HPl de Haemophilus influenzae ou encore du plasmide pSAM2, ou 2 μ. Ces séquences sont avantageusement choisies parmi tout ou partie des séquences SEQ ID n° 1, SEQ ID n° 2, SEQ ID n° 6, SEQ ID n° 7, SEQ ID n° 8, SEQ ID n° 9, SEQ ID n° 10, SEQ ID n° 11, SEQ ID n° 12, SEQ ID n° 13 et SEQ ID n° 14. Ces séquences comprennent notamment la région centrale homologue des séquences d'attachement de ces phages.

A cet égard, un plasmide préféré selon la présente invention comprend :

(a) une origine de réplication bactérienne et éventuellement un gène marqueur,

(b) les séquences attP et attB d'un bactériophage sélectionné parmi les phages lambda, P22, Φ80, HPl,. PI ou du plasmide pSAM2 ou 2μ ou des séquences dérivées; et,

(c) placés entre lesdites séquences b), un ou plusieurs gènes d'intérêt.

Selon un mode particulièrement préféré de mise en oeuvre, il s'agit des séquences d'attachement (attP et attB) du phage lambda. Des plasmides portant ces séquences sont notamment les plasmides pXL2648, pXL2649 ou pXL2650. Lorsque ces plasmides sont mis, jn vivo ou in vitro, en présence de l'intégrase du phage lambda, les séquences recombinent entre elles pour générer in vivo ou in vitro, par excision, un minicercle selon l'invention comprenant essentiellement les éléments (c), c'est-à-dire la partie thérapeutique (figure 2).

Toujours selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les séquences permettant la recombinaison site-spécifique sont dérivées de la région loxP du phage PI. Cette région se compose essentiellement de deux séquences répétées inversées capables de recombiner spécifiquement entre-elles en présence d'une protéine,

désignée Cre (Sternberg et al., J. Mol. Biol. ___) (1971) 467). Dans une variante particulière, l'invention concerne donc un plasmide comprenant (a) une origine de réplication bactérienne et éventuellement un gène marqueur; (b) les séquences répétées inversées du bactériophage PI (région loxP): et (c), placés entre lesdites séquences b), un ou plusieurs gènes d'intérêt.

Selon un autre mode de réalisation particulier, dans les constructions génétiques de la présente invention, les séquences permettant la recombinaison site- spécifique sont dérivées d'un transposon. Plus préférentiellement, il s'agit des séquences de reconnaissance de la résolvase d'un transposon ou de séquences dérivées. A titre d'exemples préférés, on peut citer notamment les séquences de reconnaissance des transposons Tn-J, , Tn21 et Tn522. A titre d'exemple préféré, on peut citer la séquence SEQ ID n° 15 ou un dérivé de celle-ci (voir également Sherrat, P. 163-184, Mobile DNA, Ed. D. Berg and M. Howe, American Society for Microbiology, Washington D.C. 1989).

Selon une autre variante particulièrement avantageuse, les plasmides de l'invention comprennent en outre une séquence de resolution des multimeres. Il s'agit préférentiellement de la séquence mrs (multimer resolution System) du plasmide RK2. Plus préférentiellement, l'invention concerne un plasmide comprenant :

(a) une origine de réplication bactérienne et éventuellement un gène marqueur, (b) les séquences attP et attB d'un bactériophage en orientation directe, sélectionné parmi les phages lambda, P22, Φ80, HPl, PI ou du plasmide pSAM2 ou 2μ ou des séquences dérivées; et,

(c) placés entre lesdites séquences b), un ou plusieurs gènes d'intérêt et la séquence mrs du plasmide RK2.

Ce mode de réalisation est particulièrement avantageux. Ainsi, lorsque les plasmides pXL2649 ou pXL2650 sont mis en présence de l'intégrase du bactériophage m vivo les séquences recombinent pour générer le minicercle et le miniplasmide mais aussi des formes multimeres ou topologiques de minicercle ou de miniplasmide. Il est

particulièrement avantageux de pouvoir diminuer la concentration de ces formes pour augmenter la production et faciliter la purification de minicercle.

Les formes multimériques de plasmides sont connues de l'homme de l'art. Par exemple le fragment ç__ de ColEl (Summers et coll. 1984 Cell 36 ρl097) ou le site mrs du locus par de RK2 (L. Ebert 1994 Mol. Microbiol. 2 pl31) permettent la résolution de multimeres de plasmides et participent à une stabilité accrue du plasmide. Mais alors que la résolution au site çgr nécessite quatre protéines codées par le génome de E. eoϋ (Colloms et coll. 1990 J. Bacteriol. 172 p6973), la résolution au site mrs ne nécessite que la protéine ParA dont le gène parA est cartographie sur le locus par de RK2. A ce titre, il semble avantageux d'utiliser tout ou une partie du locus par contenant parA et la séquence mrs. Par exemple, la séquence mrs peut être placée entre les séquences attB et attP du phage lambda et le gène parA être exprimé en trans ou en cis à partir de son propre promoteur ou d'un promoteur inductible. A cet égard, un plasmide particulier de l'invention comprend : (a) une origine de réplication bactérienne et éventuellement un gène marqueur,

(b) les séquences attP et attB d'un bactériophage en orientation directe, sélectionné parmi les phages lambda, P22, Φ80, HPl, PI ou du plasmide pSAM2 ou 2μ ou des séquences dérivées,

(c) placés entre lesdites séquences b), un ou plusieurs gènes d'intérêt et la séquence mrs du plasmide RK2, et,

(d) le gène parA du plasmide RK2.

Un tel plasmide est notamment le plasmide pXL2960 décrit dans les exemples. Il peut être mis en oeuvre et permettre la production de minicercle sous forme monomérique uniquement.

Selon une autre variante avantageuse, les plasmides de l'invention comprennent deux jeux de séquences de recombinaison site-spécifique, d'une famille différente. Il s'agit avantageusement d'un premier jeu de séquences integrase-dépendantes et d'un second jeu de séquences parA-dépendantes. L'utilisation de deux jeux de séquences

permet d'augmenter les rendements de production de minicercles, lorsque la première recombinaison site-spécifique est incomplète. Ainsi, lorsque les plasmides pXL2650 ou pXL2960 sont mis en présence de l'intégrase du bactériophage in vivo, les séquences recombinent pour générer le miniplasmide et le minicercle mais cette réaction n'est pas totale (il peut subsister 5 à 10 % de plasmide initial). L'introduction, à proximité de chacune des séquences _t du phage lambda, d'une séquence mrs de RK2 permet d'augmenter la production de minicercles. Ainsi, après induction de l'intégrase du phage lambda et recombinaison Int-dépendante, les molécules non recombinées pourront être prise en charge par la protéine ParA de RK2 et pourront recombiner aux sites mrs. Inversement, après induction de la protéine ParA et recombinaison ParA- dépendante, les molécules non recombinées pourront être prise en charge par l'intégrase du phage lambda et pourront recombiner aux sites aît. De telles constructions permettent ainsi de produire du minicercle et des quantités négligeables de molécules non recombinées. Les séquences _ , de même que les séquences mrs sont en orientation directe, et les gènes inî et parA peuvent être induits simultanément ou successivement à partir du même promoteur inductible ou de deux promoteurs inductibles. Préférentiellement, il s'agit des séquences d'attachement attB et attP du phage lambda en orientation directe et de deux séquences mrs de R 2 en orientation directe.

Comme indiqué précédemment, un autre aspect de la présente invention réside dans un procédé de production de molécules d'ADN thérapeutiques définies ci-avant par excision, à partir d'un plasmide ou d'un chromosome, par recombinaison site- spécifique.

Un autre objet de la présente invention réside donc dans un procédé de production d'une molécule d'ADN (minicercle) telle que définie ci-avant selon lequel une culture de cellules hôtes contenant un ADN recombinant tel que défini ci-avant est mise en contact avec la recombinase permettant d'induire la recombinaison site- spécifique. Plus préférentiellement, la mise en contact est effectuée soit par transfection ou infection avec un plasmide ou un phage contenant le gène de la dite recombinase; soit par induction de l'expression d'un gène codant pour la dite

recombinase, présent dans la cellule hôte. Comme indiqué ci-après, ce gène peut être présent dans la cellule hôte sous une forme intégrée au génome, sur un plasmide réplicatif ou encore sur le plasmide de l'invention, dans la partie non-thérapeutique.

Pour permettre la production des minicercles selon l'invention par recombinaison site-spécifique __ vivo, la recombinase utilisée doit être introduite ou induite dans les cellules ou le milieu de culture au moment déterminé. Pour cela, différentes méthodes peuvent être utilisées. Selon une première méthode, on utilise une cellule hôte contenant le gène de la recombinase sous une forme permettant son expression régulée. Il peut notamment être introduit sous contrôle d'un promoteur ou d'un système de promoteurs inductibles, ou encore dans un système thermosensible. En particulier, le gène peut être présent dans un phage thermosensible, latent pendant la phase de croissance, et induit à température appropriée (exemple phage lysogène lambda Xis" ςj.857). La cassette d'expression du gène de la recombinase peut être portée par un plasmide, un phage, ou même par le plasmide de l'invention, dans la région non-thérapeutique. Elle peut être intégrée au génome de la cellule hôte ou maintenue sous forme réplicative. Selon une autre méthode, la cassette d'expression du gène est portée par un plasmide ou un phage utilisé pour transfecter ou infecter la culture cellulaire après la phase de croissance. Dans ce cas, il n'est pas nécessaire que le gène soit sous une forme permettant son expression régulée. En particulier, tout promoteur constitutif peut être utilisé. La mise en contact avec la recombinase peut également être réalisée in vitro, sur un préparation de plasmide, par incubation directe avec la protéine.

Préférentiellement, on utilise dans le cadre de la présente invention une cellule hôte capable d'exprimer de manière régulée le gène de la recombinase. Ce mode de mise en oeuvre, dans lequel la recombinase est fournie directement par la cellule hôte après induction, est particulièrement avantageux. En effet, il suffit simplement de placer, au moment voulu, les cellules en culture dans les conditions d'expression du gène de la recombinase (température permissive pour gène thermosensible, ajout d'un inducteur pour promoteur régulable, etc) pour induire la recombinaison site-spécifique in vivo et ainsi l'excision du minicercle de l'invention. En outre, cette excision se fait

avec des rendements particulièrement élevés puisque toutes les cellules en culture expriment la recombinase, ce qui n'est pas nécessairement le cas si une transfection ou une infection doivent être réalisées pour transférer le gène de la recombinase.

Selon un premier mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend l'excision des molécules d'ADN thérapeutique par recombinaison site-spécifique à partir d'un plasmide. Ce mode de réalisation met en oeuvre les plasmides décrits ci-avant permettant, dans un premier temps, la réplication chez un hôte choisi puis, dans un second temps, l'excision des parties non- thérapeutiques du dit plasmide (notamment l'origine de réplication et le gène de résistance) par recombinaison site- spécifique, générant les molécules d'ADN circulaires de l'invention. Pour la mise en oeuvre du procédé, différents types de plasmides peuvent être utilisés et en particulier un vecteur, un phage ou un virus. Il s'agit préférentiellement d'un vecteur réplicatif.

Avantageusement, le procédé de l'invention comprend une étape préalable de transformation de cellules hôtes avec un plasmide tel que défini précédemment, puis de culture des cellules transformées, permettant d'obtenir des quantités appropriées de plasmide. L'excision parirecombinaisons site-spécifique est alors réalisée par mise en contact avec la recombinase dans les conditions définies ci-avant (figure 2). Comme indiqué précédemment, dans ce mode de réalisation, la recombinaison site-spécifique peut être réalisée in vivo, (c'est-à-dire dans la cellule hôte) ou in vitro (c'est-à-dire sur une préparation de plasmide).

Selon un mode préféré, les molécules d'ADN de l'invention sont donc obtenues à partir d'un vecteur réplicatif, par excision de la partie non-thérapeutique portant notamment l'origine de réplication et le gène marqueur par recombinaison site- spécifique.

Selon un autre mode de réalisation, le procédé de l'invention comprend l'excision des molécules d'ADN à partir du génome de l'hôte cellulaire par recombinaison site-spécifique. Ce mode de réalisation repose plus particulièrement sur la construction d'hôtes cellulaires comprenant, inséré dans leur génome, une ou plusieurs copies d'une cassette comprenant le gène d'intérêt encadré par les séquences

permettant la recombinaison (figure 1). Différentes techniques peuvent être utilisées pour l'insertion de la cassette de l'invention dans le génome de la cellule hôte. En particulier, l'insertion en plusieurs endroits distincts du génome peut être obtenue en utilisant des vecteurs intégratifs. A cet égard, différents systèmes de transposition tels que notamment le système miniMu ou les transposons défectifs tels que des dérivés de TnlΩ par exemple peuvent être utilisés (Kleckner __ al., Methods Enzymol. 204 (1991) 139; Groisman E., Methods Enzymol. 204 (1991) 180). L'insertion peut également être réalisée par recombinaison homologue, permettant d'intégrer dans le génome de la bactérie une cassette contenant deux séquences de recombinaison en orientation directe encadrant un ou plusieurs gènes d'intérêt. Ce processus peut en outre être reproduit autant de fois que désiré de manière à avoir un nombre de copies le plus important possible par cellule. Une autre technique consiste encore à utiliser un système d'amplification jn vivo utilisant la recombinaison tel que décrit dans Labarre gt âl. (Labarre J., O. Reyes, Guyonvarch, and G. Leblon. 1993. Gène replacement, intégration, and amplification at the gdhA locus of Corynebacterium glutamicum. J. Bacteriol. 175:1001-107) de manière à passer d'une copie de la cassette à un nombre beaucoup plus important.

Une technique préférée consiste dans l'utilisation de miniMu. Des dérivés de miniMu sont construits à cet effet comprenant un marqueur de résistance, les fonctions nécessaires en çjg à leur transposition et une cassette contenant deux séquences de recombinaison en orientation directe encadrant le ou les gènes d'intérêt. Ces miniMu sont avantageusement placées en plusieurs endroits du génome en utilisant un marqueur de résistance (la kanamycine, par exemple) permettant de sélectionner plusieurs copies par génome (Groisman E. précitée). Comme décrit ci-avant, la cellule hôte en question peut aussi exprimer de manière inducttble une recombinase site spécifique conduisant à l'excision du fragment bordé par les séquences de recombinaison en orientation directe. Après excision les minicercles peuvent être purifiés par les techniques classiques.

Ce mode de mise en oeuvre du procédé de l'invention est particulièrement intéressant puisqu'il conduit à la génération d'un seul type de molécule plasmidique : le

minicercle de l'invention. Les cellules ne contiennent en effet aucun autre plasmide episomal comme c'est le cas lors de la production à partir d'un plasmide (figures 1 et 2).

Un autre objet de l'invention réside également dans une cellule hôte modifiée comprenant, inséré dans son génome, une ou plusieurs copies d'un ADN recombinant tel que défini ci-avant.

L'invention concerne également toute cellule recombinante contenant un plasmide tel que défini ci- avant. Ces cellules sont obtenues par toute technique connue de l'homme du métier permettant l'introduction d'un ADN dans une cellule donnée. Il peut s'agir notamment de transformation, électroporation, conjugaison, fusion de protoplastes ou toute autre technique connue de l'homme de l'art. S'agissant de la transformation, différents protocoles ont été décrits dans l'art antérieur. En particulier, la transformation de cellules peut être réalisée en traitant les cellules entières en présence d'acétate de lithium et de polyéthylène glycol selon la technique décrite par Ito et al. (J. Bacteriol. 1___ (1983) 163-168), ou en présence d'éthylène glycol et de diméthylsulfoxyde selon la technique de Durrens et al. (Curr. Genêt. 18 (1990) 7). Un protocole alternatif a également été décrit dans la demande de brevet EP 361 991. S'agissant d'électroporation, elle peut être réalisée selon Becker et Guarentte (in : Methods in Enzymology Vol 194 (1991) 182).

Le procédé selon l'invention peut être réalisé dans tout type d'hôte cellulaire.

En particulier, il peut s'agir de bactéries ou de cellules eucaryotes (levures, cellules animales, cellules végétales) etc. Parmi les bactéries, on peut citer plus préférentiellement E.coli. B. subtilis. Streptomyces. Pseudomonas (P. putida. P. aeruginosa). Rhizobium meliloti. Agrobacterium tumef ariens. Staphylococcus aureus. Streptomyces pristinaespiralis. Enterococcus faecium ou Clostridium. etc. Parmi les bactéries, on préfère utiliser E. coli. Parmi les levures, on peut citer Kluyveromyces.

Saccharomyces. Pichia. Hansenula. etc. Parmi les cellules animales de mammifères, on peut citer les cellules CHO, COS, NIH3T3, etc.

En fonction de l'hôte utilisé, le plasmide selon l'invention est adapté par l'homme du métier pour permettre sa réplication. En particulier, l'origine de réplication et le gène marqueur sont choisis en fonction de la cellule hôte sélectionnée.

Le gène marqueur peut être un gène de résistance, notamment à un antibiotique (ampicilline, kamamycine, généticine, hygromycine, etc), ou tout gène conférant à la cellule une fonction qu'elle ne possède plus (par exemple un gène qui a été délété sur le chromosome ou rendu inactif), le gène sur le plasmide rétablissant cette fonction.

Dans un mode de réalisation particulier, le procédé de l'invention comprend une étape supplémentaire de purification du minicercle.

A cet égard, le minicercle peut être purifié par les techniques classiques de purification d'ADN plasmidique puisqu'il est superenroulé comme de l'ADN plasmidique. Ces techniques comprennent, entre autre, la purification sur gradient de densité en chlorure de césium, en -présence de bromure d'éthidium, ou bien l'utilisation de colonnes d'échange d'anions (Maniatis _Ê Î --!., 1989). En outre si l'on estime que l'ADN plasmidique correspondant aux parties non-thérapeutiques (origine de réplication et marqueur de sélection notamment) est présent en quantité trop importante, il est également possible, après ou avant la purification, d'utiliser une ou plusieurs enzymes de restriction qui digéreront le plasmide et pas le minicercle, ce qui permet de les séparer par des techniques séparant l'ADN superenroulé de l'ADN linéaire, telles que un gradient de densité en chlorure de césium, en présence de bromure d'éthidium (Maniatis gî al., 1989).

En outre, la présente invention décrit également un procédé amélioré pour la purification des minicercles. Ce procédé permet, en une seule étape, d'obtenir des minicercles de très grande pureté avec des rendements importants. Ce procédé amélioré est basé sur l'interaction entre une séquence double-brin présente sur le minicercle et un ligand spécifique. Le ligand peut être de nature diverse et notamment de nature protéique, chimique ou nucléique. Il s'agit préférentiellement d'un ligand de type acide nucléique, et notamment d'un oligonucléotide, éventuellement modifié chimiquement, capable de former par hybridation une triple-hélice avec la séquence

spécifique présente sur la molécule d'ADN de l'invention. Il a en effet été montré que certains oligonucléotides étaient capables de former spécifiquement des triple-hélices avec des séquences d'ADN double-brin (Hélène et a--. Biochim. Biophys. Acta 1049 (1990) 99; voir également FR94 15162 incorporée à la présente par référence).

Dans une variante particulièrement avantageuse, les molécules d'ADN de l'invention contiennent donc en outre une séquence capable d'interagir spécifiquement avec un ligand (figure 3). De manière préférentielle, il s'agit d'une séquence capable de former, par hybridation, une triple-hélice avec un oligonucléotide spécifique. Cette séquence peut être positionnée en tout site de la molécule d'ADN de l'invention, dès lors qu'elle n'affecte pas la fonctionnalité du gène d'intérêt. Cette séquence est également présente dans les constructions génétiques de l'invention (plasmides, cassettes), dans la partie comportant le gène d'intérêt (voir notamment le plasmide pXL2650). Préférentiellement, la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN de l'invention comprend entre 5 et 30 paires de bases.

Les oligonucléotides utilisés pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention peuvent conte ir les bases suivantes :

- thymidine (T), qui est capable de former des triplets avec les doublets AT de l'ADN double-brin (Rajagopal e-î al, Bioche 28 (1989) 7859);

- adénine (A), qui est capable de former des triplets avec les doublets AT de l'ADN double-brin;

- guanine (G), qui est capable de former des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double-brin;

- cytosine protonée (C+), qui est capable de former des triplets avec les doublets G.C de l'ADN double-brin (Rajagopal et al précitée);

Préférentiellement, l'oligonucléotide utilisé comprend une séquence homopyrimidique contenant des cytosines et la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN est une séquence homopurique-homopyrimidique. La présence de

cytosines permet d'avoir une triple hélice stable à pH acide, où les cytosines sont protonées, et déstabilisée à pH alcalin, où les cytosines sont neutralisées.

Pour permettre la formation d'une triple-hélice par hybridation, il est important que l'oligonucléotide et la séquence spécifique présente sur la molécule d'ADN de l'invention soient complémentaires. A cet égard, pour obtenir les meilleurs rendements et la meilleure sélectivité, on utilise dans le procédé de l'invention un oligonucléotide et une séquence spécifique parfaitement complémentaires. Il peut s'agir en particulier d'un oligonucléotide poly-CTT et d'une séquence spécifique poly-GAA. A titre d'exemple, on peut citer l'oligonucléotide de séquence GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT (SEQ ID n° 5), dans lequel les bases GAGG ne forment pas de triple hélice mais permettent d'espacer l'oligonucléotide du bras de couplage.

Il est entendu toutefois que certains mésappariements peuvent être tolérés, dès lors qu'ils ne conduisent pas à une perte trop grande d'affinité. L'oligonucléotide utilisé peut être naturel (composé de bases naturelles, non modifiées) ou modifié chimiquement. En particulier, l'oligonucléotide peut présenter avantageusement certaines modifications' chimiques permettant d'augmenter sa résistance ou sa protection vis à vis des nucléases, ou son affinité vis à vis de la séquence spécifique.

Ainsi, l'oligonucléotide peut être rendu plus résistant aux nucléases par modification du squelette (ex. methylphosphonates, phosphorothiates, phosphotriester, phosphoramidate, etc.). Un autre type de modification a plus particulièrement pour objet d'améliorer l'interaction et/ou l'affinité entre l'oligonucléotide et la séquence spécifique. En particulier, une modification tout à fait avantageuse selon l'invention consiste à méthyler les cytosines de l'oligonucléotide. L'oligonucléotide ainsi méthylé présente la propriété remarquable de former une triple hélice stable avec la séquence spécifique à pH neutre. Il permet donc de travailler à des pH plus élevés que les oligonucléotides de l'art antérieur, c'est-à-dire à des pH où les risques de dégradation de l'ADN plasmidique sont inférieurs.

La longueur de l'oligonucléotide utilisé dans le procédé de l'invention est d'au moins 3 bases, et de préférence, comprise entre 5 et 30. On utilise de manière

avantageuse un oligonucléotide de longueur supérieure à 10 bases. La longueur peut être adaptée au cas par cas par l'homme du métier en fonction de la sélectivité et de la stabilité de l'interaction recherchées.

Les oligonucléotides selon l'invention peuvent être synthétisés par toute technique connue. En particulier, ils peuvent être préparés au moyen de synthétiseurs d'acides nucléiques. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut bien évidemment être utilisée.

Pour la mise en oeuvre du procédé de l'invention, le ligand spécifique (protéine, acide nucléique, etc) peut être greffé ou non sur un support. Différents types de supports peuvent être utilisés à cet effet, tels que notamment des supports de chromatographie fonctionnalisés, en vrac ou préconditionnés en colonne, des surfaces plastiques fonctionnalisées ou de billes de latex fonctionnalisées, magnétiques ou non. Il s'agit préférentiellement de supports de chromatographie. A titre d'exemple, les supports de chromatographie pouvant être utilisés sont l'agarose, l'acrylamide ou le Dextran ainsi que leurs dérivés (tels que Séphadex, Sépharose, Superose,...), les polymères tels que le poly(styrènedivinylbenzène), ou la silice greffée ou non greffée, par exemple. Les colonnes de chromatographie peuvent fonctionner en mode de diffusion ou de perfusion.

Pour permettre son couplage covalent sur le support, le ligand est généralement fonctionnalisé. S'agissant d'un oligonucléotide, il peut être modifié par exemple par un groupement terminal thiol, aminé ou carboxyle, en position 5' ou 3'. En particulier, l'ajout d'un groupe thiol, aminé ou carboxyle permet, par exemple, de coupler l'oligonucléotide sur un support portant des fonctions disulfure, maléimide, aminé, carboxyle, ester, époxyde, bromure de cyanogène ou aldéhyde. Ces couplages se forment par établissement de liaisons disulfure, thioether, ester, amide ou aminé entre l'oligonucléotide et le support. Toute autre méthode connue de l'homme du métier peut être utilisée, telle que des réactifs de couplage bifonctionnels, par exemple.

Par ailleurs, pour améliorer l'activité de l'oligonucléotide couplé, il peut être avantageux d'effectuer le couplage au moyen d'un "bras". L'utilisation d'un bras permet

en effet de fixer l'oligonucléotide à une distance choisie du support permettant d'améliorer ses conditions d'interaction avec la molécule d'ADN de l'invention. Le bras est avantageusement constitué de bases nucléotidiques, n'interférant pas avec l'hybridation. Ainsi, le bras peut comprendre des bases puriques. A titre d'exemple, le bras peut comprendre la séquence GAGG.

Les molécules d'ADN selon l'invention peuvent être utilisées dans toute application de vaccination ou de thérapie génique et cellulaire, pour le transfert d'un gène à un organisme, un tissu ou une cellule donnée. En particulier, elles peuvent être utilisées pour une administration directe vivo, ou pour la modification de cellules j-i vitro ou gx vivo, en vue de leur implantation à un patient. A cet égard, les molécules selon l'invention peuvent être utilisées telles quelles (sous forme d'ADN nu), ou en association avec différents vecteurs chimiques et/ou biochimiques, synthétiques ou naturels. Il peut s'agir notamment de cations (phosphate de calcium, DEAE- dextran,...) qui agissent en formant des précipités avec l'ADN, lesquels peuvent être "phagocytés" par les cellules. Il peut également s'agir de liposomes dans lesquels la molécule d'ADN est incorporée et qui fusionnent avec la membrane plasmique. Les vecteurs synthétiques de transfert de gènes sont généralement des lipides ou polymères cationiques qui complexent l'ADN et forment avec lui une particule portant des charges positives en surface. Ces particules sont capables d ¹ interagir avec les charges négatives de la membrane cellulaire, puis de franchir celle-ci. On peut citer comme exemples de tels vecteurs le DOGS (TransfectamTM) ou le DOTMA (Lipofectin M). Des protéines chimères ont aussi été développées : elles sont constituées d'une partie polycationique qui condense l'ADN, liée à un ligand qui se fixe sur un récepteur embranaire et entraîne le complexe dans les cellules par endocytose. Les molécules d'ADN selon l'invention peuvent également être utilisées pour le transfert de gènes dans des cellules par des techniques physiques de transfection telles que le bombardement, l'électroporation, etc. En outre, préalablement à leur utilisation thérapeutique, les molécules de l'invention peuvent éventuellement être linéarisées par exemple par coupure enzymatique.

A cet égard, un autre objet de la présente invention concerne toute composition pharmaceutique comprenant une molécule d'ADN au moins telle que définie ci-avant. Cette molécule peut être nue ou associée à un vecteur chimique et/ou biochimique de transfection. Les compositions pharmaceutiques selon l'invention peuvent être formulées en vue d'administrations par voie topique, orale, parentérale, intranasale, intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, intraoculaire, transdermique, etc. De préférence, la molécule d'ADN est utilisée sous une forme injectable ou en application. Elle peut être mélangée à tout véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation injectable, notamment pour une injection directe au niveau du site à traiter. Il peut s'agir en particulier de solutions stériles, isotoniques, ou de compositions sèches, notamment lyophilisées, qui, par addition selon le cas d'eau stérilisée ou de sérum physiologique, permettent la constitution de solutés injectables. Il peut s'agir notamment de tampons Tris ou PBS dilués dans du glucose ou du chlorure de sodium. Une injection directe de l'acide nucléique dans la région atteinte du patient est intéressante car elle permet de concentrer l'effet thérapeutique au niveau des tissus affectés. Les doses d'acide nucléique utilisées peuvent être adaptées en fonction de différents paramètres, et notamment en fonction du gène, du vecteur, du mode d'administration utilisé, de la pathologie concernée ou encore de la durée du traitement recherchée.

Les molécules d'ADN de l'invention peuvent comporter un ou plusieurs gènes d'intérêt, c'est-à-dire un ou plusieurs acides nucléiques (ADNc, ADNg, ADN synthétique ou semi-synthétique, etc) dont la transcription et éventuellement la traduction dans la cellule cible génèrent des produits ayant un intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire.

Parmi les gènes d'intérêt thérapeutique, on peut citer plus particulièrement les gènes codant pour des enzymes, les dérivés sanguins, les hormones, les lymphokines : interleukines, interférons, TNF, etc (FR 9203120), les facteurs de croissance, les neurotransmetteurs ou leurs précurseurs ou enzymes de synthèse, les facteurs trophiques : BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5, etc; les apolipoprotéines : ApoAI, ApoAIV, ApoE, etc (FR 93 05125), la dystrophine ou une

minidystrophine (FR 9111947), les gènes suppresseurs de tumeurs : p53, Rb, RaplA, DCC, k-rev, etc (FR 93 04745), les gènes codant pour des facteurs impliqués dans la coagulation : Facteurs VII, VIII, IX, etc, les gènes suicides : Thymidine kinase, cytosine désaminase, etc; ou encore tout ou partie d'une immunoglobuline naturelle ou artificielle (Fab, ScFv, etc), un ARN ligand (WO91/19813) etc. Le gène thérapeutique peut également être un gène ou une séquence antisens, dont l'expression dans la cellule cible permet de contrôler l'expression de gènes ou la transcription d'ARNm cellulaires. De telles séquences peuvent par exemple être transcrites, dans la cellule cible, en ARN complémentaires d'ARNm cellulaires et bloquer ainsi leur traduction en protéine, selon la technique décrite dans le brevet EP 140 308.

Le gène d'intérêt peut aussi être un gène vaccinant, c'est-à-dire un gène codant pour un peptide antigénique, capable de générer chez l'homme ou l'animal une réponse immunitaire, en vue de la réalisation de vaccins. Il peut s'agir notamment de peptides antigéniques spécifiques du virus d'epstein barr, du virus HIV, du virus de l'hépatite B (EP 185 573), du virus de la pseudo-rage, ou encore spécifiques de tumeurs (EP 259 212).

Généralement, dans les plasmides et molécules de l'invention, le gène d'intérêt thérapeutique, vaccinal, agronomique ou vétérinaire contient également une région promotrice de la transcription fonctionnelle dans la cellule ou l'organisme cible (i.e. les mammifères), ainsi qu'une région située en 3', et qui spécifie un signal de fin transcriptionnelle et un site de polyadénylation (cassette d'expression). Concernant la région promotrice, il peut s'agir d'une région promotrice naturellement responsable de l'expression du gène considéré lorsque celle-ci est susceptible de fonctionner dans la cellule ou l'organisme concernés. Il peut également s'agir de régions d'origine différente (responsables de l'expression d'autres protéines, ou même synthétiques). Notamment, il peut s'agir de séquences promotrices de gènes eucaryotes ou viraux. Par exemple, fl peut s'agir de séquences promotrices issues du génome de la cellule cible. Parmi les promoteurs eucaryotes, on peut utiliser tout promoteur ou séquence dérivée stimulant ou réprimant la transcription d'un gène de façon spécifique ou non, inductible ou non, forte ou faible. Il peut s'agir en particulier de promoteurs ubiquitaires (promoteur des

gènes HPRT, PGK, α-actine, tubuline, etc), de promoteurs des filaments intermédiaires (promoteur des gènes GFAP, desmine, vimentine, neurofilaments, kératine, etc), de promoteurs de gènes thérapeutiques (par exemple le promoteur des gènes MDR, CFTR, Facteur VIII, ApoAI, etc), de promoteurs spécifiques de tissus (promoteur du gène pyruvate kinase, villine, protéine intestinale de liaison des acides gras, α-actine du muscle lisse, etc) ou encore de promoteurs répondant à un stimulus (récepteur des hormones stéroïdes, récepteur de l'acide rétinoïque, etc). De même, il peut s'agir de séquences promotrices issues du génome d'un virus, tel que par exemple les promoteurs des gènes El A et MLP d'adénovirus, le promoteur précoce du CMV, ou encore le promoteur du LTR du RSV, etc. En outre, ces régions promotrices peuvent être modifiées par addition de séquences d'activation, de régulation, ou permettant une expression tissu- spécifique ou majoritaire.

Par ailleurs, le gène d'intérêt peut également comporter une séquence signal dirigeant le produit synthétisé dans les voies de sécrétion de la cellule cible. Cette séquence signal peut être la séquence signal naturelle du produit synthétisé, mais il peut également s'agir de toute autre séquence signal fonctionnelle, ou d'une séquence signal artificielle.

Selon le gène d'intérêt, les molécules d'ADN de l'invention peuvent être utilisées pour le traitement ou la prévention de nombreuses pathologies, incluant les maladies génétiques (dystrophie, fibrose cystique, etc), les maladies neurodégénératives (alzhei er, parkinson, ALS, etc), les cancers, les pathologies liées aux désordres de la coagulation ou aux dyslipoprotéinémies, les pathologies liées aux infections virales (hépatites, SIDA, etc), ou dans les domaines agronomique et vétérinaire, etc.

La présente invention sera plus complètement décrite à l'aide des exemples qui suivent, qui doivent être considérés comme illustratifs et non limitatifs.

Légende des Figures

Figure 1 : Production d'un minicercle à partir d'une cassette intégrée dans le génome.

Figure 2 : Production d'un minicercle à partir d'un plasmide.

Figure 3 : Production d'un minicercle contenant une séquence spécifique d'un ligand.

Figure 4 : Construction de pXL2649. Ori : Origine de réplication; Kan ^r : Gène marqueur conférant la résistance à la kanamycine; Amr : Gène marqueur conférant la résistance à rampicilline; galK : Gène de la galactosidase de __, Cpli: Plac : Promoteur de l'opéron lactose.

Figure 5 : Activité luciférase obtenue après transfection de fibroblastes murins

NIH3T3 par le plasmide pXL2650, le minicercle généré à partir du plasmide pXL2650 et le PGL2-Control (Promega Piotech). La transfection a été réalisée dans les conditions suivantes: 0,5 mg d'ADN par puits, 50000 cellules par puits. Le lipofectant utilisé est le RPR 115335. Le résultat est rapporté en RLU par microgramme de protéines en fonction du rapport de charge lipofectant/ ADN.

Figure 6: Construction du plasmide pXL2793. Ce plasmide génère après recombinaison un minicercle comportant une séquence synthétique homopurique- homopyrimidique et la casette luciférase du pXL2727.

Figure 7 : Le puits 1 correspond à la digestion de la fraction éluée après purification par colonne triple hélice par Sali. Le puits 2 correspond à la digestion de la fraction éluée après purification par colonne triple hélice par Xmnl. Le puits 3 correspond à la fraction éluée après purification par colonne triple hélice, non digérée. Le puits 4 correspond au plasmide pXL2793 non induit, non digéré. Les puits 5 et 6 correspondent respectivement au marqueur de taille d'ADN linéaire et d'ADN superenroulé.

Figure 8. Description schématique de la construction du plasmide pXL2776.

Figure 9. Description schématique des constructions des plasmides pXL2777 et pXL2960.

Figure 10. Action de l'intégrase du bactériophage 1 chez E. coli sur les plasmides ρXL2777 et ρXL2960. M : marqueur de poids moléculaire 1 kb d'ADN linéaire, ou d'ADN surenroulé. N.I. : non induit. I : induit. N.D. : non digéré.

Figure 11. Cinétique de recombinaison de l'intégrase du bactériophage 1 chez E. c-oli sur les plasmides pXL2777 et pXL2960. 2': 2 minutes. O/N: 14 heures. M : marqueur de poids moléculaire 1 kb d'ADN linéaire, ou d'ADN surenroulé. N.I. : non induit. I : induit. N.D. : non digéré.

Techniques générales de clonage et de biologie moléculaire

Les méthodes classiques de biologie moléculaire telles que la centrifugation d'ADN plasmidique en gradient de chlorure de césium-bromure d'éthidium, les digestions par des enzymes de restriction, l'électrophorèse sur gel, l'électroélution des fragments d'ADN à partir de gels d'agarose, la transformation dans E. _ς_[, la précipitation des acides nucléiques etc, sont décrites dans la littérature (Maniatis gî al-, 1989, Ausubel gî al., 1987). Les séquences nucléotidiques ont été déterminées par la méthode de terminaison de chaînes en suivant le protocole déjà présenté (Ausubel gt al., 1987).

Les enzymes de restriction ont été fournies par New-England Biolabs (Biolabs), Bethesda Research Laboratories (BRL) ou Amersham Ltd (Amersham).

Pour les ligatures, les fragments d'ADN sont séparés selon leur taille sur des gels d'agarose à 0,7 % ou d'acrylamide à 8 %, purifiés par électrophorèse puis électroélution, extraits au phénol, précipités à l'éthanol puis incubés dans un tampon Tris-HCl pH 7.4 50 mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, en présence d'ADN ligase du phage T4 (Biolabs). Les oligonucléotides sont synthétisés en utilisant la chimie des phosphoramidites protégés en b par un groupement cyanoéthyl (Sinha gt al-, 1984, Giles 1985) avec le synthétiseur automatique d'ADN Biosearch 8600 en utilisant les recommandations du fabricant.

Les ADN ligaturés sont utilisés pour transformer la souche rendue compétentet: E- SQli MC1060 T(lacIOPZYA)X74. galU. galK. strAr. hsdRl (Casadaban î al-, 1983) ; HB101 fhsdS20. supE44. recA13. ara-14. proA2. lacYl. galK2. rρsL20. xyl-5. mtl-1. λ", F-] (Maniatis gt al-, 1989) et DH5α [endAl hsdR17 supE44 îhi-I recAl gyrA96 relAl λ" Φ80 dlacZΔM15l pour les plasmides.

Les milieux de culture LB et 2XTY sont utilisés pour la partie bactériologique (Maniatis gt -, 1989).

Les ADN plasmidiques sont purifiés suivant la technique de lyse alcaline (Maniatis gt aL 1989).

Définition des termes employés et abréviations.

ADN recombinant : ensemble de techniques qui permettent soit d'associer au sein du même microorganisme de» séquences d'ADN qui ne le sont pas naturellement, soit de mutagéniser spécifiquement un fragment d'ADN.

ATP : adénosine 5'-triphosphate BSA : sérum albumine bovine

PBS : tampon phosphate 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4 dNTP : 2'-désoxyribonucléosides 5'-triphosphates

DTT : dithiothréitol kb : kilobases pb : paires de bases

Exemple 1 : Construction d'un plasmide portant les séquences attP et attB. du bactériophage , en orientations directes répétées .

Le plasmide pNHlόa a servi de matériel de départ dans la mesure ou il contient déjà un fragment de bactériophage λ portant la séquence attP (Hasan et Szybalski, 1987). Ce plasmide a été digéré par EcoRI. Des oligonucléotides qui contiennent la séquence attB (Landy, 1989) ont été synthétisés. Ils ont la séquence suivante

Oligonucléotide 5476 (SEQ ID n°l)

5'-AATTGTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGG-3' Oligonucléotide 5477 (SEQ ID n°2) 5'-AATTCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAC-3'

Ils ont été hybrides pour reconstituer la séquence attB puis ligaturés au site EeQ I du fragment Eee I de 4.2 kb du pNHlόa (Hasan et Szybalski, 1987). Après transformation de DH5α, un clone recombinant a été conservé. Le plasmide ainsi construit a été nommé pXL2648 (voir Figure 4). Ce plasmide contient les séquences attP et attB du bactériophage en orientation directe. Sous l'action de l'intégrase du bactériophage (protéine Int) il doit y avoir excision des séquences comprises entre les deux sites aîî. Ceci conduit à séparer ce qui est inséré entre les deux séquences âîî. de l'origine de réplication et du marqueur de résistance du plasmide, positionnés à l'extérieur.

Exemple 2 : Obtention in-vivo chez E. coli d'un minicercle.

Une cassette de résistance à la kanamycine a été clonée au site EcoRI du plasmide pXL2648 (Figure 4). Cette cassette provient du plasmide pUC4KIXX (Pharmacia Biotech.). Pour ce faire, 10 g du plasmide pUC4KIXX ont été digérés par EgoRI, puis séparés par électrophorèse sur gel d'agarose; le fragment de 1.6 kb contenant le marqueur de résistance à la kanamycine a été purifié par électroélution; il a ensuite été ligaturé au plasmide pXL2648 linéarisé par EcoRI. Les clones recombinants ont été sélectionnés après transformation dans E. ç__i DH5α et sélection pour la résistance à la kanamycine. Le profil de restriction attendu a été observé sur un clone; ce clone plasmidique a été nommé pXL2649 (Figure 4). Ce plasmide a été introduit par transformation dans deux souches d'E. c-oli :

D1210 .hsdS20. SUPE44. recA13. ara-14. proA2. lacYl. galK2. rτjsL20. xyl-5. mtl-1. λ', F-, laclαl (Sadler gj al., 1980)

D1210HP, qui correspond à DH1210 lysogénisée par le phage xis" (Xis ^" Kil") gI857 (Podjaska gî al., 1985).

Les transformants ont été sélectionnés à 30°C sur milieu 2XTY avec de la kanamycine (50 mg 1). Après réisolement sur milieu sélectif, les souches ont été inoculées dans 5 ml de milieu L supplémenté avec de la kanamycine (50 mg/1). Après 16 hr d'incubation à 30°C avec agitation (5 cm d'amplitude rotative) les cultures ont été diluées au l/100ème dans 100 ml du même milieu. Ces cultures ont été incubées dans les mêmes conditions jusqu'à atteindre une DO610 de 0.3. A ce moment, la moitié de la culture a été prélevée puis incubée 10 mn à 42°C pour induire le cycle lytique du phage , donc l'expression de l'intégrase. Après cette incubation les cultures ont été à nouveau transférées à 30°C puis incubées 1 hr dans ces conditions. Ensuite, les cultures ont été arrêtées et des minipréparations d'ADN plasmidiques ont été réalisées. Quelles que soient les conditions, dans la souche D1210, le profil d'électrophorèse en gel d'agarose de l'ADN plasmidique non digéré du plasmide pXL2649 est inchangé ainsi que dans la souche D1210HP n'ayant pas été induite thermiquement. Au contraire dans D1210HP ayant été incubée 10 mn à 42 °C puis cultivée 1 heure à 30°C, on constate qu'il n'y a non plus un plasmide, mais deux molécules circulaires d'ADN : une de bas poids moléculaire, migrant le plus rapidement et contenant un site EcoRI: et une de plus haut poids moléculaire, contenant un site unique Bgll, comme attendu. Il y a donc bien eu excision des séquences présentes entre les deux séquences aîî, et génération d'un minicercle dénué de toute origine de réplication. Cet ADN, circulaire, superenroulé, ne portant pas d'origine de réplication est désigné minicercle. Cette appelation rend en effet mieux compte du caractère circulaire de la molécule. Le plasmide pXL2649 de départ est présent, mais il représente environ 10 % du plasmide ayant excisé les séquences bordées par atî.

Le minicercle peut ensuite être purifié par les techniques classiques de purification d'ADN plasmidique puisqu'il est superenroulé comme de l'ADN plasmidique. Ces techniques comprennent, entre autre, la purification sur gradient de densité en chlorure de césium, en présence de bromure d'éthidium, ou bien l'utilisation de colonnes d'échange d'anions (Maniatis et al., 1989). En outre si l'on estime que l'ADN plasmidique correspondant à l'origine de réplication et au marqueur de sélection est présent en quantité trop importante, il est toujours possible après purification d'utiliser une ou plusieurs enzymes de restriction qui digéreront le plasmide et pas le

minicercle, ce qui permet de les séparer par des techniques séparant l'ADN superenroulé de l'ADN linéaire, telles qu'en gradient de densité en chlorure de césium, en présence de bromure d'éthidium (Maniatis gt al-, 1989).

Exemple 3 : Obtention d'un minicercle contenant une cassette d'expression de la luciférase.

Afin de tester l'utilisation jn vivo de ces minicercles, un gène reporter avec les séquences nécessaires à son expression a été clone dans le plasmide pXL2649 (cf exemple 2). Il s'agit plus particulièrement d'une cassette BglII-BamHI de 3150 pb issue de pGL2-Control (Promega Biotech.). Cette cassette contient le promoteur précoce de SV40, l'enhanceur du promoteur précoce de SV40, le gène de la luciférase de Photinus pyralis et un site de polyadénylation dérivé de SV40. Le fragment B-glII- BamHI de 3150 bp a été clone au site B-amHI de pXL2649 digéré par B-amHI de manière à remplacer la cassette de résistance à la kanamycine par la cassette d'expression de la luciférase de pGL2-control. Le plasmide ainsi construit a été appelé pXL2650. Dans ce plasmide les sites attP et β tB bordent la cassette d'expression de la luciférase. La recombinaison site spécifique permet d'exciser uniquement les séquences nécessaires à l'expression de la luciférase ainsi que le gène de la luciférase. Celle-ci peut être réalisée exactement comme décrit à l'exemple 2. Un minicercle tel que le plasmide pXL2650 peut être ensuite utilisé dans des expériences de transfection __ vivo ou __ vitro.

Une culture de 1 litre de la souche D1210HP pXL2650, en milieu 2XTY supplémenté avec de l'ampicilline (50 mg/ml) a été réalisée à 30°C. A une DO610 égale à 0.3, la culture a été transférée à 42°C pendant 20 mn, puis remise 20 mn à 30°C. L'ADN épisomal a été préparé par la technique du lysat clair (Maniatis et al., 1989) suivie d'un gradient de densité en chlorure de césium supplémenté avec du bromure d'éthidium (Maniatis gî al-, 1989), puis d'une extraction du bromure d'éthidium à l'isopropanol et d'une dialyse. Cet ADN a montré contenir le minicercle. 100 g de cette préparation ont été digérés par Psîl, puis l'hydrolysat a été soumis à un gradient de densité en chlorure de césium supplémenté avec du bromure d'éthidium (Maniatis gt

al-, 1989). Un résultat identique est obtenu lorsque la préparation est digérée conjointement par AlwNI et XmnI. La forme superenroulée a été récupérée et après élimination du bromure d'éthidium (Maniatis gî al-), elle s'est avérée ne correspondre qu'au minicercle, dépourvu d'origine de réplication et de tout gène marqueur. Cette préparation de minicercle peut être utilisée pour des expériences de transfection __ vitro et in vivo.

Exemple 4 : Transfection vitro de cellules de mammifères et plus particulièrement de cellules humaines par un minicercle.

L'ADN minicercle contenant le gène de la luciférase de Photinus pyraϋs tel que décrit à l'exemple 3, c'est à dire correspondant au minicercle généré à partir du plasmide pXL2650, est dilué dans du NaCl 150 mM et mélangé avec un transfectant. On peut utiliser divers transfectants commerciaux tels que le dioctadécylamido- glycylspermine (DOGS, TransfectamTM. Promega), la LipofectinTM (Gibco-BRL), etc, dans différents rapports de charges positives/négatives. A titre iUustratif, l'agent transfectant a été utilisé dans des rapports de charges supérieurs ou égaux à 3. Le mélange est vortexé, laiisé 10 minutes à température ambiante, dilué dans du milieu de culture dépourvu de sérum de veau foetal, puis ajouté aux cellules, à raison de 2 μg d'ADN par puits de culture. Les cellules utilisées sont des Caco-2, dérivées d'un adénocarcinome du côlon humain, cultivées selon un protocole décrit (Wils î al., 1994) et ensemencées la veille de l'expérience dans des plaques de culture à 48 puits, à raison de 50.000 cellules/puits. Après deux heures à 37°C, on ajoute 10% v/v de sérum de veau foetal et les cellules sont incubées 24 heures à 37°C en présence de 5% de CO2- Les cellules sont lavées deux fois au PBS et l'activité luciférase est mesurée selon le protocole décrit (tel que le kit Proméga). On peut utiliser d'autres lignées (fibroblastes, lymphocytes,...) provenant de différentes espèces, ou bien des cellules prélevées chez un individu (fibroblastes, kératinocytes, lymphocytes,...) et qui lui seront réinjectées après transfection.

Exemple 5 : Transfection in vitro de cellules NIH 3T3

L'ADN minicercle contenant le gène de la luciférase de Photinus pyralis. tel que décrit à l'exemple 3, c'est à dire correspondant au minicercle généré à partir du plasmide ρXL2650 a été transfecté jn vitro dans des cellules de mammifères; le pXL2650 et le PGL2-Control (Promega Biotech.) qui comportent la même casette d'expression ont été utilisés comme contrôle. Les cellules utilisées sont des fibroblastes murins NIH 3T3, ensemencées la veille de l'expérience dans des plaques de culture à 24 puits, à raison de 50.000 cellules par puits. Le plasmide est dilué dans du NaCl 150 mM et mélangé avec le lipofectant RPR115335. Cependant on peut utiliser divers autres agents commerciaux tels que le dioctadécylamidoglycyl spermine (DOGS, Transfectam™' Promega) (Demeneix et al. Int. J. Dev. Biol. 35 (1991) 481), la

Lipofectin™ (Gibco-BRL) (Fegner et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 7413), etc. On utilise un rapport de charges positives du lipofectant charges négatives de l'ADN égal ou supérieur à 3. Le mélange est vortexé, laissé dix minutes à température ambiante, dilué dans du milieu dépourvu de sérum de veau foetal, puis ajouté aux cellules, à raison de 0,5 mg d'ADN par puits de culture. Après deux heures à 37°C, on ajoute 10 % volume à volume de sérum de veau foetal et les cellules sont incubées 48 heures à 37 ^0, C en présence de 5 % de CO2- Les cellules sont lavées deux fois avec du PBS et l'activité luciférase est mesurée selon le protocole décrit (kit Promega, Promega Corp. Madison, WI), sur un luminomètre Lumat LB9501 (EG et G Berthold, Evry). Les résultats de transfection correspondant aux conditions qui viennent d'être énoncées sont présentés figure 5. Ils montrent sans ambiguïté que le minicercle présente les mêmes propriétés de transfection que des plasmides possédant une origine de réplication. Ainsi ces minicereles pourraient être utiliser indifféremment de plasmides standards dans des applications de thérapie génique.

Exemple 6 : Purification d'un minicercle par affinité en utilisant une interaction hélice-triple.

Cet exemple décrit une méthode de purification d'un minicercle selon l'invention à partir d'un mélange comportant la forme plasmidique l'ayant excisé, par des interactions de type triple hélice qui vont se faire avec une séquence d'ADN synthétique portée par le minicercle à purifier. Cet exemple démontre comment la

technologie de purification par formation d'une triple hélice peut être utilisée pour séparer un minicercle d'une forme plasmidique l'ayant excisé.

6-1. Obtention d'un minicercle comportant une séquence synthétique homopurique-homopyrimidique.

6-1.1. Insertion d'une séquence homopurique- homopyrimidique dans le plasmide pXL2650

Le plasmide pXL2650 possède un site unique BamHI juste après la cassette contenant le gène de la luciférase de Photinus pyralis. Ce site unique a été utilisé pour cloner les deux oligonucléotides suivants : 4957 (SEQ ID n°3)

5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGA AGAAGAAGAAGAAC-3'

4958 (SEQ ID n°4)

5'-GATCGTTCT CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTC TTCTTCTTCG-3'

Ces oligonucléotides, une fois hybrides et clones sur le plasmide pXL2650 apportent une séquence homopurique-homopyrimidique (GAA)i7, comme décrit ci-dessus.

Pour réaliser ce clonage les olignonucléotides ont tout d'abord été hybrides de la manière suivante. Un g de chacun de ces deux oligonucléotides ont été mis ensemble dans 40 ml d'un tampon final 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgCl2- Ce mélange a été chauffé à 95°C, puis il a été placé à la température ambiante de manière que la température s'abaisse lentement. Dix ng du mélange d'oligonucléotides hybrides ont été ligaturé avec 200 ng du plasmide pXL2650 linéarisé par BamHI. 30 ml final. Après ligature une aliquote a été transformée dans DH5. Les mélanges de transformation ont été étalés sur milieu L supplémenté avec de l'ampicilline (50 mgΛ). Vingt quatre clones ont été digérés par PflMI et BamHI. Un clone a été trouvé qui avait la taille du

fragment PflMI-BamHI de 950 pb augmenté de 50 pb. Ce clone a été retenu et nommé pXL2651.

Le plasmide pXL2651 a été purifié selon le kit Wizard Megaprep (Promega Corp., Madison, WI) en suivant les recommandations du fournisseur.

6-1.2. Insertion d'une séquence homopurique- homopyrimidique dans le plasmide ρXL2649

a) Insertion de nouveaux sites de restriction de part et d'autre de la cassette kanamycine du pXL2649.

Le plasmide pXL2649, tel qu'il a été décrit exemple 2, a été digéré par EςβRI de manière à ressortir la cassette kanamycine provenant du plasmide pUC4KIXX

(PharmaciaBiotech, Uppsala, Suéde). Pour ce faire 5 mg du plasmide pXL2649 ont été digérés par EcoRI. Le fragment de 4,2 kb a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose et purifié par électroélution.

D'autre part le plasmide pXL1571 a été utilisé. Celui-ci a été construit à partir du plasmide pFRIO (Gène 25 (1983), 71-88), dans lequel le fragment de 1,6 kb provenant du pUC4 IXX, correspondant au gène de la kanamycine, a été inséré en

Sstl. Ce clonage a permis d'insérer de part et d'autre du gène de la kanamycine 12 nouveaux sites de restriction.

Cinq micro grammes de pXL1571 ont été dialyses par EOQRI. Le fragment de 1,6 kb correspondant au gène de la kanamycine a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose et purifié par électroélution. Il a été ensuite ligaturé avec le fragment EÇQRI de 4,2 kb du pXL2649. Les clones recombinants ont été sélectionnés après transformation dans E.eQli DH5a et sélection pour la résistance à la kanamycine et à l'ampicilline. Le profil de restriction attendu a été observé sur un clone; ce clone plasmidique a été nommé pXL2791.

b) Extraction de la cassette kanamycine du plasmide pXL2791

Le plasmide pXL2791 a été digéré par SstI de manière à ressortir la cassette kanamycine. Le fragment de 4,2 kb a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose et purifié par le kit de gel extraction Jetsorb (Genomed). Il a ensuite été ligaturé. Les clones recombinants ont été sélectionnés pour la résistance à l'ampicilline après transformation dans E- COU DH5a. Le profil de restriction attendu a été observé sur un clone. Ce clone plasmidique a été nommé pXL2792. Ce clone comprend, entre autre, des sites de restriction Sali et X al entre les sites attP et attB.

c) Clonage d'une séquence homopurique-homopyrimidique ainsi que d'une cassette permettant l'expression de la luciférase entre les deux sites attP et attB du plasmide ρXL2792

Le plasmide pXL2727 a été utilisé. Ce plasmide, digéré par Xmal et Sali. permet de ressortir un fragment comprenant : le promoteur pCMV, le gène de la luciférase de photinus pyralis. un site de polyadénylation dérivé de SV40 et une séquence homopurique-homopyrimidique. Cette dernière a été obtenue après hybridation et clonage des deux oligonucléotides suivants :

6006 : (SEQ ID N.16)

5' -GATCTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG AGAAGAACTGCAGATCT-3'

6008: (SEQIDN.17)

5' -GATCAGATCTGCAGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT CTTCTTCTTCTTCTTCA-3'

La séquence homopurique-homopyrimidique présente sur le pXL2727 a été séquencée par la méthode Sequenase Version 2.0 (United States Biochemical Corporation). Le résultat obtenu montre que la séquence homopurique- homopyrimidique réellement présente sur le plasmide pXL2727 comporte 10 répétitions (GAA-CTT) et non 17 comme le laissait prévoir la séquence des oligonucléotides 6006 et 6008. La séquence réellement présente sur le plasmide

pXL2727, lue après séquençage sur le brin correspondant à l'oligonucléotide 6008, est la suivante :

5 ' -

GATCAGATCTGCAGTCTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCTT CTTCA-3 ' (SEQ ID N. 1 8 )

Un micro gramme de pXL2727 a été digéré par Xmal et Sali. Le fragment de 3,7 kb a été séparé par électrophorèse sur gel d'agarose et purifié par le kit de gel extraction Jetsorb (Genomed). D'autre part 1,7 mg de pXL2792 a été digéré par Xmal et Sali- Le fragment de 4,2 kb a été séparé sur gel d'agarose, purifié par le kit de gel extraction Jetsorb (genomed), et ligaturé avec le fragment Xmal-Sall de 3,7 kb du pXL2727. Les clones recombinants ont été sélectionnés après transformation dans E. coli DH5a et sélection pour la résistance à l'ampirilline. Le profil de restriction attendu a été observé sur un clone; ce clone a été nommé pXL2793. Le plasmide pXL2793 a été purifié en utilisant un gradient de densité en chlorure de césium selon une méthode déjà décrite (Maniatis et al..1989).

6-2. Préparation de la colonne permettant de faire des interactions de type triple hélice avec une séquence homopurine-homopyrimidine présente sur le minicercle.

La colonne a été préparée de la manière suivante :

La colonne utilisée est une colonne HiTrap activée au NHS

(N-hydroxysuccinimide, Pharmacia) de 1 ml, connectée sur une pompe péristaltique (débit< 1 ml/min). L'oligonucléotide spécifique utilisé possède un groupement NH2 en 5'.

Pour le plasmide pXL2651, sa séquence est la suivante :

5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID n°5)

Pour le plasmide pXL2793, sa séquence est la suivante (oligo 116418) :

5'-CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' (SEQ ID N.19)

Les tampons utilises sont les suivants :

Tampon de couplage : NaHCθ3 0,2 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3

Tampon de lavage : Tampon A : éthanolamine 0,5 M, NaCl 0,5 M, pH 8,3

Tampon B : acétate 0,1 M, NaCl 0,5 M pH 4 Tampon de fixation et d'élution : Tampon F : NaCl 2 M, acétate 0,2 M pH 4,5 Tampon E : Tris 1 M, HCl pH 9, EDTA 0,5 mM La colonne est préparée de la manière suivante :

La colonne est lavée par 6 ml de HCl 1 mM, puis l'oligonucléotide dilué dans le tampon de couplage (50 nmoles dans 1 ml) est appliquée sur la colonne et laissé 30 minutes à température ambiante. La colonne est lavée par 3 ml de tampon de couplage, puis par 6 ml de tampon A, suivi de 6 ml de tampon B. Ces deux derniers tampons sont appliqués successivement trois fois sur la colonne, l'oligonucléotide est ainsi lié covalemment à la colonne par une liaison CONH. La colonne est stockée à 4°C dans du PBS 0,1 % NaN3-

6-3. Purification d'un minicercle comportant une séquence synthétique homopurique-homopyrimidique, par une interaction de type triple-hélice.

6-3.1. Purification du plasmide pXL2651

Le plasmide pXL2651 a été introduit dans la souche D1210HP. Cette souche recombinante [D1210HP (pXL2651)] a été cultivée comme cela est décrit à l'exemple 3, de manière à générer le minicercle contenant le gène de la luciférase de Photinus pyralis. Vingt ml de culture ont été prélevés et centrifugés. Le culot cellulaire est repris dans 1,5 ml de glucose 50 mM, Tris 25 mM HCl pH 8, EDTA 10 mM. La lyse est faite par 2 ml de NaOH 0,2 M, SDS 1 %, et la neutralisation par 1,5 ml d'acétate de

potassium 3 M, pH 5. L'ADN est ensuite précipité par 3 ml de propranol-2, le culot est repris dans 0,5 ml d'acétate de sodium 0,2 M pH 5, NaCl 0,1M et chargé sur une colonne d' oligonucléotides capable de former des interactions de type triple hélice avec des séquences poly GAA contenues dans le minicercle, comme décrit précédemment. La colonne ayant été préalablement lavée avec 6 ml de tampon F, la solution contenant le minicercle à purifier après avoir été appliquée sur la colonne est incubée deux heures à température ambiante. La colonne est lavée par 10 ml de tampon F puis l'élution se fait par du tampon E.

On obtient ainsi de l'ADN purifié correspondant au minicercle. Le minicercle obtenu, analysé par électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium, se présente sous la forme d'une seule bande d'ADN circulaire super enroulée. Il subsiste dans la préparation moins de 5 % de plasmide pXL2651 de départ.

6-3.2. Purification du plasmide pXL2793

Le plasmide ρXL2793 de 7,9 kb a été introduit dans la souche D1210HP. Cette souche recombinante a été cultivée comme cela est décrit à l'exemple 3, de manière à générer le minicercle de 4 kb contenant le gène de la luciférase de Photinus pyralis et un plasmide de 3,9 kb. Deux cent ml de culture ont été prélevés et centrifugés. Le culot cellulaire a été traité par le Kit Wizard Megaprep (Promega Corp.,Madison,WI) en suivant les recommandations du fournisseur. L'ADN a été repris dans un volume final de 2 ml de Tris ImM, EDTA 1 mM, pH 8. Deux cent cinquante micro litres de cet échantillon plasmidique ont été dilués avec du tampon F dans un volume final de 2,5 ml. La colonne a été préalablement lavée avec 6 ml de tampon F. La totalité de l'échantillon dilué a été chargé sur une colonne d'oligonucléotide capable de former des interactions de type triple hélice avec des séquences poly GAA contenues dans le minicercle, préparée comme décrit précédemment. Après lavage par 10 ml de tampon F, l'élution se fait par du tampon E. L'échantillon élue est récupéré par fraction de 1 ml.

Par cette méthode on obtient de l'ADN purifié correspondant au minicercle généré à partir de pXL2793. L'échantillon d'ADN élue de la colonne a été analysé par

électrophorèse sur gel d'agarose et coloration au bromure d'éthidium et par restriction enzymatique. Pour ce faire les fractions éluées se révélant contenir de l'ADN par dosage à DO260 n™ ont été dialysées 24 heures contre du Tris ImM, EDTA ImM, puis précipitées à l'isopropanol et repris dans 200 ml d'H2θ. Quinze micro litres de l'échantillon ainsi obtenu ont été digérés par Sali, ce site de restriction étant présent sur le minicercle et pas sur le plasmide de 3,9 kb généré par la recombinaison, ou par Xmnl. ce site de restriction étant présent sur le plasmide de 3,9 kb généré par la recombinaison et pas sur le minicercle. Le résultat obtenu est présenté sur la figure 7, montrant que le minicercle a été purifié du plasmide recombinant.

Exemple 7 : Transfection in vivo de cellules de mammifères par un minicercle.

Cet exemple décrit le transfert d'un minicercle codant pour le gène de la luciférase dans le cerveau de souris, nouveau-nées. Le minicercle (30 μg) est dilué dans du NaCl 150 mM stérile, à une concentration de 1 μg/μl. On rajoute ensuite un transfectant synthétique, tel que le dioctadécylamidoglycylspermine (DOGS), dans un rapport de charges positives/négatives inférieur ou égal à 2. Le mélange est vortexé et 2 μg d'ADN sont injectés dans le cortex cérébral de souris nouveau-nées anesthésiées, à l'aide d'un micromanipulateur et d'une microseringue. Les cerveaux sont prélevés 48 heures plus tard, homogénéisés, centrifugés et le surnageant est utilisé pour le dosage de la luciférase par les protocoles décrits (tels le kit Promega).

Exemple 8 : Utilisation du locus gar de RK2 pour diminuer la présence de topo-isomères de minicercle ou de miniplasmide

Cet exemple met en évidence la présence de formes topologiques dérivées i) du plasmide possédant les séquences attP et attB en orientation directe, ii) du minicercle ou iii) du miniplasmide, après action de l'intégrase du bactériophage 1 chez E- ÇQ-i- Cet exemple montre aussi que ces formes topologiques ou oligomériques peuvent être résolues par l'utilisation du locus par de RK2 (Gerlitz et coll. 1990 J. Bacteriol. 172p6194). En effet, ce locus contient en particulier le gène parA codant pour une

résolvase agissant au site mrs (système de résolution de multimeres) (Eberl et coll. 1994 Mol. Microbiol.12 p.131).

8-1. -Construction des plasmides pXL2777 et pXL2960

Les plasmides pXL2777 et pXL2960 sont dérivés du vecteur pXL2776 et possèdent en commun le réplicon minimal de ColEl, le gène du transposon Tn5 codant pour la résistance à la kanamycine et les séquences attP et attB du bactériophage 1 en orientation directe. Ces plasmides sont différents au niveau des gènes insérés entre les séquences attP et attB en particulier le pXL2777 contient la cassette omegon (codant pour le gène de résistance à la spectinomycine) alors que le plasmide pXL2960 porte le locus par de RK2.

8-1.1. Vecteur minimal pXL2658

Le vecteur pXL2658 (2,513 kb) possède le réplicon minimal de ColEl issu de pBluescript (ori) et le gène du transposon Tn5 codant pour la résistance à la kanamycine (Km) pour marqueur de sélection. Après avoir rendu l'extrémité Bsal franche par action de la Klenow, le fragment Bsal-Pvyll de 1,15 kb de pBKS+ (provenant de Stratagene) a été clone avec le fragment Smal de 1,2 kb du pUC4KIXX (provenant de Pharmacia) pour générer le plasmide pXL2647. Les oligonucléotides 5542 5'(AGC TTC TCG AGC TGC AGG ATA TCG AAT TCG G AT CCT CTA GAG CGG CCG CGA GCT CC)3' (SEQ ID N.20) et 5543 5'(AGC TGG AGC TCG CGG CCG CTC TAG AGG ATC CGA ATT CGA TAT CCT GCA GCT CGA GA)3 ^* (SEQ ID N.21) ont été hybrides entre eux puis clones au site HjndIII du pXL2647 ainsi est construit le pXL2658. Sur ce plasmide, le multisite est SstI, Notl. Xbal. BamHI, EcoRI. EcoRV. Pstl. Xhol. et HjndIII entre l'origine de réplication et le gène codant pour la résistance à la kanamycine.

8-1.2. Vecteur ρXL2776 contenant les séquences attP et attB du phage 1

Le vecteur pXL2776 (2,93 kb) possède le réplicon minimal de ColEl issu de pBluescript, le gène codant pour la résistance à la kanamycine et les séquences attP et attB du bactériophage 1 en orientation directe, voir figure 8. La séquence attB de 29

pb (Mizuuchi et coll. 1980 Proc. Natl. Acad. Sri. USA 77 p3220) a été introduite entre les sites de restriction Sâ£l et HindlII du pXL2658 après avoir hybride l'oligonucléotide sens 6194 5'(ACT AGT GGC CAT GCA TCC GCT CAA GTT AGT ATA AAA AAG CAG GCT TCA G)3' (SEQ ID N.22) avec l'oligonucléotide antisens 6195 5' (AGC TCT GAA GCC TGC TTT TTT ATA CTA ACT TGA GCG GAT GCA TGG CCA CTA GTA GCT13' (SEQ ID N.23) de telle sorte que les sites Sacl et HindlII ne soient plus reconstitués après clonage. Ce plasmide, dont la séquence a été vérifiée en attB. est alors digéré par Spgl et Nsil pour y introduire la séquence attP encadrée par les sites de restriction Nsil et Xbal et générer alors le plasmide pXL2776. La séquence attP a été obtenue par amplification PCR en utilisant le plasmide pXL2649 (décrit dans l'exemple 2) comme matrice, les oligonucléotides 6190 sens 5' (GCG TCT AGA ACA GTA TCG TGA TGA CAG AG)3 ^* (SEQ ID N.24) et 6191 antisens 5' (GCC AAG CTT AGC TTT GCA CTG GAT TGC GA)3' (SEQ ID N.25) et en effectuant 30 cycles au cours desquels la température d'hybridation est de 50 ^β C . Le produit PCR digéré par les sites Xbal et HindlII a été clone dans le phage M13mpEH entre les sites Xbal et HindlII. La séquence amplifiée est identique à la séquence de attP décrite dans Lambda II (édité par R.W. Hendrix, J.W. Roberts, F.W. Stahl, R.A. Weisberg; Cold Spring Harbor Laboratory 1983) entre les positions 27480 et 27863.

8-1.3. Plasmide pXL2777

Le plasmide pXL2777 (6,9 kb) possède le réplicon minimal de ColEl issu de pBluescript, le gène codant pour la résistance à la kanamycine, les séquences attP et attB du bactériophage 1 en orientation directe et séparées par le gène sacB codant pour la levanesucrase de B. subtilis (P. Gay et coll. 1983 J. Bacteriol. 153 pl424) et l'omegon Sp codant pour le gène de résistance à la spectinomycine Sp et la streptomycine Sm (P. Prentki et coll. 1984 Gène 29 p303). La cassette sacB-Sp ayant des extrémités de clonage EcoRV et Nsil provient du plasmide pXL2757 (FR95/01632) et a été clonée entre les sites EcoRV et Nsil du ρXL2776 pour former le pXL2777.

8-1.4. Plasmide pXL2960

Le plasmide pXL2960 (7,3 kb) possède le réplicon minimal de ColEl issu de pBluescript, le gène codant pour la résistance à la kanamycine, les séquences attP et attB du bactériophage 1 en orientation directe et séparées par i) le gène sacB codant pour la levanesucrase de B. subtilis (P. Gay et coll. 1983 J. Bacteriol. 153 pl424) et ii) le locus par de RK2 (Gerlitz et coll. 1990 J. Bacteriol. 172p6194). La cassette par ayant des extrémités BamHI provient du plasmide ρXL2433 (PCT/FR95/01178) et a été introduite entre les sites BamHI du pXL2777 pour générer le pXL2960.

8-2. Resolution de topo-isomères de minicercle ou de miniplasmide

Les plasmides pXL2777 et pXL2960 ont été introduits par transformation dans la souche de E- 5__i D1210HP. Les transformants ont été sélectionnés et analysés comme cela a été décrit dans l'exemple 2 avec les modifications suivantes : l'expression de l'intégrase a été induite à 42°C pendant 15 min lorsque la densité optique à 610 nm des cellules est de 1,8 puis les cellules sont incubées à 30°C pendant 30 min, voir figure 9 ou pendant une durée variant de 2 minutes à 14 heures (O/N), voir figure 10. L'ADN plasmidique provenant des cultures non induite et induite a été analysé sur gel d'agarose avant ou après digestion par un enzyme de restriction unique à la partie minicercle (EcoRI) ou miniplasmide (BglII). voir figureY, ou après action de l'ADN topo-isomèrase A ou la gyrase de E- ££__• Les formes dimères surenroulées de minicercle ou miniplasmide sont clairement mises en évidence par i) leur poids moléculaire, ii) leur linéarisation par l'enzyme de restriction, iii) leur changement de topologie par l'action de la topo-isomèrase A (dimère relâché) ou de la gyrase (dimère supersuperenroulé), iv) l'hybridation spécifique avec un fragment interne propre au minicercle ou au miniplasmide. D'autres formes topologiques de poids moléculaires plus élevées que celui du plasmide initial sont issues du plasmide initial ou du minicercle ou du miniplasmide puisqu'elles disparaissent après digestion par l'enzyme de restriction unique à la partie minicercle (EcoRI) ou miniplasmide (BglII). Ces formes sont beaucoup moins abondantes avec le pXL2960 qu'avec le pXL2777 comme plasmide initial, voir figure 10. En particulier la forme dimère de minicercle est présente de manière non négligeable avec le plasmide pXL2777 alors qu'elle est

invisible avec le plasmide pXL2960, lorsque les cellules sont incubées au moins 30 min à 30°C, voir figures 9 et 10. Il est à noter que des dimères de minicercle sont observés en début de cinétique avec le pXL2960 (2 à 10 min.), puis sont ensuite résolus (après 30 min.), voir figure 10. Par conséquent le locus par conduit à une diminution significative des formes oligomériques/topologiques résultant de l'action de l'intégrase du bactériophage 1 chez E- eoli sur les plasmides contenant les séquences attP et attB en orientation directe.

IDENTIFICATIONDESSEQUENCESNUCLEOTIDIOUES

SEQ ID n° 1 : Oligonucléotide 5476 : 5' -AATTGTGAAGCCTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGG-3 ' SEQ ID n° 2 : Oligonucléotide 5477 5'-AATTCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAC-3' SEQ ID n° 3 : Oligonucléotide 4957 :

5'-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG AAC-3' SEQ ID n° 4 : Oligonucléotide 4958 :

5'-GATCGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT TCG-3 ' SEQ ID n° 5 :oligonucléotide poly-CTT : 5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3' SEQ ID n° 6 : (Séquence attB du phage lambda) :

SEQ ID n° 7 : (Séquence attP du phage lambda) : 5'-CAGCTTTTTTATACTAAGTTG-3'

SEQ ID n° 8 : (Séquence attB du phage P22) :

5'-CAGCGCATTCGTAATGCGAAG-3'

SEQ ID n° 9 : (Séquence ______ du phage P22) :

5' -CTTATAATTCGTAATGCGAAG-3' SEQ ID n° 10 : (Séquence ______ du phage F80) :

5'-AACACTTTCTTAAATGGTT-3'

SEQ ID n° 11 : (Séquence attP du phage F80) :

5'-AACACTTTCTTAAATTGTC-3'

SEQ ID n° 12 .-(Séquence ____% du phage HP1 ) ^' : 5'-AAGGGATTTAAAATCCCTC-3'

SEQ ID n° 13 : (Séquence attP du phage HP1 ) :

5'-ATGGTATTTAAAATCCCTC-3'

SEQ ID n° 14 : (Séquence ait du plasmide pSAM2) :

5'-TTCTCTGTCGGGGTGGCGGGATTTGAACCCACGACCTCTTCGTCCCGAA-3 ' SEQ ID n° 15 : (Séquence de reconnaissance de la résolvase du transposon Tn-2) :

5'-CGTCGAAATATTATAAATTATCAGACA-3'

SEQ ID n° 16 : oligonucléotide 6006 :

5'-GATCTGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAG AACTGCAGATCT-3'

SEQ ID n° 17 : oligonucléotide 6008

5' -GATCAGATCTGCAGTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT TCTTCTTCTTCA-3 '

SEQ ID n° 18 : (Séquence présente sur le plasmide pXL2727 correspondant à l'oligonucléotide 6008) : 5 ' -GATCAGATCTGCAGTCTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTCTTCT TCA-3'

SEQ ID n° 19 : (oligonucléotide 116418) :

5' -CTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3 '

SEQ ID n°20 : (oligonucléotide 5542) : 5'-AGCTTCTCGAGCTGCAGGATATCGAATTCGGATCCTCTAGAGCGGCCGCGAGCT CC-3'

SEQ ID n° 21 -. (oligonucléotide 5543) :

5'-AGCTGGAGCTCGCGGCCGCTCTAGAGGATCCGAATTCGATATCCTGCAGCTCGA GA-3' SEQ ID n° 22 : oligonucléotide sens 6194 :

5'- CTAGTGGCCATGCATCCGCTCAAGTTAGTATAAAAAAGCAGGCTTCAG-3 '

SEQ ID n° 23 : oligonucléotide antisens 6195 :

5'- GÇTΓ-TGAAG CTGCTTTTTTATACTAACTTGAGCGGATGCATGGCCACTAGTA

_______ ' SEQ ID n° 24 : oligonucléotide sens 6190 : 5'-GCGTCTAGAACAGTATCGTGATGACAGAG-3 ' SEQ ID n° 25 : oligonucléotide antisens 6191 : 5'-GCCAAGCTTAGCTTTGCACTGGATTGCGA-3 '

Références bibliographiques

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Sons, New York. Behr J.P. 1993. Ace. Chem. Res. 26:274-278.

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Wils êî al. Biochem. Pharmacol. 48:1528-1530.

LISTE DE SEQUENCES

(1 ) INFORMATION GENERALE:

(i) DEPOSANT:

(A) NOM: RHONE-POULENC RORER S.A.

(B) RUE: 20, avenue Raymond ARON

(C) VILLE: ANTONY (E) PAYS: FRANCE

(F) CODE POSTAL: 92165

(ii) TITRE DE L' INVENTION: Molécules d'ADN, préparation et utilisation en thérapie génique.

(iii) NOMBRE DE SEQUENCES: 25

(iv) FORME LISIBLE PAR ORDINATEUR: (A) TYPE DE SUPPORT: Tape (B) ORDINATEUR: IBM PC compatible

(C) SYSTEME D' EXPLOITATION: PC-DOS/MS-DOS

(D) LOGICIEL: Patentin Release #1.0, Version #1.25 (OEB)

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 1:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 37 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 1:

AATTGTGAAG CCTGCTTTTT TATACTAACT TGAGCGG

37

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 2:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 37 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 2:

AATTCCGCTC AAGTTAGTAT AAAAAAGCAG GCTTCAC

37

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 3:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 57 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 3:

GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAC 57

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 4: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 57 paires de bases

(B) TYPE: îacide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 4: GATCGTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCG 57

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 5:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 25 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 5: GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 6:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 21 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 6:

CTGCTTTTTT ATACTAACTT

21

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 7:

(i) CARACTERISriQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 21 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 7:

CAGCTTTTTT ATACTAAGTT

21

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 8:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(Xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 8:

CAGCGCATTC GTAATGCGAA

21

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 9:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 9:

CTTATAATTC GTAATGCGAA G 21

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 10: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 19 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 10: AACACTTTCT TAAATGGTT

19

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 11:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 19 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire

(11) TYPE DE MOLECULE: ADNc (111) HYPOTHETIQUE: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 11:

AACACTTTCT TAAATTGTC

19

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 12:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 19 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ni) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON

(x ) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 12:

AAGGGATTTA AAATCCCTC

19

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 13:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 19 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 13:

ATGGTATTTA AAATCCCTC

19

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 14:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 49 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 14:

TTCTCTGTCG GGGTGGCGGG ATTTGAACCC ACGACCTCTT CGTCCCGAA 49

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 15: (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 27 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (ni) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 15: CGTCGAAATA TTATAAATTA TCAGACA

27

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 16:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 66 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (ni) HYPOTHETIQUE: NON (in) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 16:

GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAACTGC

60

AGATCT

66

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 17:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 66 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire (n) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 17:

GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT 60

TCTTCA 66

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 18:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 58 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 18:

GATCAGATCT GCAGTCTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT CTTCTTCA 58

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 19:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 21 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 19:

CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT

21

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 20:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 56 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire (il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 20:

AGCTTCTCGA GCTGCAGGAT ATCGAATTCG GATCCTCTAG AGCGGCCGCG AGCTCC 56

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 21 : (i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 56 paires de bases

(B) TYPE: iacide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON (m) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 21: AGCTGGAGCT CGCGGCCGCT CTAGAGGATC CGAATTCGAT ATCCTGCAGC TCGAGA 56

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 22:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 49 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double (D) CONFIGURATION: linéaire

(il) TYPE DE MOLECULE: ADNc (m) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 22:

ACTAGTGGCC ATGCATCCGC TCAAGTTAGT ATAAAAAAGC AGGCTTCAG 49

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 23:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE:

(A) LONGUEUR: 57 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique (C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 23:

AGCTCTGAAG CCTGCTTTTT TATACTAACT TGAGCGGATG CATGGCCACT AGTAGCT 57

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 24:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 29 paires de bases (B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire

(ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc (iii) HYPOTHETIQUE: NON (iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 24:

GCGTCTAGAA CAGTATCGTG ATGACAGAG

29

(2) INFORMATION POUR LA SEQ ID NO: 25:

(i) CARACTERISTIQUES DE LA SEQUENCE: (A) LONGUEUR: 29 paires de bases

(B) TYPE: acide nucléique

(C) NOMBRE DE BRINS: double

(D) CONFIGURATION: linéaire (ii) TYPE DE MOLECULE: ADNc

(iii) HYPOTHETIQUE: NON

(iii) ANTI-SENS: NON

(xi) DESCRIPTION DE LA SEQUENCE: SEQ ID NO: 25:

GCCAAGCTTA GCTTTGCACT GGATTGCGA 29