La présente invention concerne un procédé de production d\'ethanol par cofermentation du glucose et du xylose par un couple de microorganismes comprenant un microorganisme fermentant le glucose et un microorganisme fermentant le xylose . Le but de la présente invention est de fournir un procédé pour transformer , par voie biologique , le glucose et le xylose en ethanol, de façon simultanée dans une seule zone de réaction .

La biomasse issue des produits et/ou coproduits agricoles ou agro-alimentaires constitue un réservoir considérable pour la production de molécules d\'intérêt industriel . Ce gisement à caractère renouvelable est en effet estimé à 10 tonnes équivalent charbon par an à l\'échelle mondiale . Parmi ces molécules , l\'ethanol occupe une place très intéressante . Cette molécule peut d\'une part offrir des débouchés massifs et diversifiés à l\'agriculture et d\'autre part constituer un substitut aux produits pétroliers dont le marché est fragile ( prix , offre ) . L\'ethanol peut être utilisé dans le domaine énergétique ( carburants ou additifs aux carburants fossiles comme donneurs d\'octane ) et dans le domaine alimentaire . Par ailleurs, il peut constituer une molécule de base pour la carbochimie et peut donc avoir des débouchés dans les plastiques , peintures, caoutchoucs , fibres , films . Concernant l\'utilisation de l ¹ ethanol dans le domaine énergétique , le marché est estimé à 12 millions d\'hectolitres par an au niveau français . Il faut souligner que les biocarburants sont favorables à la qualité de l\'environnement , en limitant les

émissions toxiques (monoxyde de carbone , composés azotés ) .

La transformation du carbone agricole en ethanol (notamment les hexoses ) par voie fermentaire peut être considérée comme techniquement maîtrisée . Néanmoins une limitation importante subsiste au niveau des coûts de production, compte tenu du fait que le prix de la matière première entre pour 40 à 70 % dans le coût du produit final. Il est donc impératif d\'un point de vue économique d\'utiliser du carbone fermentescible à faible coût . Dans ce cadre, l\'utilisation des sucres dérivés des lignocelluloses apparaît favorable pour lever cette limitation . De plus , parmi les sources de carbone fermentescible , les lignocelluloses sont bien placées pour leur teneur en sucres par rapport à la matière sèche et au niveau de disponibilité . L\'utilisation des lignocelluloses pour la production d\'ethanol peut d\'une part concerner les coproduits ( rafles , pailles, bagasse ) dans le cas d\'une production d\'ethanol à partir de produits agricoles comme les céréales ou les mélasses de canne et d\'autre part concerner exclusivement certains produits agricoles ( taillis à courte rotation) . Le schéma est dépendant de la conversion alcoolique du xylose , sucre dérivé des hémicelluloses et représentant le second sucre en termes quantitatifs, après le glucose d\'origine cellulosique , des matériaux lignocellulosiques .

Des procédés de production d\'ethanol à partir d\'une substance contenant du xylose , comprenant la fermentation de cette substance avec une levure ont été décrits , notamment dans les brevets US-A- 4.359.534 et 4.368.268 dans lesquels la fermentation

utilise les levures appartenant aux espèces Pachysolen tannophilus ou Pichia stipitis ou Pichia segobrensis ou Candida shehatae ou des mutants de levures de la souche Candida sp. La description de ces procédés a suscité un regain d\'intérêt pour la conversion des lignocelluloses en ethanol . En effet, la conversion du sucre majeur dérivé de la fraction hémicellulosique ( xylose ) en plus de celle du sucre majeur dérivé de la fraction cellulosique ( glucose ) permettrait d\'augmenter le rendement global de conversion des lignocelluloses en ethanol.

Le procédé de conversion alcoolique du glucose par des microorganismes du genre Saccharomyces ou Zymomonas ainsi que le procédé de conversion alcoolique du xylose par les levures décrites ci- dessus ont été largement étudiés individuellement aux points de vue cinétique, stoechiométrique et physiologique. Maintenant , il s\'agit de développer des schémas de production d\'ethanol par fermentation des lignocelluloses qui utilisent à la fois le glucose dérivé de la cellulose et le xylose dérivé des hémicelluloses.

Bien que les levures fermentant le xylose puissent également convertir le glucose en ethanol, il est préférable de réaliser cette conversion avec un microorganisme à haut potentiel fermentaire du glucose du genre Saccharomyces ou Zymomonas, dont les rendements alcooliques et les productivités à partir de ce sucre sont plus élevés que ceux obtenus à partir du glucose avec des levures comme Pichia stipitis, Candida shehatae ou Pachysolen tannophilus . En utilisant des microorçanismes spécifiques de chacun des deux sucres , il est possible de concevoir deux

types de procédés de conversion du glucose et du xylose en ethanol: a) Procédés de fermentations parallèles du glucose et du xylose faisant suite à une séparation de ces deux sucres au stade de l\'hydrolyse ( hydrolysats hémicellulosique et cellulosique respectivement ) . b) Procédés de fermentation simultanée du glucose et du xylose par coculture de deux microorganismes, l\'un fermentant le glucose , l\'autre le xylose ( hydrolysat lignocellulosique total ) .

Les procédés de fermentation simultanée du glucose et du xylose utilisant un microorganisme fermentant le glucose associé à un microorganisme fermentant le xylose doivent prendre en compte la nécessité d\'un apport d\'oxygène pour l\'obtention d\'une conversion accrue efficace du xylose en ethanol par des levures telles que Pichia stipitis, Candida shehatae ou Pachysolen tannophilus . L\'impératif pour ces levures de maintenir un équilibre entre la production et la consommation des cofacteurs d\'oxydoréduction ainsi que les caractéristiques métaboliques de la conversion du xylose en ethanol sont à l\'origine de la nécessité d\'un système générateur de NAD+ comme la chaîne respiratoire pour une fermentation rapide du xylose en ethanol ( Prior B.A., Kilian S.G., Du Preez J.C., Process Bioche istry, 24 (1) , 21-32, (1989).

De préférence aussi , on s\'efforcera de lever ou réduire la répression catabolique exercée par le glucose sur l\'utilisation du xylose chez les levures telles que Pichia stipitis, Candida shehatae et Pachysolen tannophilus lorsqu\'elles sont cultivées sur un mélange glucose/xylose.

Des essais de cofermentation du glucose et du xylose avec des cellules immobilisées de Pichia stipitis CBS 5573 et de Saccharomyces cerevisiae CBS 8066 ont été décrits par Grootjen D.R.J. Meijlink L.K.H.M., Vleesenbeek R. Van der_.Lans R.G.J.M., Luyben K.Ch.M., Enzyme and Microbial Technology, 13, 530-536 (1991). Avec ces souches de levures co-immobilisées dans un même réacteur et en utilisant des conditions de culture continue et aérobie , un faible taux de conversion du xylose est obtenu en dépit de l\'utilisation d\'une forte concentration cellulaire de Pichia stipitis . Ces auteurs rapportent que le phénomène observé est dû au fait que Pichia stipitis est privée d\'oxygène , celui-ci étant consommé par la levure Saccharomyces cerevisiae qui fermente le glucose du mélange de sucre étudié . Le même phénomène a été observé en utilisant ces deux souches de levures dans deux réacteurs en série ( voir : Grootjen D.R.J. Jansen M.L., Van der Lans R.G.J. and Luyben K . C:. . Λ . , Enzyme and Microbial Technology, 13, 828-833,(1991).

D\'autres essais de cofermentation du glucose et du xylose par Saccharomyces cerevisiae associée à Pachysolen tannophilus cultivées en système discontinu et en microaérobiose ont été décrits par Beck M.J. Johnson R.D., Baker C.S., Applied Biochemistry and Biotechnology, 24/25, 415-424 , 1990. Dans ces essais, les auteurs observent , à défaut d\'une cofermentation ces deux sucres , une utilisation séquentielle du glucose et du xylose. Ainsi les essais réalisés jusqu\'à ce en laboratoire n\'ont pas permis la mise au point d\'un procédé efficace pour la cofermentation alcoolique du glucose et du xylose dans une même zone de réaction,

l\'obstacle majeur étant la non disponibilité de l\'oxygène transféré à la culture pour la levure utilisée pour la fermentation du xylose en ethanol.

Le but de la présente invention est de fournir un procédé qui permet en cocultivant un microorganisme fermentant le glucose avec un microorganisme fermentant le xylose , d\'obtenir la cofermentation efficace du glucose et du xylose en ethanol.

Les microorganismes utilisables dans l\'invention sont des levures appartenant à des espèces fermentant efficacement le glucose en ethanol et par exemple l\'espèce Saccharomyces cerevisiae pour la fermentation du glucose et des levures autres que les précédentes capables de convertir le xylose en ethanol, et par exemple des espèces Pichia stipitis et Candida shehatae pour la fermentation du xylose.

L\'invention a pour objet un procédé de production d\'ethanol par mise en fermentation, en présence d\'oxygène, d\'un milieu de culture alimenté en éléments nutritifs et en un mélange de sucres contenant du glucose et du xylose comme sucres majeurs , constituant la source essentielle de carbone pour la fermentation, et en présence simultanée d\'au moins une première levure capable de convertir le glucose en ethanol et d\'au moins une seconde levure n\'appartenant pas au même genre que la première levure , capable de convertir le xylose en ethanol , dans des conditions de culture permettant le développement desdites levures, caractérisé en ce que la première levure est un mutant déficient respiratoire de ladite première levure capable de convertir le glucose en ethanol .

On opère de préférence avec des additions continues ou périodiques dudit mélange des sucres,

avec si nécessaire des éléments nutritifs additionnels , lesdites additions n\'étant effectuées que lorsque au moins 8C% et de préférence au moins 98% du glucose précédemment introduit a déjà été converti. Par "éléments nutritif " , on entend les éléments bien connus nécessaire ; à la croissance des levures , et par exemple de l\'extrait de levure, de l\'extrait de malt et m ou plusieurs sels minéraux , notamment du sulfate d\'ammonium. Ces éléments ne constituent pas la source essentielle de carbone, celle-ci étant constituée par l\'apport en sucres précité.

On peut opérer avec les cellules dispers. es en continu ou semi-continu ( fed-batch) trime décrit en détail ci-après.

On peut aussi opérer en culture à haute densité cellulaire . Dans ce cas les cellules de levures sont retenues dans le fermenteur , et cela par exemple avec des cellules immobilisées, avec des cellules floculées ou avec des cellules recyclées par une technique utilisant une membrane . Le fait d\'opérer à taux élevé de conversion du glucose se traduit par le maintien d\'une faible valeur de la concentration en glucose dans le milieu de fermentation; cela est rendu possible , malgré l\'alimentation continue ou périodique en mélange de glucose et xylose, par le fait que la vitesse de conversion du glucose par la première levure est élevée . On parvient ainsi à lever ou réduire 1\'inhibition exercée par le glucose sur la levure de conversion du xylose . Par ailleurs , le fait d\'utiliser une première souche à besoin nul ou négligeable en oxygène rend celui-ci disponible pour la levure convertissant le xylose .

Dans ce qui suit , on décrira l\'invention dans le cas où la première levure est Saccharomyces cerevisiae ou Saccharomyces diastaticus , qui constituent les espèces dont l\'emploi est préféré dans l\'invention. Mais il doit être entendu que toute autre levure à bon pouvoir de conversion du glucose en ethanol pourra convenir après avoir subi un traitement pour la transformer en mutant déficient respiratoire .

A titre d\'exemples de telles souches , on peut mentionner :

Saccharomyces eliipsoïdeus Saccharomyces carlberqensis Saccharomyces uvaru Saccharomyces fragilis Schizosaccharomyces po be

Schizosaccharomyces species Kluyvero yces arxianus Zygosaccharo yces rouxii Saccharomyces bayanus. Schwanniomyces occidentalis

On opère de préférence avec alimentation et soutirage continus ou périodiques , de manière à maintenir un volume reactionnel sensiblement constant . De préférence, en marche continue , on maintient un taux d\'alimentation en mélange des sucres tel que le dosage du glucose par HPLC ou chromatographie liquide à haute performance dans l\'effluent du fermenteur donne une valeur nulle, c\'est-à-dire une concentration inférieure à la limite de précision du dosage , estimée à 0,1 g de glucose/litre . On est ainsi assuré qu\'à chaque instant plus de 80% du glucose a été converti.

On peut aussi opérer avec une alimentation

continue ou périodique sans soutirage (fed-batch) bien que ce soit moins avantageux . Dans ce cas également on ne procédera à une nouvelle addition du mélange de sucres que lorsque au moins 80% ( ou au moins 98%) du glucose précédemment introduit aura déjà été converti.

En pratique , si les taux de conversion tombent au-dessous de la valeur désirée, on réduira le taux d\'alimentation en sucres ; inversement on pourra accroître ce taux d\'alimentation si les taux de conversion très élevés le permettent .

Par mutant déficient-respiratoire d\'une certaine levure , on entend in mutant qui est essentiellement incapable d\'assimiler le glycerol ou qui ne l\'assimile que faiblement . Ainsi, par exemple , un mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae n\'assimile pas ou pratiquement pas le glycerol, contrairement aux souches conventionnelles telles que CBS 1200 ou NCYC 625 .

Un test simple permettant de déterminer si une souche est capabl- ou non d\'assimiler le glycerol consiste à cultive., la souche en boîtes de Pétri sur milieu solide à 30°C pendant 48 heures .

La culture sur boîte de Pétri à 20 g/1 de glucose sert de culture de référence . Sur cette boîte après 48 heures d\'incubation à 30°C les colonies ont un diamètre de 2mm environ . Les boîtes contenant lg/1 de glucose et celles contenant lg/1 de glucose + 20 g/1 de glycerol permettent de révéler le caractère déficient respiratoire . En effet , le glycerol est un substrat dont le métabolisme est uniquement respiratoire . En conséquence , les mutants déficients respiratoires sont incapables d\'utiliser le glycerol pour leur croissance . Cela se traduit sur la boîte

contenant du glucose 1 g/1 + glycerol 20 g/1 par de petites colonies de 0,1mm de diamètre qui ne diffèrent pas sensiblement des colonies observées sur la boîte renfermant seulement lg/1 de glucose. Au contraire, une souche non-mutée telle que

CBS 1200 ou NCYC 625 , cultivée sur glucose lg/1 + glycerol 20 g/1, donne des colonies d\'un diamètre d\'environ 2 mm , indiquant l\'utilisation du glycerol .

La mutation de Saccharomyces cerevisiae en mutant déficient respiratoire peut être réalisée selon la méthode dérivée de celle décrite par Sionimski et al. ( Biochemical and Biophysical Research Communications, 1968, vol.30,N°3, pages 232-239) par exemple comme suit : On cultive les cellules en boîte de Pétri sur un milieu gélose complet . On dépose une goutte de bromure d\'éthydium à 10 mg/1 au centre de la boîte . On constate que les cellules situées au centre de la boîte ont été tuées (aucun développement ) . On prélève des colonies à la limite de la zone où les cellules ont été tuées par le bromure d\'éthydium . On procède ensuite à un test de croissance de la biomasse sur milieu différentiel ( absence d\'assimilation du glycerol ) . Comme levure convertissant le xylose en ethanol, on peut utiliser , par exemple , une levure du genre Pichia ou du genre Candida , choisies de préférence parmi les espèces Pichia stipitis , Candida shehatae , Pachysolen tannophilus, Candida utilis, Candida tropicalis, Candida tenuis ou Pichia segobiensis .

La levure utilisée pour convertir le xylose en ethanol doit présenter une compatibilité de croissance

avec la souche utilisée pour fermenter le glucose, notamment les mutants déficients respiratoires de Saccharomyces cerevisiae, par exemple ceux obtenus à partir de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 ou NCYC 625 . Cette compatibilité peut être aisément déterminée par un essai préalable simple . Toutes les souches de Pichia stipitis essayées - NRRL Y7124, NRRL Y 11543, NRRL Y 11544, NRRL Y11545 - et toutes les souches de Candida shehatae essayées - NRRL Y12857, NRRL Y 17024, NRRL Y 12 858, NRRL Y 12856, ATCC 22984 - présentent cette caractéristique vis-à-vis de l\'une au moins des souches de Saccharomyces cerevisiae précitées . L\'utilisation de toutes ces souches à titre non-limitatif est donc envisagée dans le procédé décrit .

Tous les substrats contenant du D-glucose et du D-xylose comme sucres majeurs conviennent dans le procédé décrit pourvu qu\'ils ne contiennent aucun constituant qui soit un inhibiteur puissant pour le processus . N\'importe quelle matière ligno- cellulosique contenant de la cellulose et de 1\'hemicellulose telle que bois, paille , bagasse , rafles de maïs peut servir de matière première pour fournir les hydrolysats sucrés utilisables dans le procédé auxquels on peut apporter les éléments nutritifs additionnels nécessaires à la fermentation et qui ont été définis plus haut .

Le procédé décrit met en jeu la fermentation alcoolique en milieu aqueux du D-glucose et du D- xylose . Les conditions chimiques et physiques du milieu doivent par ailleurs être telles que la viabilité des deux microorganismes associés soit maintenue .

La fermentation est entretenue dans l\'intervalle de température de 15-40"C , l\'intervalle de 26-34°C étant optimum pour la vitesse de production d\'ethanol . Le développement des levures s\'effectue dans l\'intervalle de pH de 3 à 7 , un développement optimal étant observé au pH de 5.

Comme on l\'a vu plus haut, un élément important dans la forme de réalisation préférée du procédé consiste à n\'effectuer, en continu ou périodiquement , des ajouts du mélange de sucres que lorsque l\'on a vérifié que 80% ( ou de préférence 98 % ) au moins du glucose précédemment introduit a été converti . On pourra utiliser un mélange des sucres glucose et xylose composé par exemple de 10 à 90% de glucose et 90 à 10% de xylose , en poids , et de préférence de 50 à 80% de glucose et 50 à 20 % de xylose , en poids .

Si la concentration totale en ce mélange des sucres dans la solution aqueuse sucrée d\'alimentation est comprise entre , par exemple , 5g/l et la saturation , et de préférence entre 10 et 150 g/1, on adoptera avantageusement un taux de dilution D, à savoir un rapport du débit volumique horaire de la solution d\'alimentation au volume reactionnel de 0,0001 à 2 h ^-1 et de préférence de 0,001 à 1 h ^-1 .

Il est entendu que les autres éléments nutritifs peuvent être apportés en mélange avec les sucres ou séparément.

Les valeurs ci-dessus ne sont toutefois données qu\'à titre d\'indication, du fait qu\'un simple dosage de glucose dans l\'effluent du fermenteur permettra de déterminer le taux de conversion du glucose et donc de savoir s\'il satisfait les exigences ci-dessus .

La culture continue des espèces définies plus haut se fait en présence d\'oxygène dans un milieu de culture renfermant les éléments nutritifs classiques bien connus des biochimistes et qu\'il est donc inutile d\'indiquer en détail ici . Ce milieu renferme entre autres des sels minéraux essentiels , des vitamines et des oligo-éléments .

Le débit d\'aération doit être suffisant pour permettre la fermentation des sucres, et notamment du xylose , mais non excessif, ce qui diminuerait le rendement en ethanol par suite d\'une production cellulaire accrue et d\'une oxydation de l\'ethanol produit . La valeur optimale du débit d\'air peut être déterminée par des essais simples . Exprimée comme la vitesse de transfert en oxygène, elle est , par exemple de 0,0001 à 500 et de préférence 0,001 à 100 millimoles d\'oxygène par litre de milieu de fermentation et par heure . Pour la mesurer, il suffit de faire la différence entre l\'oxygène introduit dans le fermenteur et l\'oxygène déchargé de ce dernier, donc de faire le bilan en oxygène, et de rapporter le résultat à l\'unité de volume de milieu de fermentation et à l\'unité horaire.

Les exemples suivants sont destinés à décrire plus complètement le procédé de l\'invention mais ne doivent pas être considérés comme limitant le domaine de l\'invention défini par les revendications. Procédure expérimentale générale ;

Par traitement au bromure d\'éthydium on a préparé tout d\'abord un mutant déficient respiratoire de chacune des deux souches suivantes : Saccharomyces cerevisiae : souches CBS 1200 ( décrite par Hoppe et Coll., Biotechnology. Letters, 1982, vol.4 ( 1 ) page

39 et Maiorella et Coll., Biotechnology and Bioengineering, 1984, 26, page 1155 , obtenue auprès du Central Bureau Voor Schimmelculture, Delft ; souche NCYC 525 (décrite par Spencer et Coll., Current Geπetics, 1983, 7, page 159 et Kleinman M.J. et Coll., Biochem J, 1988, 249, page 163 obtenue auprès du National Council Yeast Collection, Norwich , Grande- Bretagne .

Des cultures inclinées sur gélose de Pichia stipitis ; souches NRRL Y7124 ( décrite par Dellweg et Coll, Biotechnology Letters, 1934, 6, page 395 , et Delgenes et Coll., Biotechnology Bioengineering, 1989, 34, page 398 ) , NRRL Y11543 ( décrite par Dellweg et Coll., Biotechnology Letters, 1984 , 6, page 695) , NRRL Y11544 (décrite par Toivola et Coll., Applied Environ ental Microbiology, 1984, 47, page 1221) , NRRL Y 11545 ( décrite par Toivola et Coll., Applied Environmental Microbioloby, 1984 , 47, page 1221 ) et de Candida shehatae souches NRRL Y 12857 (décrite par Slininçer et Coll., Biotechnology Letters, 1985, 7, page 431), NRRL Y 12858 ( décrite par Bruinenberg et Coll., Applied Microbiology Biotechnology , 1984, 19, page 256) , NRRL Y 12856 ( décrite par Slininger et Coll., Biotechnology Letters, 1985, 7, page 431 ) , NRRL Y 17024 ( décrite par Kurtz an, Antonie Van Leeuwenhoek, 1990, 57, page 215 ) ont été obtenues auprès du Northern Régional Research Center, Peoria Illinois. Une culture inclinée de Candida shehatae ATCC 22984 ( décrite par Dupreez J.C. et Coll., Biotechnology Letters, 1985, 7, page 241 et Laplace J.M. et Coll., Applied Microbiology and Biotechnology, 1991, 36, page 158 ) a été obtenue auprès de l\'American Type Culture Collection Rockville, Midland.

Les souches ont été maintenues sur des cultures inclinées de glucose à 30 ^* C . Le milieu de culture inciiné contenait 10 g/1 de glucose , 5 g/1 de peptone pancréatique , 3 g/1 d\'extrait d~ levure , 3 g/1 d\'extrait de malt et 20 ç/1 de gélose . Les milieux liquides pour la propagation des levures contenaient 5 g/1 de sulfate d\'ammonium, 3 g/1 d\'extrait de malt , 3 ç/1 d\'extrait de levure pendant le temps nécessaire à une consommation significative du substrat . La source carbonée consistait en du glucose seul pour Saccharomyces et du xylosa seul pour les levures du genre Pichia et Candida à la concentration de 50 ç/1 . La composition du milieu de fermentation ne différait que par la source carbonée qui consistait en un mélange de çlucose/xylose aux concentrations respectives de 35 g/1 et 15 g/1, proportions qui simulent un hydrolysat total de lignocelluloses . Pour le milieu naturel , la source carbonée est apportée par un hydrolysat total de bois de peuplier obtenu par voie enzymatique et dilué de façon à avoir une concentration globale en sucres de 50 g/1.

Pour réaliser la fermentation, on a introduit dans un fermenteur aéré le milieu liquide à 5 g/1 de sulfate d\'ammonium, 3 g/1 d\'extrait de malt et 3 g/1 d\'extrait de levure et on a alimenté en mélange des sucres ( solution à 50 g/1 du mélange des sucres apportant en outre 5 ç/1 de sulfate d\'ammonium, 3 ç/1 d\'extrait de malt et 3 ç/1 d\'extrait de levure ) à un débit positif mais limité de façon à avoir en permanence une conversion de glucose dans le fermenteur supérieure à 90% et de préférence voisine de 100%, ceci en cas d\'opération en continu .

Dans ces conditions on a pu obtenir une

conversion du xylose supérieure à 40% et pouvant même atteindre 100%.

La solution à 50 g/1 du mélange des sucres était réalisée dans un milieu liquide de même composition que celui introduit initialement dans le fermenteur ( sulfate d\'ammonium -5- extraits de malt et de levure), l\'ensemble apportant tous les éléments nécessaires à la croissance des levures, en quantités non-limitantes . Sauf indication contraire , on a opéré à 30 ^* C , pK= régulé à 5 et à un débit d\'aération de 0,005 vol/vol/mn.

L\'ethanol produit était mesuré par chromatographie en phase gazeuse . Le D-glucose et le D-xylose ont été quantifiés par HPLC (chromatographie en phase liquide à haute performance) . Le développement cellulaire total exprimé en g/1 ( poids sec ) a été mesuré par gravimétrie . Les proportions cellulaires respectives de la levure utilisée pour fermenter le glucose et de la levure utilisée pour fermenter le xylose , exprimées en pourcentage du nombre total de cellules présentes dans le fermenteur, ont été déterminées en boîtes de Pétri sur la base de l\'inaptitude du mutant déficient respiratoire à utiliser le glycerol comme source de carbone pour sa croissance .

Dans les études décrites ci-après les différentes valeurs données dans les tableaux ont été calculées comme suit à partir des dosages effectués sur les prélèvements :

* Rendement alcoolique , Y _p / _S ( g d\'ethanol produit par g de sucre consommé )

Y _p / _S = où E _j = concentration en ethanol en sortie

S _Q -Sf S _Q = concentration en sucres en entrée et Sf = concentration en sucres en sortie . débit d\'alimentation

* Taux de dilution, D = , en h ^-1 volume reactionnel * Productivité volumétrique en ethanol , Qp ( g d\'ethanol produit par litre de volume reactionnel par heure ) .

Qp = E _f .D où D est le taux de dilution tel que défini ci-avant . Dans les exemples qui suivent , on a utilisé des mutants déficients respiratoires de Saccharomyces cerevisiae CBS liOO N"1-1216 et de Saccharomyces diastaticus (cerevisiae) NCYC 625 N°1-1217 qui ont été préparés à partir des souches mères par le procédé du bromure d\'éthydium décrit plus haut . On a constaté ensuite que ces mutants n\'assimilaient pas le glycerol en procédant selon le test décrit plus haut . EXEMPLE 1:

Cofermentation du mélange modèle de sucres ( 35 g/1 de glucose + 15 g/1 de xylose) par le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et Candida shehatae ATCC 22984. L\'expérience a été effectuée conformément à la procédure exp* ^~ .mentale générale avec un débit d\'aération de 0, vvm et une vitesse d\'agitation de 800 tours/mn, correspondant à une vitesse de transfert en oxygène de 3,9 mmoles/1/h. Les paramètres de fermentation calculés au cours de l\'état stationnaire sont reportés

dans le tableau 1,

TABLEAU 1

Comme le montre le tableau 1 , le procédé de l\'invention a permis d\'obtenir la fermentation simultanée du glucose et du xylose en ethanol dans un même réacteur par le couple de levures comprenant le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae associé à Candida shehatae . EXEMPLE 2:

Cofermentation du même mélange des sucres que dans l\'exemple 1 par le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae NCYC 625 et Pichia stipitis NRRL Y 7124 avec un réacteur du type gazosiphon . On a opéré à haute densité cellulaire en utilisant la floculation comme outil de rétention cellulaire .

L\'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale . Trois taux de dilution ont été testés . Pour chaque taux de dilution, les paramètres de fermentation ont été calculés au cours de l\'état stationnaire. Ils sont présentés dans le tableau 2.

TABLEAU 2

Pour les trois taux de dilution testés . la totalité du glucose et du xylose est consommée . Le rendement alcoolique de 0,41 g/g correspond à 80% du rendement théorique . Le meilleur rendement alcoolique obtenu avec le couple mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae NCYC 625 et Pichia stipitis NRRL Y 7124 par rapport au couple testé dans l\'exemple 1 est relatif à une production moindre de xylitol par Pichia stipitis par rapport à Candida shehatae. EXEMPLE 3 :

Cofermentation du même mélange de sucres que dans l\'exemple 1 par le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et Pichia stipitis NRRL Y 11545. L\'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale . Les paramètres rassemblés dans le tableau 3 sont calculés au cours de l\'état stationnaire . Le débit

d\'aération était de 0,005 v/v/m avec agitation de 800 tours/ n soit une vitesse de transfert d\'oxygène de 1,7 mmoles/1/h.

TABLEAU 3

EXEMPLE 4:

Cofermentation du mélange modèle de sucres par le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et Candida shehatae ATCC 22984 selon le procédé fed-batch c\'est-à-dire sans soutirage et avec apports successifs de sucres ( 5 g à la fois). Chaque apport était effectué lorsque 90% au moins du glucose de l\'apport précédent avait disparu . Ces apports se faisaient sous la forme d\'une solution à 150 g/1 ( 112,5 g/1 de glucose et 37,5 g/1 de xylose) apportant en outre le sulfate d\'ammonium et les extraits de levure et de malt aux concentrations indiquées plus haut ( respectivement 5g/l, 3 g/1 et 3g/l) . Le réacteur était aéré au débit de 0,01 vvm . L\'agitation se faisait à 800 tours/ n . Les résultats obtenus figurent au Tableau 4.

TABLEAU 4

Les résultats expérimentaux ( exemples 1, 2 et

3 ) ont montré que la mise en oeuvre de conditions de culture continue permet de lever l\'effet glucose et par extension conduit à la cofermentation du glucose et du xylose par le couple de levures retenu . Le procédé fed-batch peut également créer ce type de conditions comme le montrent les résultats présentés dans le tableau 4 avec le mutant déficient respiratoire de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et

Candida shehatae ATCC 22984.

EXEMPLE 5 :

Cofermentation d\'un hydrolysat total de bois de peuplier par le mutant déficient respiratoire de

Saccharomyces cerevisiae NCYC 625 et Pichia stipitis NRRL Y7124. L\'hydrolysat total avait la composition suivante :

Cellobiose 11 g/kg

Glucose 329 g/kg

Xylose 72 g/kg Sucres totaux 412 g/kg

Cet hydrolysat a été dilué à l\'eau pour obtenir une concentration initiale en sucres de 50 g/1 ( 41

g/1 de glucose et 9 g/1 de xylose ) .

L\'expérience a été effectuée conformément à la procédure expérimentale générale , avec un réacteur gazosiphon. Le tableau 5 donne les résultats obtenus :

TABLEAU 5

Il est à noter que dans l\'exemple 5 on a utilisé un hydrolysat brut et que des rendements plus élevés en ethanol peuvent être obtenus si l\'on soumet 1\'hydrolysat brut à un traitement préalable de purification , par exemple par résine échangeuse d\'ions ou par extraction liquide - liquide avec un solvant .

Il convient aussi de noter que , dans les essais précédents , on peut remplacer Candida shehatae ATCC 22984 par Candida shehatae CSIR 599, remplacer Pichia stipitis NRRL 7124 par Pichia stipitis ATCC 58376 ou CBS 577 et Pichia stipitis NRRL 11545 par Pichia stipitis ATCC 58785 ou CBS 6054 afin d\'obtenir des résultats sensiblement équivalents . De même on peut remplacer les mutants déficients respiratoires de

Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et NCYC 625 par des mutants déficients respiratoires de ATCC 4126 et IFO 1958.

Le mutant déficient respiratoire obtenu à partir de Saccharomyces cerevisiae CBS 1200 et portant la référence interne CD 2304 a été déposé dans les Collections de l\'Institut Pasteur sous le n° 1-1216.

Le mutant déficient respiratoire obtenu à partir de Saccharomyces diastaticus ( = Saccharomyces cerevisiae ) NCY 625 et portant la référence interne

TN 1809 a été déposé dans les Collections de l\'Institut Pasteur sous le n° 1-1217.

Ces nouvelles souches de mutants de Saccharomyces cerevisiae, respectivement inscrites dans la Collection de Cultures CNCM de l\'Institut Pasteur à Paris sous les n° 1-1216 et 1-1217, ont permis d\'obtenir de bons résultats lorsqu\'elles sont mises en oeuvre dans le procédé de l\'invention.