Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Konzentrationsmessung mittels der Spektroskopie der inneren Totalreflexion. Ein solches Verfahren ist insbesondere zur Bestimmung der Konzentration biologischer Substanzen von großem praktischen Interesse, da es Messungen mit kleinstmöglichen Probenmengen direkt im biologischen Milieu ermöglicht.

Die Spektroskopie der inneren Totalreflexion ist unter der Bezeichnung ATR (attenuated total reflection) im Infrarotspektralbereich seit 1960 bekannt. Jedoch verhinderte die starke Absorption von Wasser bisher eine allgemeine Anwendung dieser Untersuchungsmethode auch auf natürliche biologische und medizinische Proben, die im allgemeinen stark wasserhal¬ tig sind.

Durch Einsatz von intensiven Laserlichtquellen ist es gelungen, die Schwierigkeiten, die sich durch die Wasserabsorption ergeben, zu ver¬ ringern. Jedoch konnten bisher noch nicht die Schwierigkeiten überwunden werden, die sich dadurch ergeben, daß viele Moleküle, wie beispielsweise Proteine, zur Adsorption auf der Oberfläche des bei der Spektroskopie der inneren Totalreflexion verwendeten Reflexionselements neigen, so daß die Gefahr einer Kontamination beim Probenwechsel besteht. Außerdem konn¬ ten die Schwierigkeiten bisher nicht überwunden werden, die sich dadurch ergaben, daß viele der insbesonsere im Infrarotspektralbereich verwende¬ ten Reflexionselemente toxisch und/oder wasserlöslich sind.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Konzentra¬ tionsmessung mittels der Spektroskopie der inneren Totalreflexion zu schaffen, das auf einfache Weise reproduzierbare Messungen mit hoher Nachweisempfindl chkeit im infraroten, sichtbaren und ultravioletten Spektralbereich ermöglicht.

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Diese Aufgabe wird gemäß der Erfindung dadurch gelöst, daß zum Regene¬ rieren einer optisch sauberen Oberfläche des Reflexionselements eine transparente, hochbrechende Substanz als auswechselbare Zwischenschicht zwischen. Reflexionselement und Probe verwendet wird.

Die Eindringtiefe der bei Totalreflexion des Meßstrahlenganges an der Oberfläche des Reflexionselements in die angrenzende Probensubstanz ein¬ dringenden quergedämpften Lichtwelle liegt im sichtbaren Spektralbereic z.B. im Bereich von Bruchteilen eines u und ihre Feldstärke fällt mit zunehmender Eindringtiefe exponentiell ab. Das Verfahren nach der vor¬ liegenden Erfindung ermöglicht die Erzeugung und Wiederherstellung saube rer und reproduzierbarer Oberflächen zwischen Reflexionselement und Prob Erst diese Maßnahme ermöglicht eine einwandfreie und jederzeit reprodu¬ zierbare Messung der Konzentration von Substanzen durch Auswertung des Absorptionsspektrums im ultravioletten (UV), sichtbaren (VIS) und infra¬ roten (IR) Spektralbereich.

Die Substanz für die Zwischenschicht kann dem Meßproblem angepaßt so ge¬ wählt werden, daß keine störende Adsorption der zu messenden Probe auf- tritt, und daß sie eine nichttoxische Schicht zwischen der zu untersuche den Probe und dem RefLexionselement bildet.

Das Verfahren nach der Erfindung findet ganz besonders vorteilhafte An¬ wendung zur Bestimmung der Konzentration biologischer Substanzen, da die Zwischenschicht stets so gewählt werden kann, daß keine störende Adsorp¬ tion auftritt und daß toxische Wirkungen verhindert sind.

Damit die Zwischenschicht möglichst dünn und dabei doch in hohem Maße in ihrer Dicke gleichmäßig wird, ist es zweckmäßig eine flüssige Substan zu ihrer Erzeugung zu verwenden. Diese flüssige Zwischenschicht kann zu¬ dem nach beendeter Messung leicht, zum Beispiel durch Abwischen oder Ab¬ waschen entfernt werden. Vorteilhaft wird zur Erzeugung der Zwischen¬ schicht eine dünne Folie mit einer Öffnung so auf das Reflexionselement aufgelegt, daß die Reflexionsstellen im Bereich der Öffnung liegen. Die flüssige Substanz wird dann in diese Öffnung eingebracht und darin gleic mäßig vertei lt.

Als auswechselbare Zwischenschicht kann aber auch ein dünner Objektträger verwendet werden, der aus einem für die Meßstrahlung gleich stark wie oder stärker als das Reflexionselement brechenden Material besteht und mittels einer geeigneten Immersionsflüssigkeit in optischem Kontakt mit dem Reflexionselement angeordnet wird. Eine solche aus festem Material bestehende Zwischenschicht hat den Vorteil, daß sie eine noch stärkere Barriere als eine Flüssigkeit zwischen dem Reflexionselement und der Probe bildet, da Diffusionsvorgänge in dieser Zwischenschicht bei den in Frage kommenden Temperaturen praktisch nicht stattfinden.

Ein solcher Objektträger kann zudem auf seiner der Probe zugewandten Oberfläche mit einer, vorzugsweise aufgedampften oder chemisch aufgebrach¬ ten Beschichtung aus für die Meßstrahlung hochbrechendem Material vei— sehen sein. Dadurch wird es ermöglicht, unterschiedliche Grenzflächen zwischen der Probe und der Zwischenschicht einerseits sowie dem Refle¬ xionselement bzw. der Immersionsflüssigkeit und der Zwischenschicht ande¬ rerseits zu erhalten, also diese Grenzflächen bei einer insgesamt ein¬ stückigen Zwischenschicht unterschiedlichen Erfordernissen der Probe ei¬ nerseits und des Reflexionselements andererseits anzupassen.

Weitere Merkmale der Erfindung sind in den Unteransprüchen angegeben.

Die Erfindung wird nachstehend unter Bezugnahme auf die Figuren 1 bis 4 der beigefügten Zeichnungen näher erläutert; es zeigen:

Fig. 1 die Darstellung einer Meßanordnung zur Durchführung einer Spek¬ troskopie der inneren Totalreflexion nach dem Stande der Technik;

Fig. 2 ein erstes Ausführungsbeispiel einer Anordnung zur Durchführung des Verfahrens nach der Erfindung mit einer flüssigen Substanz als Zwischenschicht;

Fig. 3 ein anderes Ausführungsbeispiel mit einer festen Substanz als Zwischenschicht;

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Fig. 4 ein weiteres Ausführungsbeispiel mit einer oberflächen-beschich teten festen Substanz als Zwischenschicht.

In den Figuren der Zeichnung ist jeweils rechts oben eine gegenüber dem übrigen Zeichnungsmaßstab stark vergrößerte Darstellung des Grenzbereich zwischen dem Reflexionselement und der Probe an der Stelle, an welcher d Totalreflexion erfolgt, wiedergegeben.

Weiterhin sind in der Zeichnung die auf den Spektralbereich der Meßstrah lung bezogenen optischen Brechungszahlen n für die verschiedenen Medien, die der für die Spektroskopie verwendete Meßlichtstrahl vom Eintritt in das Reflexionselement bis zum Austritt aus diesem durchläuft, angegeben. Die Indices stimmen mit den Bezugsziffern überein, mit denen das jeweili Element, dem die mit diesem Index versehene Brechungszahl zugeordnet ist versehen wurde.

Zum besseren Verständnis der Erfindung sei zunächst anhand der Fig. 1 kurz eine übliche Meßanordnung zur Durchführung einer Spektroskopie der inneren Totalreflexion nach dem Stand der Technik erläutert. Diese Meßan Ordnung weist eine Lichtquelle 1 auf, die vorzugsweise als Laser ausge¬ bildet ist und die ein möglichst gut kollimiertes Lichtbündel 2 erzeugt. Dieses Lichtbündel 2 durchsetzt die Eintrittsfläche 3 eines Reflexionsel ments 4 und wird dann bei geeigneter Wahl des Einfallswinkels θ im Inner des Reflexionselements 4 an der Grenzfläche 5 zwischen diesem Reflexions element und einer darauf vorgesehenen Probe 6 totalreflektiert, wobei di Anzahl der Reflexionen von der Geometrie des Reflexionselements abhängt und dem jeweiligen Meßproblem angepaßt sein sollte. Die Auswahl einer ge eigneten Form des Reflexionselements 4 erfolgt nach an sich bekannten Kr terien, wie sie beispielsweise in dem Buch "Internal Reflection Spectros copy" von N. J. Harrick beschrieben sind, das im Verlag John Wi ley & Son Inc., New York 1967 erschienen ist. Die bei der Totalreflexion des Licht bündels 2 im optisch dünneren Medium, d.h. der Probe 6 auftretende quer¬ gedämpfte Lichtwelle wird von der Probensubstanz beeinflußt. Damit änder sich die spektrale Zusammensetzung des eingestrahlten Lichtbündels 2 ent

sprechend den Absorptionseigenschaften der Probe 6, so daß man beim Aus¬ tritt aus dem Reflexionselement 4 ein Lichtbündel 7 erhält, dessen spek¬ trale Zusammensetzung im Vergleich zu dem Lichtbündel 2 für die Probe 6 charakteristisch ist. Diese Änderung wird als Absorptionsspektrum mittels des Spektralapparats 8 und des Detektors 9 ermittelt, von dort einen Ver- stärker 10 zugeführt und beispielsweise mittels eines Schreibers 11 auf¬ gezeichnet.

Im Ausführungsbeispiel der Fig. 2 sind, ebenso wie in den Fig. 3 und 4, die Lichtquelle 1, die Spektralapparatur 8, der Detektor 9, der Verstärker 10 und das Aufzeichnungsgerät 11 aus Gründen einer vereinfachten Darstel¬ lung weggelassen.

Bei dem Ausführungsbeispiel der Fig. 2 ist eine flüssige Zwischenschicht 12 zwischen dem Reflexionselement 4 und der Probe 6 vorgesehen. Damit man eine gleichmäßige und dünne flüssige Zwischenschicht erhält, wird auf das Re¬ flexionselement 4 zunächst als Hilfsmittel eine Maske 13 aufgelegt, die aus einer dünnen Folie und einer darin vorgesehenen mittigen Öffnung 13' be¬ steht. In die Öffnung 13* wird eine geringe Menge an flüssiger, für die Meßstrahlung hochbrechender Substanz eingebracht, beispielsweise mittels einer Bürette, mit einem Glasstäbchen, durch Auftropfen o.dgl., und der

Überschuß an flüssiger Substanz, der gewissermaßen über den oberen Rand der Öffnung 13' hinausragt, wird mit einem Messer, einem Spatel o.dgl. abge¬ strichen, so daß man eine flüssige Zwischenschicht 12 erhält, welche die gleiche Dicke wie die Folie 13 hat. Auf diese Weise ist es durch Verwen- düng sehr dünner Folien 13 möglich, äußerst dünne Schichtdicken der flüssigen Zwischenschicht 12 bei gleichzeitig gleichmäßiger Dicke dieser Zwischenschicht zu erzielen, wie es wünschenswert ist. Zum Schluß wird die Probe 6 über die flüssige Zwischenschicht 12 geschichtet (im linken unteren Teil der Fig. 2 ist die Probe nicht dargestellt sondern nur eine Aufsicht auf das Reflexions- element 4 und die Folie 13 mit der Öffnung 13' gezeigt), und zwar so, daß die Probe 6 nicht über den äußeren Rand 14 der Folie 13 hinausgeht. Dieser äußere Rand 14 kann gegenüber der übrigen Fläche der Folie 13 erhöht ausge¬ bildet sein, um die Gefahr zu vermindern, daß ein Teil der Probe über diesen Rand hinausläuft und direkt auf die Oberfläche des RefLexionselements 4 ge- langen kann.

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Die Flüssigkeit 12 muß so beschaffen sein, daß sie sich mit der Proben¬ substanz 6 nicht mischt und natürlich auch keine störende Verbindung mit ihr eingeht. Zur Messung im UV- und VIS-Spektralbereich kommen als hoch¬ brechende Flüssigkeit 12 Immersionöle, wie z.B. Br, (CH) oder C, H ₇ Br oder auch Polymere, wie z.B. Polyvinylcarbazol und auch Harze in Frage.

Im Infrarotspektralbereich bis 7,5 u ist als flüssige Substanz für die Zwischenschicht 12 insbesondere Polytrifluoräthylenöl verwendbar, dessen

Durchlässigkeit im Bereich von 2,5 bis 7,5 u zwischen 90 und 98% Liegt

20 und das eine Brechungszahl n von 1,94 hat. Eine weitere flüssige Sub¬ stanz für die Zwischenschicht 12, die zur Anwendung im Infrarotspektral¬ bereich von 1 bis 3,3 JU sowie 3,9 bis 6,5 u und 7,5 bis 40 JU geeignet is ist Paraffinöl, dessen optische Durchlässigkeit in den erwähnten Wellen¬ längenbereichen im wesentlichen oberhalb von 90% liegt und dessen Brech-

?n ungszahl n _ß zwischen 1,480 bis 1,484 beträgt.

Nach der Durchführung der spektroskopischen Messung wird die Folie 13 ab genommen und die flüssige Zwischenschicht 12 vom RefLexionselement 4 ab¬ gewischt und/oder abgewaschen. Danach wird in der oben beschriebenen Wei mittels einer neuen Folie 13 eine neue flüssige Zwischenschicht 12 aufge bracht und auf diese Weise die nächste Probe 6 für eine spektroskopische Untersuchung vorbereitet.

In Fig. 3 ist ein Ausführungsbeispiel gezeigt, bei dem als Zwischenschic ein aus Festkörpermaterial bestehender Objektträger 15 zwischen der Prob 6 und dem Reflexionselement 4 angeordnet ist. Zur Herstellung eines gute optischen Kontakts zwischen dem Reflexionselement 4 und dem Objektträger 15 ist eine Immersionsflüssigkeit 16 vorgesehen.

Wenn es nur darauf ankommt, eine Oberflächenkontamination zu vermeiden, i übrigen aber im speziellen Fall keine Unverträglichkeit zwischen dem Ma¬ terial des RefLexionselements 4 und der Substanz der Probe 6 besteht, ka der Objektträger 15 aus dem gleichen Material wie das Reflexionselement bestehen. Der Objektträger 15 kann jedoch auch aus einem anderen geeigent Material bestehen, das eine hohe Brechungszahl im Spektralbereich der Me strahlung besitzt.

Für die Messung im UV- und VIS-Spektralbereich kann der Objektträger 15 beispielsweise aus Glas oder einem Polymer bestehen. Zur Messung im IR- Spektralbereich kann der Objektträger 15 aus Germanium, Silizium oder Selen bestehen oder auch besonders zweckmäßig aus dem unter der Bezeich- nung "Chalcogenide-Glass" im Handel erhältlichen Material, das sich durch eine hohe Transmission und einen Brechungsindex nft ,5 im Bereich 4 bis 13 JJ auszeichnet und das gegen Wasser und schwache Säuren resistent ist.

Bei dem in Fig. 4 dargestellten Ausführungsbeispiel ist der feste Objekt- träger 15 auf seiner der Probe 6 zugewandten Oberfläche mit einer Be¬ schichtung 17 versehen, die beispielsweise durch Aufdampfen oder auf che¬ mischem Wege auf den Objektträger 15 aufgebracht wird. Diese Beschichtung ermöglicht es unter anderem, an der Grenzfläche zwischen der Probe 6 und dem Objektträger 15 eine noch höhere Brechungszahl zu erreichen oder bei verhältnismäßig freier Auswahl des Materials des Objektträgers 15 ein für die jeweilige Art der gerade benutzten Probensubstanz 6 besonders geeig¬ netes Material an der Grenzfläche zwischen der Probe 6 und dem Objekt¬ träger 15 vorzusehen.

Zu den schon genannten können im IR-Spektralbereich als Objektträger 15 oder Beschichtung 17 beispielsweise auch folgende Substanzen vorgesehen werden: aN0 ₃ , Calcit, Quarz, LiF, MgF^, CaF , SrF , PbF ₂ , T-12, NaF, BaF ₂ , KF, CsF, NaC l, NaBr, KCl, NaJ, KBr, CsCL, AgCl, TICl, KRS-6, AgBr, KJ, TIBr, CsBr, KRS-5, CsJ. Auch ist es möglich, als Objektträger 15 oder als Beschichtung 17 ein für Infrarotstrahlung transparentes und hochbre¬ chendes Polymer zu verwenden, wobei insbesondere für den Fingerprintbereich als Polymer ein Copolymer aus Polyäthylen und Polypropylen geeignet ist, und zwar vorzugsweise ein solches mit einem Verhältnis von 97:3 zwischen Polyäthylen und Polypropylen.

Es ist wichtig, daß in allen Fällen der vorstehend beschriebenen Ausfüh- rungsbeispiele zwischen den optischen Brechungszahlen n, des Reflexions¬ elements 4, n, der Probe 6, r..~ der flüssigen Zwischenschicht 12, n..,- des Objektträgers 15, -., der Immersionsflüssigkeit 16 und n→- der Beschichtung 17 des Objektträgers 15 die Beziehungen eingehalten werden, die in den Fig. 2 bis 4 angegeben sind.

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Das beschriebene Verfahren ermöglicht außer der Erzielung einer regene¬ rierbaren Oberfläche, d.h. der Verhinderung einer unerwünschten Adsorp¬ tion auf der Oberfläche des Ref Lexionselements und außer der Verhinderu eines unerwünschten Einflusses des Ref lexionselements auf die Probe in¬ folge seiner Toxizität und/oder Wasserlöslichkeit bei geeigneter Auswah der Zwischenschicht die Erzielung einer erhöhten Nachweisempfindlichkei indem man das Zwischenschichtmaterial so auswählt, daß bestimmte Substa zen aus der Probe an dieser Zwischenschicht adsorbiert werden.