【발명의 명칭】

당지질 합성 회로 조절을 통한 고 시알산 함량와 재조합 당단백질 제조 방법

【기술분야】

본 발명은 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT)를 억제하여 당지질 생합성 경로를 조절함으로써 시알산 (sialic acid) 함량을 증가시키는 당단백질 (glycoproteins) 제조방법에 관한 것이다.

【배경기술】

당화 (glycosylation)는 포유동물 세포에서 주요한 번역 후 수식에 해당되고， 두 분류， N— 및 ^연결 당화로 나뉜다. ^연결 당화는 다수의 당단백질에서 Asn (Asn-X-Ser/Thr 모티프)에 부착되어 .있다. 당화는 효소 활성， 단백질 안정성， 및 면역원성에 영향을 준다. N-아세틸뉴라민산 O acetylneuraminic acid), 시알산 (sialic acid)은 전하된 슈가 (sugar)이고 2-3/6 글리코시딕 링키지 (glycosidic linkage)에 의해 말단 갈락토오스에 부착되어 있다. 이는 간세포에서 분해를 위한 아시알로당단백질 (asialoglycoprotein) 수용체 (ASGPR)로부터 끝에서 두 번째의 갈락토오스를 인식하는 것을 방지하기 위해서 배출되는 당단백질의 생체 내 순환 반감기에 영향을 주는 것으로 알려져 있다. 시알산 (sialic acid)이 생체 내 당단백질의 안정도를 조절하기 때문에， 재조합 치료 단백질의 증강된 시알릴화는 지난 10년간 쟁점이 되어왔다.

시알산 (sialic acid)은 당전구체 구성의 필수 성분으로 지금까지 자연계에서 약 50 여종의 시알산이 부가된 당쇄 전구체들이 발견되었다. 시알산은 포유류에 있어서 세포간 상호작용， 세포 내의 시그널을 결정하는 전구체의 역할， 당단백질의 안정화 등 세포 내의 생물학적 현상에 중요한 역할을 한다. 특히， 생체 내의 시알산은 병원체 감염시 최초 인지되는 당쇄 중의 하나로 알려져 있으며 (Sasi sekharan and Myette , Am. Sci . 91 :432-441(2003)； Vimr and Li chtensteiger , Trends Microbiol . 10:254-257(2002) ) , 세포표면에 존재하는 시알산은 병원 미생물 자체에서도 면역 회피 반웅이나 세포 보호를 위한 캡슐 형태의 다당성 올리고당을 구성하는 성분으로 알려져 있다 (Vimr et al . , Microbiol . Mol . Biol . Rev. 68: 132-153(2004) ) . 병원성 미생물 중 자체적으로 시알산을 합성하는 경우 세포 내에서 시알산 대사회로를 통해 합성되거나， 세포 외부의 시알산을 세포표면에 존재하는 시알산 트랜스포터 (transporter )를 통해 세포 내로 이동시킨 후 사알산 대사 경로를 통해 시알산을 합성한다 (Vimr and Lichtensteiger , Trends Microbiol . 10： 254-257(2002) ) . 그러나， 그렇지 않은 경우에는 세포 표면의 시알산 전이효소인 트랜스-시알리다아제 (trans-sial idase)에 의해 숙주나 세포 외부의 시알산 당쇄 전구체로부터 시알산을 절단해서 자신의 세포표면의 당쇄에 시알산을 부가한다고 알려져 있다 (Scudder et al . , 등록특허 10-1083065 J .Biol .Chem. 268： 9886-9891( 1993) ) . 트랜스-시알리다아제 ( t r ans-s ial i dase)는 트랜스-글루코시다아제 (trans-glycosidase) 활성을 가지며， 시알릴락토오즈 (sialyl lactose)로부터 갈락토즈를 포함한 다양한 단당류， 이당류 및 올리고당에 시알산을 전이해주는 효소이다.

CMP-Neu5Ac는 시알산 생물합성에 있어서 기질로서 작용한다. 당화 담체상에서 시알릴화는 CMP— Neu5Ac 운반체 (CSAT)에 의해 골지체 (Golgi )의 관강내 측면 ( luminal side)으로 운반되고， 시알릴전달효소 (ST)에 의해 말단 갈락토오스에 부착된다. 재조합 치료 단백질의 시알릴화의 증강은 잠재적 연결 당화부위가 증가함에 따라 촉진된다. 또한， 재조합 치료 단백질의 시알릴화는 갈락토오스전달효소 (galactosyltransferase(GT) ) 또는 시알릴전달효소와 같은 시알산 생물합성을 위한 핵심효소의 과발현에 의해 증가 된다. CMP-Neu5Ac가 시알릴화에 있어서 제한적 요인으로 작용하기 때문에 골지체 관강내의 CMP-Neu5Ac 증가는 ManNAc의 보충 또는 CST의 과발현으로 만들어진다.

당지질 (glycosphingolipid(GSL))은 세포 표면에서 발현되는 당화 담체의 다른 형태이며， 세포성장， 부착력， 및 신호전달에 중요한 역할을 한다. 당지질은 글리칸 (glycan) 구조에 따라 강글리오계열 (ganglioseries)(GlcNAcp4Galp4GkpCer), 글로보계열 ( g 1 oboser i es ) ( Ga 1 cx4Ga 1 β4( 1 c(3Cer )， 락토계열 (lactoseries)(GlcNAc(¾ ³ Gal(3 ⁴ Glc(3Cer) 및 신락토계열 (neo-lactoseries)(Galp4GlcNAcP3Galp4GIcpCer)로 분류된다. 당지질 합성은 비소포성 운반체를 통하여 세라마이드 운반 단백질 (CERT)에 의해 세라마이드를 c/ 골지체로 운반하는 것으로써 ；시작된다. 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT)는 GSL의 전구체인 GlcCer(glucosyl cerimide)를 생성한다. 화학 억제제， EtD0-P4 또는 당지질 합성을 억제하는 RNAi에 의한 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제의 억제는 세포의 성장 및 이동을 초래한다. 중성 당지질이 FAPP2에 의해 ra;?^골지체로 이동되는 반면에， 시알릴화된 당지질은 골지체시스터네 (cisternae)에서 합성된다. CMP-Neu5Ac는 당단백질의 시알릴화뿐만 아니라 강글리오사이드와 같은 당지질에 사용된다. 이에， 본 발명자들은 고함량의 시알산올 생성하는 재조합 당단백질을 개발하기 위하여 노력한 결과, 당지질 생합성 경로에 관여하는 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT) 억제제 또는 이에 특이적 ^로 결합하는 siRNA 및 miRNA를 통하여 상기 CGT 억제를 유도하는 세포주를 구축하고， 이로부터 고함량의 시알산을 포함하는 에리스로포이에틴 (erythropoietin; EP0)이 생성되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다. 【발명의 상세한 설명】

【기술적 과제】 본 발명의 목적은 재조합 당단백질 (glycoprotein)을 생성하는 세포주에서 당지질 (glycospingol ipid; GSL) 생합성 경로를 억제시키는 단계를 포함하는， 고 시알산 (sial ic acid) 함량의 재조합 당단백질을 생산하는 재조합 세포주의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한， 본 발명의 목적은 재조합 당단백질 생성 세포주에서 당지질 생합성 경로를 억제시킨， 고 시알산 함량의 재조합 당단백질 생산하는 재조합 세포주를 제공하는 것이다.

아울러 , 본 발명의 목적은

1) 본 발명의 재조합 세포주를 배양하는 단계 ; 및

2) 상기 단계 1)의 배양액에서 고 시알산 함량의 당단백질을 분리하는 단계를 포함하는 고 시알산 함량의 재조합 당단백질의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한， 본 발명의 목적은 당단백 ¾을 생성하는 세포주에서 당지질 생합성 경로가 억제된， 고시알산 함량의 재조합 당단백질 생산용 재조합 세포주의 용도를 제공하는 것이다.

【기술적 해결방법]

상기 목적을 달성하기 위하여， 본 발명은 재조합 당단백질 (glycoprotein)을 생성하는 세포주에서 당지질 (glycospingol ipid; GSL) 생합성 경로를 억제시키는 단계를 포함하는， 고 시알산 (sial ic acid) 함량의 재조합 당단백질을 생산하는 재조합 세포주의 제조방법을 제공한다.

또한， 본 발명은 재조합 당단백질 생성 세포주에서 당지질 생합성 경로를 억제시킨， 고 시알산 함량의 재조합 당단백잘 생산하는 재조합 세포주를 제공한다.

아울러， 본 발명은

1) 상가재조합 세포주를 배양하는 단계 ; 및

2) 상기 단계 1)의 배양액에서 고 시알산 함량의 당단백질을 분리하는 단계를 포함하는 고 시알산 함량의 재조합 당단백질의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 당단백질을 생성하는 세포주에서 당지질 생합성 경로가 억제된， 고시알산 함량의 재조합 당단백질 생산용 재조합 세포주의 용도를 제공한다. 【유리한 효과】 ^'

본 발명의 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT)에 특이적으로 결합하는 siRNA 및 miRNA를 통하여 상기 CGT 억제를 유도하는 세포주， 예를 ·면， EC2-lH9-miRl 및 EC2-lH9_miR2는 세포 내 i함량의 시알산 ( sial ic acid)을 포함하는 에리스로포이에틴 (EP0)을 생성함으로써 재조합 치료 단백질의 안정성을 증가시켜 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

【도면의 간단한 설명】

도 1은 재조합 인간 EP0가 생성되는 세포주인 EC2-1H9 세포에서 EtIXH 처리하였을 때 당지질 (GSL) 및 시알산 (sial ic acid) 함량의 변화를 나타낸 도이다.

도 2는 EC2-1H9 세포에서 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT)를 억제하는 siRNA를 처리하였을 때 당지질 및 시알산의 함량의 변화를 나타낸 도이다.

도 3은 pcCGT-miRNA를 형질전환시킨 안정세포 (stable cel l )에서 당지질 및 시알산의 함량의 변화를 나타낸 도이다.

도 4는 pcCGT-miRNA를 형질전환시킨 안정세포에서 CMP-NeuNAc의 농도 및 에리스로포이에틴 (EP0)의 시알산 함량을 나타낸 도이다.

도 5는 pcCGT-miRNA를 형질전환시킨 안정세포에서 세포 성장 및 EP0의 생성을 나타낸 도이다.

【발명의 실시를 위한 최선의 형태】

이하， 본 발명을 상세히 설명한다. 본 발명은 재조합 당단백질 (glycoprotein)을 생성하는 세포주에서 당지질 (glycospingolipid; GSL) 생합성 경로를 억제시키는 단계를 포함하는, 고 시알산 (sialic acid) 함량의 재조합 당단백질을 생산하는 재조합 세포주의 제조방법을 제공한다.

상기 당단백질은 시알산이 결합할 수 있는， 에리스로포이에틴 (erythropoietin)， 트롬보포이에틴 (thrombopoiet in)， 알파 -안티트립신 (alpha-ant i trypsin), 콜린에스테라제 (cholinesterase), 융모성 고나도트로핀 (chorionic gonadotropin), CTLA4Ig, 인자 VDKFactor VI), 감마 -글루타밀트랜스퍼라아제 (gammaglutamyltransf erase), 과립구콜로니 자극인자 (granulocyte colony-stimulating Factor , G-CSF) 및 황체형성호르몬 (luteinizing hormone, LH)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고， 에리스로포이에틴 또는 트롬보포이에틴인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 당지질 생합성 경로의 억제는 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (ceramide glucosyltransferase; CGT)를 억제시키는 것이 바람직하고, 서열번호 3으로 기재되는 아미노산 서열로 구성된다.

상기 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제의 억제는 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제를 처리하거나， 또는 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 mRNA에 결합하는 안티센스 뉴클레오티드， siRNA, shRNA 및 miRNA로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나를 형질전환시키는 것이 바람직하다.

상기 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 억제제는

P4(D-t hr eo-l-phen 1 -2-pa Imitoylami ηο-3-pyr rol idi no- 1-pr opano 1 )，

E t D0-P4 (D-thr eo-l-(3' , 4'-ethy 1 ened i oxy ) pheny 1-2-palmitoylami ηο-3-pyr rol idi no- 1-pr opano 1) 및 pOH-P4 (D-thr e으 4 '一 hydr oxy- 1 -pheny 1-2-palmitoylami ^η ο-3-pyr rol idi no- 1-propa no 1)로부터 구성되는 어느 하나인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. . 상기 siRNA는 서열번호 4 내지 서열번호 9 중 어느 하나의 염기서열로 구성된 것이 바람직하나 이에 한정하지 않고， 상기 miRNA는 서열번호 10 또는 11 중 어느 하나의 염기서열로 구성된 것이 바람직하나， 이에 한정하지 않는다.

상기 siRNA는 상기 표적서열에 상동인 독립적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 안티센스 RNA 가닥을 포함하거나 상기 센스 RNA 가닥 및 안티센스 RNA 가닥이 루프에 의해 연결된 스템 -루프 구조의 단일 RNA 가닥일 수 있다. 상기 siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고， 스템 -루프 (st em- loop)의 구조를 이루는 헤어핀 구조를 가질 수 있는데， 이를 특히 shRNA( short hairpin RNA)라 지칭한다. 한편 상기 이중사슬 또는 스템 부위는 미스매치 (대웅하는 염기가 상보적이지 않음)， 벌지 (일방의 사슬에 대웅하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수도 있다. 전체 길이는 10 내지 80 _. 염기 바람직하게는 15 내지 60 염기， 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. 또한， 상기 루프 영역은 서열에 특별한 의미가 없으며， 단지 센스서열과 안티센스서열을 적당한 간격으로 연결하기 위하여 3-10 정도의 염기를 가지고 있으면 족하다. 종래에 siRNA의 루프 영역으로 많이 사용되어온 예들은 다음과 같다: AUG(Sui et al . , Proc . Nat l . Acad. Sci . USA 99(8) :5515-5520, 2002) , CCC, CCACC 또는 CCACACCCPaul et al . , Nature Biotechnology 20 :505— 508， 2002)， UUCG(Lee et al . , Nature Biotechnology 20: 500—505) , CTCGAG, AAGCUUC Edi tors of Nature Cel l Biology Whither RNAi , Nat Cel l Biol . 5:489-490, 2003) , UUCAAGAGA(Yu et al . , Proc . Nat l . Acad. Sci . USA 99(9) : 6047-6052, 2002) 및 TTGATATCCGCwww . genscr ipt . com≤] default spacer) . siRNA 말단 구조는 평활 (blunt )말단 흑은 점착 (cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 ' 말단 돌출한 구조 (protruding structure)와 5' 말단 쪽이 돌출한 구조가 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어， 염기 수로는 1 내지 8 염기， 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한， siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위쎄서 예를 들어， 한쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA (예를 들어， tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고， 이증사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

더불어, 본 발명에 따른 siRNA에서, 센스 RNA 가닥 및 /또는 안티센스 RNA가닥은 이의 당 부분， 뉴클레오베이스 부분 또는 ¾터뉴클레오타이드 구조 내에 최소한 1개의 화학적 변형을 포함하는 것이 가능하다. 이러한 변형은 생체 내에서 뉴클레아제에 의해 siRNA의 파괴를 저해하는 것을 가능하게 할 수 있다. 본 발명에 따른 siRNA의 안정성과 생적합성을 생체 내에서 향상시킬 수 있는 모든 화학적 변형이 본 발명의 범위에 포함된다. 당 부분에 대한 바람직한 변형 중에서， 언급될 수 있는 것은 2'-데옥시， 2'-플루오로， 2'-아미노， 2'-티오， 또는 2'-0-알킬과 같은 리보오스의 포지션 2'， 그리고 바람직하게는 리보뉴클레오타이드 상의 정상 2'-0H 그룹을 대체하는 2'-0-메틸 또는 LNA의 포지션 2' 및 4' 사이에 있는 메틸렌 브릿지의 존재에서 일어나는 변형이다. 뉴클레오베이스의 경우， 5-브로모-유리딘, 5-이오도-유리딘, N3-메틸-유리딘， 2， 6-디아미노퓨린 (DAP, 5-메틸 -2' -데옥시시티딘，

5— (1-프로피닐) -2'-데옥시-유리딘 (pdU),

5-(1-프로피닐) -2'-테옥시시티딘 (pdC)과 같은 변형된 염기 또는 콜레스테를과 결합한 염기를 이용하는 것이 가능하다. 마지막으로， 인터뉴클레오타이드 골격의 바람직한 변형은 포스포로티오에이트 (phosphorothioate), 메틸포스포네이트， 포스포로디아미데이트 그룹에 의한 골격에 있는 포스포디에스터 그룹을 치환하는 것을 포함하거나， 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸) -글리신 (PNA, 펩타이드 핵산)으로 구성되는 골격을 이용한다. 다양한 변형 (염기， 당， 골격)은 몰포리노 (morpholino) 타입의 변형된 핵산 (몰포린 링에 고정되고 포스포로디아미데이트 그룹에 의해 연결된 염기) 또는 PNA (펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-아미노에틸) -글리신 단위에 고정된 염기)에 결합될 수 있다.

상기 miRNA를 발현시키기 위한 발현백터는 Invitrogen 사의 pcDNA™ 6.2-GW/EmGFP-mir 백터， CellBiolabs 사의 miRNASelect™ pEGP-miR 클로닝 & 발현 백터 또는 miRNASelect™ pEP-miR 클로닝 & 발현 백터, Ckmtech사의 pmR-ZsGreenl 백터 또는 pmR-mCherry 백터， OriGene 사의 pCMV-MIR 백터 및 BiOSETTIA 사의 pLV-miRNA 백터로부터 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 일수 있고， miRNA를 발현시키기 위한 백터라면 어느 것이라도 가능하다.

상기 형질전환은 리포펙타민 (Lipofectamine), Dojindo사의 Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene 및 DreamFect으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 형질도입용 시약; 칼슘 -인산 (calcium-phosphate), 양전하성 고분자， 리포좀， 나노입자， 뉴클레오펙션(∞(；160£^^위, 전기천공법 (electroporation), 열충격 (heat shock) , 마그네토펙션 (magnetofection)을 이용하는 방법을 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 수행될 수 있다.

상기 형질전환된 세포는 당지질 (GSL)이 감소되는 것을 특징으로 한다. 상기 방법에 있어서， 상기 세포주는 포유동물 세포 (mammalian cells), 효모 세포 (yeast cells) 또는 곤충 세포 (insect eel Is)를 사용할 수 있고， 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cells, CHO), HT-1080, 인간 림프아구 (human lymphoblastoid) , SP2/0(마우스 골수종), NS0 (마우스 골수종)， 베이비 햄스터 신장세포 (baby hamster kidney cells, BHK), 인간 배아 신장세포 (human embryonic kidney cells, HEK), PERC.6(인간 망막세포) 및 EC2-1H9 세포로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며， 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cells, CHO)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 에리스로포이에틴을 대량 생산하는 EC2-1H9 세포는 플라스미드 백터 pCMV-dhfr 를 제한효소 Hindm 와 Apal 으로 절단하고 크레노

(klenow)로 수식하여 EP0의 게놈 유전자 EpoG 를 첨가하여 발현 백터 pEpoG-dhfr를 얻었다. 또한 플라스미드 백터 pCMV-dhfr에 EP0의 cDNA 유전자 EpoC를 연결하여 발현 백터 pEpoC-dhfr 를 얻었다. 발현 벡터 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr로 dhfr 변이 CH0 세포주 (ATCC CRL 9096) 세포에 형질전환시켜 인간 EP0 생성능력을 가진 형질전환체 EC2를 얻었다. 이 세포들을 MTX를 함유하는 IA-MEM 배지에서 배양하였다. 송아지 혈청 ;10%가 첨가된 DMEM/F12 배지 (기브코사 제품)에 하이폭산틴 (hypoxanthin) 10 , 티미딘 (thymidine) 10 , 글리신 (glycine) 50 //g/ml , 글루타민 (glutamine) 587 /g/ml , 포도당 (glucose) 4.5 mg/ml , 페니실린-스트랩토마이신

(penicillin-streptomycin) lOOIU/ml (시그마사 제품)를 첨가된 배양약에 CO2가

5% 유지되도록 37°C에서 계대배양한 dhfr 변이 CH0 세포를 원심분리기를 이용하여 회수하였다ᅳ 지름 6cm의 접시에 5χ10 ⁵ 세포 /ml 되도록 접종하고， 다음날 0ΡΉ MEM KGibco 제품)으로 2회 세척하였다.

상기 dhfr 변이 CH0 세포주에 플라스미드 5 /g을 0ΡΉ MEM I 1.5ml 에 희석하고， 동량으로 희석한 리포펙틴 (Lipofectin, Gibco) 20 ； «g을 흔합하여

10분간 방치한 뒤， 준비한 CH0 세포 위에 골고루 넣어주었다. 37°C, 5% C0 ₂ 항온기에서 6시간 배양하고， 송아지 혈청 20%를 포함하는 DMEM/F12 배지를 3ml 첨가하고， 24시간 더 배양하였다. 0.25% 트립신을 처리하고， 원심분리하여 얻어진 세포를 웰 당 2 ^χ 10 ⁴ 세포가 되도록 96웰 플레이트에 분주하였다. 투석된 혈청 (Gibco 26300-020) 10%, G418 550 g/ml을 함유하는 IA-MEM 배지 (Gibco)를 첨가하여 배양하고 4일 간격으로 배지를 갈아주면서 2주간 배양하였다. 생존한 각 클론들을 수십개 얻었고， 각 클론의 EP0 생산능력을 측정하기 위하여 생쥐 항 -인간 EP0 항체와 과산화효소와 결합된 염소 항 -생쥐 IgG 항체 (Sigma사 제품)를 이용하여 간접 이라이자 방법 (Engvall & Perlman, J. Immunol. 109, 129， 1972)을 수행하여， 상기 발현 백터 pEpoG-dhfr 또는 pEpoC-dhfr를 함유한 형질전환체들 중에서 EP0를 가장 많이 생산하는 세포주 EC2를 선별하였다. 또한， 본 발명은 재조합 당단백질 생성 세포주에서 당지질 생합성 경로를 억제시킨 고 시알산 함량의 재조합 당단백질 생산하는 재조합 세포주를 제공한다.

또한， 본 발명은 당단백질을 생성하는 세포주에서 당지질 생합성 경로가 억제된， 고시알산 함량의 재조합 당단백질 생산용 재조합 세포주의 용도를 제공한다.

상기 당단백질은 시알산이 결합할 수 있는， 에리스로포이에틴 (erythropoietin), 트름보포이에틴 (thrombopoietin)， 알파 -안티트립신 (alpha-ant i trypsin), 콜린에스테라제 (chol inesterase)， 융모성 고나도트로핀 (chorionic gonadotropin), CTLA4Ig, 인자 VHKFactor VI), 감마 -글루타밀트랜스퍼라아제 (gammaglutamyl transferase), 과립구콜로니 자극인자 (granulocyte colony-stimulating Factor, G—CSF) 및 황체형성호르몬 (luteinizing hormone, LH)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고， 에리스로포이에틴 또는 트롬보포이에틴인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 당지질 생합성 경로의 억제는 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (ceramide glucosyltransferase; CGT)를 억제시키는 것을 특징으로 한다.

상기 형질전환된 세포는 당지질 (GSL)이 감소되는 것을 특징으로 한다. 상기 세포주는 포유동물 세포 (ma瞧 alian cells), 효모 세포 (yeast cells) 또는 곤층 세포 (insect eel Is)를 사용할 수 았고， 상기 포유동물 세포는 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cells, CHO) , HT-1080, 인간 림프아구 (human lymphoblastoid), SP2/0 마우스 골수종)， NS0 (마우스 골수종)， 베이비 햄스터 신장세포 (baby hamster kidney cells, BHK) , 인간 배아 신장세포 (human embryonic kidney cel ls , HEK) , PERC.6(인간 망막세포) 및 EC2-1H9으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며， 중국 햄스터 난소 세포 (Chinese hamster ovary cel ls , CHO)인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 사용한， "세포주 (cel l l ine) "는 실험실에서 성장할 수 있는 특정 세포 형태 중 하나를 나타낸다. 세포주는 영구적으로 확립된 세포 배양 내에서 일반적으로 성장될 수 있고， 제공되는 적절한 신선 배지 및 공간에서 무기한으로 확산될 수 있다. 분리된 세포로부터 세포주를 확립하는 방법은 당업계에서 널리 알려져 있다. 바람직한 실시예에서， 상기 세포주는 안정적인 세포주이고， 상기 세포주는 CGT를 억제시키는 miRNA가 포함된 특정 플라스미드의 선별 마커에 따라 선별될 수 있고， 본 발명에서는 블라스티시딘을 사용하여 선별되었다 본 발명의 구체적인 실시예에서， 재조합 인간 EP0가 생성되는 세포주에서 EtD0-P4 처리하여 당지질 및 시알산에 미치는 효과를 확인한 결과ᅳ 에리스로포이에틴 (recombinant human erythropoiet in(rhEpo) )의 당지질 (GSL)이 감소하였고 시알산 함량이 증가함을 확인하였다 (도 1 참조) . 또한， EC2-1H9 세포에서 CGT-siRNA 처리에 의한 당지질 및 시알산의 함량에 미치는 효과를 조사한 결과， siRNA 처리된 세포는 CGT의 발현이 검출되지 않았고， 당지질은 감소하였으며 정제된 rhEPO에서 시알산 함량은 증가함을 확인하였다 (도 2 참조) . 아울러， CGT를 안정적으로 억제하는 세포주 (EC2-lH9-miR 1 및 EC2-lH9-miR 2)에서 당지질 (GSL)이 감소함을 확인하였고 (도 3 참조)， EC2-1H9 대조군 세포주와 비교하여 시알산 함량이 증가함을 확인하였으며 (도 4 참조)， 세포 성장 패턴 및 rhEPO 생성은 대조군 세포에서의 형태와 유사함을 확인하였다 (도 5 참조) . 따라서， 본 발명은 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT)에 특이적으로 결합하는 siRNA 및 miRNA를 통하여 상기 CGT 억제를 유도하는 세포주， 예를 들면， EC2-lH9-miRl 및 EC2-lH9-miR2는 세포 내 고함량의 시알산 (sial ic acid)을 포함하는 에리스로포이에틴 (EP0)을 생성함으로써 재조합 치료 단백질의 안정성을 증가시켜 이를 필요로 하는 질환의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 나아가， 본 발명은

1) 상기 재조합 세포주를 배양하는 단계 ; 및

2) 상기 단계 1)의 배양액에서 고 시알산 함량의 당단백질을 분리하는 단계를 포함하는 고 시알산 함량의 재조합 당단백질의 제조방법을 제공한다. 상기 당단백질은 시알산이 결합할 수 있는， 에리스로포이에틴， 트름보포이에틴， 알파-안티트립신， 콜린에스테라제， 융모성 고나도트로핀，

CTLA4Ig, 인자 VIE , 감마-글루타밀트랜스퍼라아제， 과립구콜로니 자극인자 및 황체형성호르몬으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하고 에리스로포이에틴 또는 트름보포이에틴인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 에리스로포이에틴은 주로 신경 또는 정신 증상을 갖는 인간의 CNS 또는 말초신경계 질환， 및 안질환， 심혈관 질환， 심폐 질환， 호흡기 질환, 신장， 비뇨생식기 질환 위장관 질환 및 내분비 및 대사 이상을 치료 또는 예방하는데 유용하다.

상기 당단백질 분리방법은 공지의 방법을 사용할 수 있으나， 바람직하게는 면역친화성 크로마토그래피를 사용하는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명은 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (CGT)에 특이적으로 결합하는 siRNA 및 miRNA를 통하여 상기 CGT 억제를 유도하는 세포주， 예를 들면， EC2-lH9-miRl 및 EC2— lH9_miR2는 세포 내 고함량의 시알산 (si al i c acid)을 포함하는 에리스로포이에틴 (EP0)을 생성함으로써 재조합 치료 단백질의 안정성을 증가시켜 신경 또는 정신 증상을 갖는 인간의 CNS 또는 말초신경계 질환 및 대사 이상 질환 등의 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다. 이하ᅳ 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단， 하기의 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기의 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>세포주 배양 및 EtD0~P4처리

재조합 인간 적혈구생성인자 (EP0)를 생성하는 CH0 세포주인 EC2-1H9를 강원대학교로부터 제공받았다 (한국). 세포를 37°C, 5% CO2를 포함하는 가습 분위기에서 10% dFBS (소태아 혈청을 투석함; SAFC, US), 3.5 g/L 글루코오스， 20 nM MTX(methotrexate, Sigma), 및 1% 항생제-항진균제 '용액 (Gibco)이 보충되는

ΜΕΜ-α에서 유지하였다. 당지질 (glycosphingolipid(GSL)) 합성의 억제제인

EtD0-P4 (D-thr e으 1ᅳ ( 3 ' ,4 '-ethyl ened ioxy) -pheny 1-2-palmitoylami no— 3_pyr roli dino— 1ᅳ propanol)를 제임스 A. 세이맨 (Dr. James A. Shayman, 미시건 대학, USA)으로부터 제공받았다.

<실시예 2> 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (ceramide glucosyl transferase)의 클로닝

차이니즈 햄스터 (Cr/ce/us griseus) UDP—글루코오스 세라마이드 글루코실트랜스퍼라제 (Ceramide Glucosyl transferase) (UGCG 또는 CGT)를 차이니즈 햄스터 난소세포로부터 클로닝하였다 (GenBank®accession numbers 丽 001246692). 차이니즈 햄스터 난소세포에서 총 RNA를 트리졸 ®(TRIzol®)시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 추출하였고， CGT cDNA 가닥을 RT-PCR(AccuPower RT-PCR PreMix; 바이오니어 (Bioneer))로 합성하였다. 전진 프라이머 (5'-CTC GAG ATG GCG CTG CT-3'； 서열번호 1) 및 역전 프리이머 (5 ' -TCT AGA TTA TAC ATC TAG GAT TTC CTC TGC-3 '； 서열번호 2)를 사용하였다. 클로닝된 CGT를 pGEM-T easy 백터 (PROMEGA, Madison, WI )로 끼워넣고, 그 결과로 pCGT를 얻었다. 유전자 서열을 di-deoxy 서열분석으로 증명하였다.

<실시예 3> siRNA 및 miRNA발현 백터 제조

코드화 영역 (coding region)에서， 차이니즈 햄스터의 CGT cDNA 서열은 마우스 (GenBank acession no.匪 _011673)， 래트 (GenBank accession no. NM_031795) 및 인간 (GenBank acession no. 匪_003358)과 각각 95.86%, 93.92% 및 92.32% 일치함을 나타냈고， 차이니즈 햄스터의 CGT mRNACGenBank accession no. 丽 _001246692； 서열번호 3)를 억제하기 위한 siRNA 서열 (siRNA-675, 서열번호 4 및 5; siRNA-926, 서열번호 6 및 7; 및 siRNA-1098, 서열번호 8 및 9)이 후보군을 바이오니어에 의뢰하여 합성하였다. 상가 올리고뉴클레오티드를 하기 표 1에 열거하였다. EC2-1H9 세포를 리포꿰타민 2000 형질전환 시약 ( Invi trogen)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 CGT 또는 음성 대조군에 대한 siRNA로 일시적 형질전환시켰다.

지속적인 하향조절을 위하여， 하기 표 1에 열거된 올리고뉴클레오티드 CGT-1098_F (서열번호 10) 및 CGT-1098_R (서열번호 11)를 사용하여 miRNA 발현 백터를 사용하였다. 생성된 miR-1098을 pcDNA™ 6.2-GW/EmGFP-miR 백터 ( Invitrogen)로 끼워넣고 그 결과 pcCGT-miR를 얻었다. 상기 백터는 블라스티시딘 (Blast icidin) 선별 유전자를 포함하며 얻어진 전사체는 세포에서 기능적 miRNA를 생성한다.

<실험예 1> 재조합 인간 EP0가 생성되는 세포주에서 EtD0~P4 처리 효과 확인

재조합 인간 EPO(rhEPO)가 생성되는 세포주 EC2-1H9 세포에서 EtD0-P4를 처리한 후 당지질 및 시알산에 미치는 효과를 조사하기 위하여， 하기 실험을 수행하몄다. 구체적으로， EtD0-P4 처리에 있어세 세포 (5xl0 ⁶ )를 24시간 동안 10% dFBS가 보충되는 ΜΕΜ-α로 100-mm 플레이트에서 배양하고， 혈청 없는 ΜΕΜ-α로

2회 세척하고 1 μΜ EtD0-P4/MEM-a를 첨가하여 48시간 동안 배양하였다.

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이 글루코실세라마이드의 합성에 기반한 당지질 (glycosphingolipid(GSL))은 세라마이드 글予코실트랜스퍼라제 (CGT) 억제제， EtD0-P4에 의해 억제되었다 (Lee et al. 1999). EtD0-P4 처리는 주요 당지질 (GSL)인 GMl, GM2 및 GM3의 발현을 EC2-1H9 세포주에서 완전히 감소시킴을 확인하였다 (도 1A). 이와는 반대로， EtD0-P4 처리에 의해 EC2— 1H9을 위한 재조합 적혈구생성인자 (erythropoietin(EPO))의 시알산 함량이 증가하였다. 밀배아 웅집소 (Wheat Germ Agglutinin(WGA)) 렉틴 블랏의 상대적 경우에서， 정제된 재조합 인간 적혈구생성인자 (recombinant human erythropoietin(rhEpo))의 시알산 함량이 22%까지 증가함을 확인하였다 (도 1B 및 1C). 이는 시알산과 같은 GSL 생합성 구성요소가 공동-기질을 위한 글리코단백질의 당화에 사용되었음을 나타낸다 (도 1).

<실험예 2> siRNA처리에 의한 CGT의 일시적 하향조절 확인

EC2-1H9 세포에서 CGT-siRNA 처리에 의한 당지질 및 시알산의 함량에 미치는 효과를 조사하기 위하여， 상기 <실시예 3> 및 하기 표 1의 siRNA_675(siRNAl), siRNA_926(siRNA2) 및 siRNA_1098(siRNA3)를 이용하여 형질전환을 수행하였다.

구체적으로， EC2-1H9 세포에 리포펙타민™ LTX 및 PLUS™ 시약 (Invitrogen)을 사용하여 세 개의 다른 5 nM 및 10 nM의 CGT-siRNA(siRNAl, siRNA2 및 siRNA3)를 형질전환시켰다. 형질전환된 세포를 96-웰 조직 배양 플레이：트 (Nunc)에서 10 세포 /웰로 분주한 후 안정적 세포주 (stable cell line)를 37 ⁰ C, 5% CO2를 포함하는 가습 분위기에서 10% dFBS (소태아 혈청을 투석함; SAFC, US), 3.5 g/L 글루코오스， 20 nM MTXOnethotrexate, Sigma), 및 1% 항생제-항진균제 용액 (Gibco)이 보충된 변형된 이글'스 배지 -α(ΜΕΜ-α ;

Gibco)에서 2 주 동안 선별하였다. 형질전환시킨 후， 24시간째에 총 RNA를 트리졸 ^® 시약을 사용하여 분리하고 cDNA로 1.0 //g의 역전사는 AccuPower

RT-PCR PreMix(바이오니어)를 사용하여 수행되었다. PCR에 의한 차이니즈 햄스터 CGT의 mRNA 전사체를 확인하기 위하여 cDNA를 템플레이트로서 사용하였다. 차이니즈 햄스터 CGT를 증폭하기 위하여， CGT 클로닝에 사용한 동일한 프라이머를 사용하였다. 증폭된 유전자를 0.8% 아가로우즈 젤에 분리한 후 에티듐 브로마이드 염색으로 관찰하였다.

당지질 (glycosphingol ipid(GSL) )을 30분 동안 초음파처리하에서 클로로폼 /메탄올 (C/M; 2: 1 , v/v) 및 이소프로판올 /핵산 /물 ( IPA/H/W; 55:25: 20， v/v/v)으로 추출하였다. GSL 추출물을 0. 1 M NaOH/MeOH에서 용해하고 2시간 동안 40°C에서 배양하였고， 1 N HC1로 중성화시키고， 핵산을 첨가하고 5분 동안 놓아두었다. 아래 층을 N ₂ 기류하에서 증발시키고 증류수에 용해하고， SepPak C ₁₈ 카트리지 (Varian, Palo Al to, CA)에 적용하였다. 증류수로 세척한 후 총 GSL을 C/M으로 용출하고 증발시켰다. C/M으로 용해시킨 잔류물을 TLC 폴레이트상에 스팟팅하고 (Si l ica Gel 60 F-254, Merck) , C/M/0.2% CaCl ₂ (55： 40： 10 v/v/v)에서 현상하고， 2 M H ₂ S0 ₄ 있는 2% 오르시놀 (orcinol )로 스프레이하여 염색하였다.

그 결과 도 2에 나타낸 바와 같이 상기 <실시예 2>에서 제조된 pCGT 백터를 양성 대조군으로 사용하였고 (도 2A, 1번 래인) , 차이니즈 햄스터 CGT의 전사를 EC2-1H9 대조군 세포에서 검출하였다 (도 2A, 2번 래인) . siRNA 처리된 세포는 CGT의 발현이 검출되지 않았다. 당지질 (GSL)은 siRNA 처리된 세포에서 감소하였다 (도 2B) . Maackia Amur ens is Lect in KMAL I ) 렉틴 블랏의 상대적 강도의 경우에서， 정제된 rhEPO의 시알산 함량은 22%까지 증가하였다 (도 2C) . RT-PCR 및 렉틴 블랏 분석에 기반하여， miRNA 발현 벡터를 제조하기 위하여 하나의 siRNA후보군을 선별하였다.

【표 1】

<실험예 3> CGT가계속적으로하향조절되는 안정세포구축 확인

CGT가 계속적으로 하향조절되는 안정세포 (stable cell)에서 글리칸 분석으로서 당지질 및 시알릴화에 대한 영향을 조사하기 위하여， 상기 <실험예 2>에서 설명한 동일한 방법으로 실험을 수행하였다. 구체적으로， EC2-1H9 세포에 리포펙타민™ LTX 및 PLUS™ 시약 (Invitrogen)을 사용하여 상기 <실시예 3〉에서 제조된 pcCGT-miRNA를 형질전환시켰다. CGT에 대한 miRNA가 과발현된 안정세포주는 블라스티시딘을 사용하여 선별되었다. 형질전환된 유전자의 발현을 ；검출하기 위하여， 각각 전사체의 총 R A를 분리하고， 차이니즈 햄스터 CGT의 전사체를 검출하기 위하여 RT-PCR을 사용하였다.

그 결과， 도 3에 나타낸 바와 같이 차이니즈 햄스터 CGT 전사체는

EC2-1H9 대조군 세포에서 약간 검출되었고 (도 ？ A, 3번 래인)， pcCGT-miR 백터가 양성 대조군으로서 사용되었다 (도 3A, 1번 래인) . 두 개의 클론 (EC2-lH9-miR 1 및 EC2-lH9-miR 2)은 CGT 유전자 발현을 나타내지 않았다 (도 3A, 4번 및 5번 래인) . 또한， 당지질은 siRNA 처리된 세포 (EC2-lH9-miR 1 및 EC2-lH9-miR 2)에서 감소함을 나타냈다 (도 3B) . siRNA 처리된 세포에서 시알산이 증가함을 나타냈다 (도 X) .

<실험예 4> 안정세포 내 CMP-시알산농도의 정량분석 확인

상기 안정세포로부터 시알루리아 (sialur ia)-돌연변이된 래트 GNE/MNK 발현의 효과를 조사하가 위하여 세포 내 CMP-시알산 농도를 정량분석을 하기와 같이 수행하였다.

구체적으로， 1.0 X 10 ⁷ 세포를 소닉 세포 교란기 (sonic cel l disruptor) (Vibra cel l 130； Sonics & Mater ials)를 사용하여 얼음처럼 차거운 ( ice-cold) 75% (v/v) 에탄올에서 용해시켰다. 가용성 부분을 10분 동안 13,000 rpm, 4 ⁰ C에서 원심분리하고 동결건조하였다. CMP-시알산을 안정화시키기 위하여， 시료를 120 ^의 40 mM 인산화 버퍼 pH 9.2에 재현탁하고 원심분리하였다. 상층액을 10,000 丽이하만 통과시키는 멤브린을 통하여 여과하였다 (Microcon ^® ; Mi l l ipore) . 슈가 뉴클레오티드를 CarboPac PA-1 컬럼 (Dionex) 상에서 분리하고 흡광도 검출기로 Abs ₂₆₀ 에서 검출하였다 (model 486 tunable UV vi sible absorbance detector) . 세포 내 CMP-시알산 수준을 세포 수에 관하여 표준화하였다.

그 결과， 도 4A에 나타낸 바와 같이 세포 내 CMP-NeuNAc의 농도는 대조군 세포주와 조작된 세포주 사이에서 전혀 다르지 않음을 확인하였다 (도

4A).

<실험예 5> 안정세포에서 rhEPO의 시알산함량분석 확인

상기 안정세포에서 정제된 rhEPO의 시알산 함량을 분석하기 위하여，

0PD-표지 방법을 사용하여 하기 실험을 수행하였다.

구체적으로， EC2-1H9 세포 및 선별된 세포주를 10%(v/v) dFBS, 3.5 g/L 글루코오스， 1% (v/v) Ab-Am 용액 및 20 nM ΜΤΧ로 보충되는 ΜΕΜ-α가 들어있는

T-175 cm ² 배양 플라스크 (Nunc)에서 5.0 x 10 ⁶ 세포 농도로 분주하였다. 3일 후에， 쎄양배지를 혈청 없는 배지 (CH(^S-SFM II； Gibco)로 대체하고 세포를 2일 동안 추가적으로 배양하였다. 재조합 인간 EPO(rhEPO)가 포함된 배양 상층액을 수득하고 0.45 m 구멍크기의 멤브린을 통하여 여과시켰다. rhEPO를 분리하기 위하여, 여과된 배양 배지를 농축하고 초미세여과법 (AmiconUltra; Millipore)을 이용하여 PBS로 버퍼를 바꾸었다. rhEPO를 마우스 항 -인간 EP0 단일항체 (R&D systems)와 결합된 CNBr-act ivated Sepharose 4B (Amersham Biosciences)로 만들어진 면역친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 시료를 로딩하고 PBS로 세척한 후에， 결합된 rhEPO를 0.1 M 글라이신 /0.5 M NaCl , pH 2.8로 용출하고 용출물을 1.0MTris/HCl, pH9.0로 즉시 중성화시켰다. 정제된 rhEPO를 농축시키고 초미세여과법에 의해 증류수로 투석하였다 (AmiconUltra; Millipore). rhEPO의 농도를 Quant-iT ^TM 단백질 분석키트 ( Invitrogen)를 사용하여 결정하고， 동결건조하였다. rhEPO의 시알산 함량의 정량분석을 위하여， rhEPO의 시알산 함량을 0PD—표자 방법을 사용하여 결정하였다 (Anumula 1995) . 시알산을 20분 동안 80°C에서 0.5 M NaHS0 ₄ 에 있는 정제된 rhEPO로부터 분리하고 40 분 동안

80°C에서 0PD ((广 phenylenediamine-2HCl; Sigma)로 유도하였다. 0PD-표지된 시알산을 HPLC를 사용하여 C18 역상 C ₁₈ 컬럼 (Shim-pack CLC-ODS; Shimadzu) 상에서 분리하고 형광검출기 (모델 474; Waters)의 230 nm 방출 및 425 nm 여기파장에서 검출하였다. 인간 EP0는 ^연결된 당화 부위 (두 개의 시알산 잔기)를 가지고 세 개의 ^연결된 당화 부위 (네 개의 시알산 잔기)를 가지고 있으므로 시알산의 14 몰까지 1 몰 rhEPO로 부착될 수 있다.

그 결과， 도 4B에 나타낸 바와 같이 EC2-lH9-miRl 및 miR2 세포주로부터 rhEPO의 시알산 함량은 각각 7.8 및 8.7 몰 시알산 /몰, rhEPO로서 측정되었고， 이는 EC2-1H9 대조군 세포주와 비교하여 시알산 함량에 있어서 각각 약 26. 및 40. W증가를 나타냈다 (도 4B) .

<실험예 6>세포성장 및 rhEPO생성 분석 확인

세포 성장 패턴 및 rhEPO 생성에 있어서 유전자 과발현 효과를 결정하가 위하여， 세포성장 및 rhEPO 생성 분석 실험을 수행하였다.

구체적으로， 기하급수적으로 자라는 세포를 6-웰 배양 플레이트 (Nunc)에서 0.5 x 10 ⁶ 농도로 분주하였다. 3일 동안 배양 후， 배양 배지를 혈청 없는배지 (CH0-S-SFM I I； Gibco)로 대체하여 rhEPO를 생성하였다 (도 5A 및 B, 화살표로 지적됨) . 트립신처리하여 세포를 분리하고 트립판 블루로 염색한 후에， 살아있는 세포의 수를 헤마토사이토미터 (hemocytometer)로 수를 세어 결정하였다. 배출된 rhEPO의 농도를 샌드위치 ELISA 분석을 사용하여 측정하였다. 96-웰 면역-플레이트 (Nunc)를 18 시간 동안 4 ⁰ C에서 래빗 항 -인간 EP0 다클론 항체 (Sigma)으로 코팅하고， 1시간 동안 상온에서 TBS-T(150 mM NaCl , 0.05¾> Tween 20을 포함하는 10 mM Tris-HCᄂ 7.4)에서 2% BSA로 차단하였다. TBS-T로 3회 세척한 후에, 연속으로 희석된 rhEPO 표준화 및 배양된 배지 상층액을 2시간 동안 37°C에서 로딩하고 배양하였다. TBS-T로 3회 세척한 후에, 상기 플레이트를 30분 동안 37°C에서 1: 2 , 000으로 희석된

HRP—결합된 고우트 항-마우스 IgG 2차 항체 (Santa (： 12 ^ 016(±11010 )와 같이 배양하고 TBS-T로 3회 세척하였다. ELISA(3 ,3 ' , 5, 5' tetramethylbenzidine ; Sigma) 를 위한 100 ^의 TMB 액체 기질 시스템을 각각의 웰에 첨가하고 흡광도를 마이크로플레이트 리더 (Infinite M200 Megel lan, Tecan)를 사용하여 370 nm에서 측정하였다.

그 결과， 도 5에 나타냈다 (도 5).