Die DNA-Analyse mittels Hybridisierungstechnik ist ein be- kanntes Verfahren (in Gentechnische Methoden"G. Gassen und G. Schrimpf, Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg, 1999, Kap. 11"Blottingverfahren und Hybridisierungen", Seiten 243 bis 261). Auf einem festen Trägermaterial werden DNA-Sonden- Moleküle, sog. Fänger-Oligonukleotide immobilisiert, die auf- grund ihrer spezifischen Affinität mit der komplementären Proben-DNA, diese"einfangen"indem sie sog. Hybride, d. h.

Paare von Fänger-und Zielmolekül, bilden. Dieses Bindungser- eignis wird üblicherweise durch optische oder auch enzymati- sche Reportermoleküle angezeigt.

Anwendung für solche DNA-Analysen ist z. B. die Detektion von Infektions-Erregern, wie Tuberkulose oder HIV. Eine besondere Anforderung an die DNA-Analytik wird bei sog. Single Nucleo- tide Polymorphism", kurz SNP's, gestellt. Hier ist es erfor- derlich, dass ein Fängermolekül, das aus ca. 20 verschiedenen Nukleotiden besteht, Zielmoleküle, die sich in nur einem ein- zigen Nukleotid unterscheiden, selektiv bindet bzw. nicht bindet. Da die bindungsenergetischen Unterschiede sehr klein sind, sind die Anforderungen an die Selektivität des DNA- Sensors sehr hoch.

DNA-Sensoren sind vom Stand der Technik bekannt, wozu bei- spielsweise auf die nichtvorveröffentlichte DE 102 59 820 A1 und die DE 102 59 821 AI des Anmelders verwiesen wird. Die

Bildung der Fänger/Ziel-DNA-Hybride erfolgt unter spezifi- schen Randbedingungen, wobei zueinander passende Fänger/Ziel- DNA-Paare eine höhere Bindungsenergie haben als solche, die eine Fehlbasenpaarung besitzen. Aufgrund der geringen Bin- dungsenergieunterschiede bei SNPs lassen sich"perfect match" und single point mismatch"oftmals nicht eindeutig unter- scheiden.

Letzteres Problem wurde bisher dadurch gelöst, dass bei den Analyseverfahren des Standes der Technik ein sog."stringen- ter Waschschritt"eingeführt wurde, d. h. die Ionenstärke ei- ner Waschflüssigkeit wurde so gewählt, dass die zunächst un- spezifisch gebundenen"single base mismatch"Zielmolküle von den Fängern getrennt werden, die"perfect match"Zielmoleküle jedoch an den Fängermolekülen gebunden bleiben. Ebenso sind noch aufwendigere optische Schmelzpunktanalysen möglich. Bei diesem Verfahren nutzt man die intrinsische Veränderung der Lichtabsorption beim Schmelzen des DNA-Doppelstranges und es ist kein optischer Label notwenig. Sowohl beim stringenten Waschen als auch bei der optischen Schmelzpunktanalyse, bei der außerdem relativ große Mengen an DNA benötigt werden und ein Spektrophotometer für die Detektion in flüssiger Phase unerlässlich ist, können die Bedingungen meist nur auf eine einzige SNP eingestellt werden. Befinden sich mehrere SNPs auf einem Sensor-Chip, so ist die Trennung aller Fehlpaarun- gen nicht möglich.

Bei der optischen Detektion von Schmelzkurven ist oftmals die erforderliche Stabilität des optischen Signals (intrinsische Aktivität der DNA, bzw. Label) für kontinuierliche Messungen, bzw. Wiederholungsmessungen nicht gegeben. Das Gleiche gilt für irreversible Detektionsverfahren. Insbesondere kann es erforderlich sein, dass der Chip nach dem stringenten Waschen getrocknet werden muss, bevor er einer optischen Auslesung zugeführt werden kann

In An Active Microelectronics Device for Multiplex DNA Ana- lysis", M. Heller, IEEE Engineering in Medicine and Biology, March/April 1996, Seiten 100 bis 104 wird weiterhin eine sog."elektrische Stringenzbehandlung"beschrieben, bei der die Hybridisierung auf einem mit Elektroden versehenen Chip vorgenommen wird. Single-point-mismatch Hybride werden auf- grund des Poly-Anionen-Charakters der DNA durch negative Po- larisierung der Elektroden getrennt. Dieses Verfahren hat sich jedoch nicht als robustes und allgemeines Verfahren e- tablieren können. Außerdem ist bei diesem Verfahren eine ge- naue Kenntnis der jeweiligen SNP-Energieunterschiede erfor- derlich um die individuellen elektrischen Bedingungen wie e- lektrisches Potential, evtl. Pulsdauer und Intensität ein- stellen zu können. Durch die Anwendung von energiereichen Pulsen kann die DNA beschädigt werden.

Davon ausgehend ist es Aufgabe der Erfindung, ein einfaches und robustes, wie auch schonendes und reversibles Verfahren, das in einem Arbeitsgang mehrere SNPs mit unterschiedlichen, idealerweise auch unbekannten Schmelz-Temperaturen sicher de- tektieren kann, vorzuschlagen und eine zugehörige Anordnung zur Durchführung des Verfahrens zu schaffen.

Die Aufgabe ist erfindungsgemäß durch die Abfolge der Verfah- rensschritte gemäß Patentanspruch 1 gelöst. Vorteilhafte Wei- terbildungen sind in den abhängigen Verfahrensansprüchen an- gegeben.

Eine zugehörige Anordnung zur Durchführung des erfindungsge- mäßen Verfahrens ist Gegenstand des Patentanspruches 28. Wei- terbildungen dieser Anordnung sind in den abhängigen Sachan- sprüchen angegeben.

In spezifischer Weiterbildung macht sich das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise die Methodik der elektrochemi- schen Detektion, insbesondere des Redoxcyclings in Kombinati- on mit einem Enzymlabel bzw. enzymatischer Verstärkung zunut-

ze. Das dabei verwendete Enzym weist vorzugsweise eine ther- mische Stabilität auf. Die DNA-Fängermoleküle befinden sich auf einem festen Trägermaterial, vorzugsweise einem Silizium- Chip oder einem mit Elektroden versehenem Isolator.

Bei der erfindungsgemäßen Anordnung sind wenigstens eine Ein- richtung zur Temperaturkontrolle bzw. -regelung der Flüssig- keit über den Hybridisierungspositionen des Chips sowie eine Einrichtung zur Regelung der Flüssigkeitsfließgeschwindigkeit und zugehörige Detektionsmittel vorhanden. Im Einzelnen ist dazu der Sensorchip mit einem Mikrofluidiksystem inkl. Präzi- sionspumpe verbunden.

Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Figurenbeschreibung von Ausführungsbei- spielen. Es zeigen Figur la, 1b und lc das methodische Vorgehen bei der Erfin- dung mit drei Beispielen für vorgegebene Temperatur- profile, einem Flüssigkeitsflussprofil sowie mit ei- nem Sensorsignal einer einzelnen Hybridisierungsposi- tion in Abhängigkeit von der Zeit, Figur 2 und 3 die aus den Sensorsignalen (Stromkurven) gemäß Figur lc abgeleiteten Auswerte-bzw. Schmelzkurven mit den Anfangssteigungen des Stroms bzw. den auf das 40°C Signal normierten Stromanstieg als Funktion der Temperatur, Figur 4 eine schematisch dargestellte Anordnung zur Durchfüh- rung des Verfahrens, Figur 5 und Figur 6 die vergrößerte Darstellung zweier Ver- fahrenszustände in der Anordnung gemäß Figur 4, Figur 7 und Figur 8 ein Ausführungsbeispiel zur optischen De- tektion beim beschriebenen SNP-Verfahrens und Figur 9 und Figur 10 ein Ausführungsbeispiel zur elektroche- misch enzymatischen Variante des Verfahrens.

Es soll ein Verfahren zur Detektion von DNA-Punktmutationen (SNP-Analyse), unter Ausnutzung einer Bindung, d. h. Hybridi- sierung, von nachzuweisender Ziel-DNA an auf einem DNA-Chip positionsspezifisch immobilisierter Fänger-DNA durchgeführt werden : Zur vorteilhaften Realisierung der SNP-Analyse wird insbeson- dere folgendermaßen vorgegangen : Ein Transducer-Chip, z. B. ein Silizium-Chip oder andere, vorzugsweise planare Arrays mit mindestens einer Hybridisierungsposition und vorzugsweise elektrochemischen Transducern z. B. in Form von Mikro- Edelmetall-Elektroden wird mit mindestens einer Art von DNA- Fängersonden beladen. Die Transducer haben z. B. einen Durch- messer von 180 ßm und ein zweidimensionales Rastermaß von 200x200 ßm. Das Transducer-Array besitzt mehrere 10 bis ca.

100 Positionen. Zur Realisierung von SNP-Analysen werden die Sequenzen der Fängersonden so ausgewählt, dass jeweils alle vier möglichen Nukleotid-Varianten eines SNP gespottet wer- den. Bei genauer Kenntnis der Schmelzbedingungen von Ideal- paarung (match) und Fehlpaarung (mismatch) kann auch mit ei- ner einzigen Art von Fängersonde gearbeitet werden. Aus der Lage der Schmelzkurve kann dann auf Match oder Mismatch ge- schlossen werden. Um alle drei möglichen analytischen Situa- tionen (l : nur Match, 2 : nur Mismatch, 3 : Match kombiniert mit Mismatch) sicher detektieren zu können, sind im einfachsten Fall zwei Messpositionen mit Match-bzw. Mismatch- Fängersonden erforderlich.

Zur praktischen Umsetzung der neuen Messmethode wird der Chip in eine Durchflusszelle eingebaut, die eine dünne Flüssig- keitsschicht über den Hybridisierungspositionen des Chips, die ein Transducer-oder Sensor-Array bilden, möglich macht.

Die Hybridisierung mit der Analyt-DNA-Probe, insbesondere ein biotinyliertes PCR-Produkt, wird bei einer solchen Temperatur durchgeführt, bei der alle Match-aber auch Mismatch-Hybride entstehen können. Anschließend wird über die biotinylierten Ziel-DNA Streptavidin-Enzym-Konjugat angekoppelt.

Nunmehr wird eine Lösung mit dem für das Enzym spezifischen Substrat über den Sensor-Chip gepumpt. Die Pumpe wird für z. B. 5-10 s vorzugsweise bei konstanter Temperatur gestoppt und die Anfangssteigung des Stromanstiegs wird gemessen. Der Stromanstieg resultiert aus der Tatsache, dass das Labelenzym (z. B. eine thermostabile Esterase) das Enzymsubstrat (dem En- zym entsprechend z. B. p-Aminophenylacetat) umsetzt, das dar- aus entstehende Reaktionsprodukt (entsprechend p-Aminophenol) an den Transducerelektroden elektrochemisch umgesetzt wird und dadurch ein dem Reaktionsprodukt proportionaler elektri- scher Strom generiert wird. Der Anstieg des elektrischen Stroms resultiert aus der Tatsache, dass das Enzym am Ort der Bindung kontinuierlich Reaktionsprodukt nachliefert und somit ein Anstieg der Produkt-Konzentration stattfindet was mit ei- nem Anstieg des elektrischen Stroms einhergeht.

Hervorzuheben ist, dass das zu detektierende Reaktionsprodukt (z. B. p-Aminophenol) am gebundenen Labelenzym freigesetzt wird und frei diffundieren kann, bzw. mit dem Strom der En- zymsubstratflüssigkeit weggespült werden kann. Eine Detektion mittels vorzugsweise elektrochemischer Umsetzung an Elektro- den oder durch optische Detektion, z. B. durch Absorptionsmes- sung von geeigneten optisch aktiven Reaktionsprodukten, kann nur dann erfolgen, wenn die Fließgeschwindigkeit der Enzym- substratlösung zur Detektion deutlich reduziert wird oder vorzugsweise auf Null gesetzt wird.

Anschließend wird die Flüssigkeitspumpe wieder in Betrieb ge- nommen (wenige ßl/min) und gleichzeitig die Temperatur defi- niert um wenige °C, z. B. 2°C, erhöht. Durch diese Maßnahme werden zum einen die angereicherten Reaktionsprodukte von den Detektionsorten entfernt, zum anderen können die Mismatch- Ziel-Fänger-DNA-Hybride durch Temperaturerhöhung und somit Aufschmelzen gelöst und von den Hybridisierungs-bzw. Detek- tionspositionen wegtransportiert werden. Dadurch werden zum einen die vorher angestiegenen elektrochemischen Signale wie-

der zurückgesetzt (nicht notwendigerweise auf Null, sondern lediglich deutlich reduziert) und zum anderen wird eine Re- Hybridisierung der fehlgepaarten Ziel-mit der Fänger-DNA aufgrund der Konzentrationsverminderung verhindert. Erst die zurückgesetzten Sensorsignale ermöglichen weitere Messungen.

Dazu wird nach einigen Sekunden, z. B. 20 s, die Pumpe aber- mals für z. B. 5-10 s gestoppt und der Stromanstieg erneut aufgezeichnet.

Obige Vorgänge werden solange wiederholt, bis alle DNA- Zielmoleküle gemäß ihrer Schmelzpunkte nacheinander von den Fängersonden abgetrennt wurden. Die somit erhaltenen Schmelz- kurven, d. h. die Stromanstiege aller Transducerpositionen als Funktion der Temperatur, werden ausgewertet. Dies erfolgt insbesondere rechnergesteuert nach vorgegebenem Software- Programm.

Das gesamte Verfahren ist nach ca. 10min abgeschlossen und stellt somit im Vergleich zum Stand der Technik ein besonders schnelles Verfahren dar, das aufgrund der Verwendung von en- zymatischer Verstärkung eine hohe Empfindlichkeit und deshalb auch hohe Verlässlichkeit aufweist.

Ein typischer Temperaturbereich zur Aufnahme von oben be- schriebenen Schmelzkurven ist ca. 40°C bis 70°C. Da Enzyme, insbesondere aus der Literatur bekannte Labelenzyme im allge- meinen nur bis ca. 40°C stabil sind, d. h. oberhalb dieser Temperatur denaturieren und somit ihre für die Messung not- wendige katalytische Wirkung verlieren, werden erfindungsge- mäß insbesondere thermostabile Enzyme, wie z. B. eine thermo- stabile Esterase eingesetzt.

Anhand Figur 1 wird die beschriebene Messmethodik verdeut- licht. In den Teilfiguren la, lb, lc ist jeweils als Abszisse die Zeit in gleicher Skalierung aufgetragen, wobei in Figur la als Ordinate die Temperatur zwischen 50°C und 60°C und in Figur 1b der Fluss in nicht skalierten Einheiten und in Figur

lc das Sensorsignal (Redoxcyclingstrom) aufgetragen ist. Man erkennt, dass die Temperatur in vorgebbaren Schritten bzw. linear erhöht wird, wobei damit korreliert (synchron) der Fluss geändert wird. Vorzugsweise wird jeweils nach Einstel- lung einer konstanten Temperatur der Fluss geändert, insbe- sondere auf Null eingestellt. Sofern die Schmelztemperatur des Fänger-Ziel-DNA-Hybrides erreicht ist, wird sich die Ziel-DNA inklusive der enzymatischen Markierung unter den Ge- setzen der statistischen Verteilung von der Fänger-DNA lösen und wird durch den Flüssigkeitsstrom von der jeweiligen Transducerposition entfernt und vorzugsweise in einen Abfall- behälter gespült. Die Ziel-Fänger-DNA-Hybride deren Schmelz- temperatur noch nicht erreicht ist bleiben auf ihren Hybridi- sierungsposition erhalten. In der Waschflüssigkeit befindet sich enzymspezifisches Substrat das von den noch gebundenen Enzymlabeln zum Produkt umgesetzt wird, das seinerseits auf- grund des geänderten (insbesondere auf Null gesetzten) Flus- ses sich an den Hybridisierungspositionen anreichert, zu den Sensorelektroden diffundiert und elektrochemisch detektiert werden kann. In der Figur lc ergibt sich somit ein signifi- kanter Anstieg des Strommesswertes, der jeweils die intakte Hybridisierung eines Fänger/Ziel-DNA-Paares kennzeichnet.

Insbesondere wird die Anfangssteigung des Stromanstiegs zur Auswertung herangezogen. Wenn die Temperatur erhöht wird und der Fluss auf den Ausgangswert zurückgeführt wird, gelangt neue Flüssigkeit zu den Hybridisierungspositionen, wobei wei- tere Moleküle der selben Messstelle bzw. erste Moleküle von anderen Messstellen mit höherer Schmelztemperatur aufge- schmolzen und weggespült werden.

Statt der Temperaturerhöhung in Rampenschritten entsprechend Kurve 21 kann ggf. ein Temperaturanstieg auch kontinuierlich oder nach vorgegebenem Profil entsprechend den Kurven 21 bzw. 21"erfolgen. Dabei braucht der Fluss entsprechend Kur- ve 22 nicht notwendigerweise gestoppt, sondern nur signifi- kant geändert werden. Es ergeben sich jeweils auf einander abgestimmten Profilkurven 21,22 als Variable. Wesentlich ist

die Einstellung jeweils eines stationären bzw. quasistationä- ren Zustandes. In Figur Ic ist das Sensor-Signal, das bei- spielsweise als Stromwert gemessen wird, mit 23 und spezifi- sche Steigungswerte des Sensorsignals mit 24 bezeichnet.

Die Figur 2 zeigt die Schmelzkurven 31,32 von mehreren Match- (31) sowie mehreren Single-Base-Mismatch (32)- Hybridi- sierungspositionen für ein Faktor-V-PCR-Produkt, die an den positionsspezifischen Transducern gemäß Figur lc gemessen wurden, wobei der Stromanstieg dI/dt in nA/min als Funktion der Temperaturaufgetragen ist.

Die Figur 3 zeigt die aus Figur 2 normierten Messwerte Stromanstieg (T)/Stromanstieg (T=40°C) als Kurven 31 und 32, so dass die einzelnen Kurven ver- gleichbar sind. Beim Faktor V im Faktor-V-PCR-Produkt handelt es sich um ein Gen, das für die Blutgerinnung von Bedeutung ist.

Im Einzelnen sind in den Figuren 2 und 3 die Anfangssteigungen der Strommesswerte (dI/dt), wie im Beispiel einer Transducer- bzw. Meßposition aus Figur lc in Abhängigkeit vom jeweils ein- gestellten Temperaturwert aufgetragen. Es ergeben sich signi- fikante, insbesondere sigmoidale, titrationskurvenähnliche Kurvenverläufe 31,32 für einzelne Fänger/Ziel-DNA-Paare. We- sentlich ist dabei, dass zueinander passende (match) Fän- ger/Ziel-DNA-Paare einen signifikant anderen Signalverlauf, bzw. eine andere Lage der Kurve entlang der Abszisse haben als nicht zueinander passende (mismatch) Fänger/Ziel-DNA-Paare.

Insbesondere tritt der Schmelzvorgang und damit verbunden der Abfall der Schmelzkurve bei zueinander passenden Paaren (Match) bei höheren Temperaturen als bei nicht zueinander pas- senden Fänger/Ziel-DNA-Paaren (Mismatch) auf.

In Figur 4 ist eine allgemeine Anordnung mit einem konkret verwendeten Messaufbau, bestehend aus einem Chip mit mehreren Hybridisierungspositionen 5, 5',..., 5"'dargestellt : In Fi- gur 4 ist ein sogenannter DNA-Chip mit 1 bezeichnet, wie er

vom Stand der Technik bekannt ist. Ein solcher DNA-Chip 1 hat auf seiner Oberfläche 2 eine Vielzahl von Messpositionen 5, 5,..., 5n, beispielsweise in Arrayform. An jeder Messposi- tion 5, 5',..., 5n sind Fänger-DNA-Moleküle immobilisiert angeordnet, beispielsweise die Fänger-DNA 100 am Immobilisie- rungspunkt 6. An die Fänger-DNA 100 kann sich eine Ziel-DNA 200 anlagern. Die Ziel-DNA 200 können mit einem Label verse- hen werden. Das Label kann ein Enzym als biokatalytische Markierung sein, wobei die Enzymmarkierung in diesem Fall vorzugsweise ein thermostabiles Enzym beinhaltet.

Die einzelnen Messstellen für die Immobilisierung der Fänger- DNA 100 sind in allen nachfolgenden Figuren mit 5, 5,...

5n bezeichnet. Im Chip 1, der aus Silicium oder einem ande- ren Halbleitermaterial gebildet ist, können vorzugsweise be- reits Verstärker-und Messstrukturen, die pauschal mit 3 be- zeichnet sind, eingebracht sein. Der Chip 1 kann aber auch aus einem isolierenden Material mit metallischen Elektroden ohne integrierte Signalverarbeitung bestehen.

Dem Mess-Chip 1 ist eine Einrichtung 10 zur exakten Tempera- tureinstellung bzw. Temperaturregelung zugeordnet. Dafür kom- men beispielsweise Peltierelemente oder dergleichen in Frage.

Eine Temperaturmessung erfolgt auf dem Chip und/oder gegebe- nenfalls auf der Einrichtung zur Temperaturregelung.

Die Oberfläche 2 als Messseite des Chips 1 ist einem Strö- mungskanal 20 zugewandt, durch den alle für den Analysenvor- gang notwendigen Substanzen, wie Ziel-DNA 200 und ggf.

Markierungs-Enzym, bzw. aus einem Reservoir 40 Waschflüssig- keit mit ggf. enzymspezifischem Substrat S mit vorgegebenem Fluss zugeführt werden. Es ist eine Flussregelung 30, die je- weils für ein vorgegebenes Zeitintervall einen exakten Fluss einhält und die einen definierten Fluss-Stopp gewährleistet, und weiterhin ein Aufnahme-bzw. Abfallbehälter 50 für nicht mehr benötigte Substanzen vorhanden.

Mit der anhand von Figur 4 beschriebenen Anordnung ist es insbesondere möglich, eine mit Enzymsubstrat S versehene Waschflüssigkeit unter präziser Temperaturkontrolle als dünne Flüssigkeitsschicht über den Chip zu führen. Dabei ist eine vorgebbare Flusskontrolle und eine genaue Messung sowie Aus- wertung möglich.

In den Figuren 5 und 6 sind zwei Verfahrens-Zustände in all- gemeiner Form dargestellt, wobei vom Chip 1, der zugehörigen Thermostatierung 10 und dem Durchflusskanal 20 ausgegangen wird. In vergrößerter Darstellung sind die Fänger-DNA 100 und die Ziel-DNA 200 mit den einzelnen Polymorphismen und den zu- gehörigen Punktmutationen dargestellt. Insbesondere ist er- sichtlich, dass beispielsweise bei einer Temperatur von 50°C alle Fänger 100 die Ziel-DNA 200 binden, wobei insbesondere die sogenannten Match-Bindungen A-T, G-C aber auch die Mis- match-Bindungen G//A, C//A und A//A vorhanden sind. Es ist offensichtlich, dass die Match-Bindungen stärker als die Mis- match-Bindungen sind.

Speziell in Figur 6 ist ein Zustand mit einer Thermostatie- rung von beispielsweise 60°C dargestellt, wobei bei dieser Temperatur die Mismatch-Bindungen aufgeschmolzen sind, so dass anschließend die Mismatch-Ziel-DNA weggewaschen werden.

Die weggewaschenen Ziel-DNA-Moleküle können bis zum Abfallbe- hälter 50 gespült werden. Es ist aber auch ausreichend, die weggewaschenen Ziel-DNA-Moleküle nur eine geringe Distanz von den Mess-Position zu entfernen, sodass sie von keiner Messpo- sition mehr detektiert werden können.

Das Aufschmelzen der Mismatch-Bindungen kann positionsspezi- fisch in Abhängigkeit von der Temperatur detektiert und aus- gewertet werden. Dafür sind in den Figuren 7/8 einerseits und in den Figuren 9/10 andererseits zwei alternative Messmög- lichkeiten dargestellt.

Die Figuren 7 und 8 gehen aus von den Figuren 4 bzw. 5/6, wo- bei die Ziel-DNA 200 mit einem Fluoreszenz-Label F versehen sind. Bei solcher fluoreszenzmarkierter Ziel-DNA 200 ist eine optische Auslesung möglich. Die optischen Signale 75 werden mit einem in den Figuren 7 und 8 nicht im Einzelnen darge- stellten Spektrometer positionsgenau erfasst und ausgewertet.

Aus dem Vergleich der Figuren 7 und 8 ergibt sich deutlich, dass bei Überschreiten der Schmelztemperatur, beispielsweise bei der Temperatur von 60°C, die Mismatch-Bindungen geschmol- zen sind und die diesbezüglichen Ziel-DNA 200 einschließlich der Fluoreszenz-Label F weggespült sind. Insofern ergibt sich bei den Mismatch-Positionen ein reduziertes Signal.

Bei der bevorzugten, alternativen enzymatisch/. elektrochemi- schen Messung wird eine enzymatisch katalysierte Reaktion zur Bildung eines Produktes P ausgenutzt, für die folgende Glei- chung gilt : wobei S ein Enzymsubstrat, E ein Enzymlabel und P das Reakti- onsprodukt bedeuten.

In der Figur 9 sind die Ziel-DNA-Moleküle 200 mit dem Enzym- Label E versehen, wobei durch die Pfeile die enzymatisch ka- talysierte Reaktion und die Diffusion der Reaktionsprodukte P an die elektrischen Messpositionen angedeutet ist. An den Messpositionen 5, 5 ,..., 5n des Chips 1 befinden sich e- lektrochemische Signalaufnehmer bzw. Transducer 95, 95, wo- bei in Verbindung mit den bereits erwähnten Signalverabei- tungsstrukturen 3 im Silicium des Chips 1 unmittelbar ein solches elektrisches Signal wie z. B. ein Strom erfasst werden kann, welches ein Maß für die Konzentration des Reaktionspro- duktes P darstellt.

Entsprechend den Figuren 7 und 8 sind in Figur 9 und Figur 10 wiederum die beiden Zustände bei einer Temperatur von 50°C und einer Temperatur von 60°C gezeigt. Es ergeben sich somit im ersten Zustand durch Umsetzung von S in P an allen Messpo- sitionen vergleichsweise große elektrische Signale und im zweiten Zustand reduzierte bzw. keine Signale and den Mis- match-Positionen, jedoch ein vergleichsweise großes elektro- chemisches Signal an der Match-Position. Die weggewaschenen Ziel-DNA-Moleküle, sowie weggewaschenes Reaktionsprodukt P können wiederum bis zum Abfallbehälter 50 gespült werden. Es kann aber auch ausreichend sein, die weggewaschenen Ziel-DNA- Moleküle und Reaktionsprodukte nur um eine geringe Distanz von den Mess-Positionen zu entfernen, so dass sie von keiner der vorhandenen Messpositionen mehr detektiert werden können.

Ein besonderer Vorteil des enzymatisch/elektrochemischen Ver- fahrens besteht in der Tatsache, dass es im Gegensatz zu z. B. optischen Verfahren weitgehend unabhängig von einem Hinter- grundsignal ist, da der Stromanstieg dI/dt zur Auswertung he- rangezogen wird und nicht das absolute Stromsignal selbst.

Dadurch ist es nicht nötig, dass die enymmarkierte Ziel-DNA, sowie durch sie generiertes Reaktionsprodukt P bis in den Ab- fallbehälter zu spülen. Es muss lediglich die messpositions- spezifische Aufkonzentration des Reaktionsproduktes P durch kurzzeitiges Spülen abgebaut werden. Dadurch ist es auch aus- reichend, bei den folgenden Spülvorgängen die Waschflüssig- keit lediglich hin-und herzupumpen und es wird somit eine Einsparung von Waschflüssigkeit ermöglicht, was insbesondere bei integrierten und miniaturisierten Ausführungsformen von Vorteil ist.

Die Stromsignale entsprechen den Peaks in Figur lc, wobei in den Figuren 2 und 3 deren Anfangssteigungen dI/dt entspre- chend den Geraden 24, 24, 24,... aus Figur lc ausgewertet werden.

Neben den beiden Beispielen mit einer Detektion über optische oder enzymatische Label ist auch eine labelfreie Detektion der gebundenen Ziel-DNA 200 möglich. Bei der optischen label- freien Detektion werden die intrinsischen Veränderungen der W-Absorption beim Aufschmelzen der DNA-Doppelstränge er- fasst. Bei der elektrischen labelfreien Detektion wird dage- gen der Prozess einer intrinsischen Guanin-Oxidation ausge- nutzt. Eine weitere labelfreie Detektion kann mittels elekt- rochemischer Impedanzmethoden erfolgen. Weiterhin ist auch eine labelfreie Detektion durch Messungen der Massenänderung, d. h. gravimetrisch, z. B. über akustische Methoden wie Ober- flächenwellen-Sensoren (sog. SAWs) möglich.

Bei den Labelverfahren ist auch der Einsatz von magnetischen Labeln in Kombination mit Magnetfeld-Sensoren möglich.

Bei den beschriebenen Methoden ist wesentlich, dass die Mes- sung und zugehörige Auswertung automatisierbar ist. So können gelt werden. In Abhängigkeit davon erfolgt das jeweilige Flussprofil, bei dem zunächst bei Einstellung einer vorgege- benen Temperatur einerseits die aufgeschmolzenen Mismatch- Bindungen weggespült werden und andererseits die Detektion der positionsspezifischen gebundenen Ziel-DNA bei nicht be- wegter"Waschflüssigkeit erfolgt.