La lipasas son las enzimas más usadas en biocatálisis, porque reconocen muchos sustratos diferentes pero, en muchas ocasiones, con una elevada regio- o enantio-selectividad o especificidad. De esta forma, las lipasas han sido utilizadas en áreas de la química muy diferentes, por ejemplo energía (producción de biodiesel) , alimentación (producción de lípidos estructurados)) o química fina (por ejemplo resolución de mezclas racémicas) . Además, las lipasas son biocatalizadores bastante robustos, lo que permite su empleo en medios no convencionales, como por ejemplo disolventes orgánicos, líquidos iónicos o fluidos supercríticos , aumentando aun más el rango de posibles aplicaciones. Sin embargo, no hay que perder de vista que una de las ventajas de las enzimas comparadas con otros catalizadores es que pueden ser utilizadas en medios totalmente acuosos.

Los sustratos naturales de las lipasas son los aceites y grasas. De hecho, una de las principales aplicaciones industriales de las lipasas es la hidrólisis de estos sustratos naturales, normalmente para obtener ácidos grasos libres o aceites modificados. Debido a la naturaleza de sus sustratos, la mayoría de las lipasas presentan un peculiar mecanismo de reacción, con el sitio activo aislado del medio de reacción por una cadena peptídica denominada "lid". En presencia de una superficie hidrofóbica (por ejemplo, una gota de aceite) este lid se mueve para exponer el centro activo y la lipasa se adsorbe a la superficie hidrofóbica de la gota de sustrato.

La triacetina es aparentemente una molécula muy sencilla, que puede ser fácilmente producida por la completa acetilación del glicerol. Esta molécula se usa habitualmente en determinaciones de actividad de las lipasas, pero el estudio detallado de esta reacción no se ha publicado, a pesar de que su hidrólisis regioselectiva podría producir compuestos multifuncionales e incluso quirales. Por ejemplo, la hidrólisis regioselectiva de un único grupo acetil de la triacetina permite producir diacetina, que tiene un único grupo hidroxilo libre en la posición 2 o 3. Este compuesto puede ser útil para algunos usos, como por ejemplo la síntesis de O- ( 1 , 2-di-0-acetil-glicero-3-fosforil ) etanolamina [1]. Referencia Ib utiliza lipasas 1,3 regioespecí ficas para conseguir 2-monoacetina, que posteriormente se acila químicamente para conseguir diglicéridos estereoespecí fieos . Pero si esta hidrólisis ocurre tan solo en posición 1 o en posición 3, el carbono 2 de la diacetina será un centro quiral, aumentando aún más el interés del proceso.

Sin embargo, la migración de los grupos acilos y la racemización puede producir una mezcla de regio y enantioisómeros , disminuyendo el interés del proceso, de forma que hay que seleccionar condiciones experimentales en las que esto no ocurra.

Aunque habitualmente los triglicéridos presentan una baja solubilidad en agua al estar formados por largas cadenas de acilo, la corta cadena de la triacetina aumenta significativamente su solubilidad en agua (70 g/L at 25°C) , permitiendo realizar la hidrólisis en sistemas acuosos a concentraciones moderadamente elevadas. Sin embargo, se ha descrito que su baja hidrofobicidad causa que este sea un sustrato malo para lipasas cuando está completamente soluble [2-3] e incluso es bastante poco eficiente en inducir la activación interfacial de lipasas [4] . Incluso en ausencia de migración, en un principio, como se muestra en la referencia Ib, se esperaría que el uso de lipasas en hidrólisis de triacetina condujera a la formación de 2-monoacetina, pasando por una fase de mezcla de 1 , 2-diacetina / 2-monoacetina. Sin embargo, si la triacetina ya no es muy hidrofóbica y no es muy buen sustrato de la enzima, es muy posible que la 1,2 (2,3) diacetina sea aún peor sustrato y en determinadas condiciones pueda conseguirse su acumulación casi total.

Referencias [1] a) Puricelli, L. O- ( 1 , 2di-0-acetyl-glycero-3- phosphoryl ) ethanolamine , a process for its preparation and its therapeutic use. European patent 0 335 331. 1989.

b) . Mazur et al . : "REGIO AND STEREOSELECTIVE SYNTHESIS OF TRIGLYCERIDES" W09116442, 1991

[2] Sarda, L. Desnuelle P. Action de la lipase pancreatique sur les esters en emulsión Biochim. Biophys. Acta, 1958; 30: 513- 521

[3] Ferrato, F. , Carriere, F. , Sarda, L., Verger R. , in:, Methods in Enzymology, B. Rubin, E.A. Dennis (Eds . ) Academic Press, New York. 1997; 286: 327-34

[4] Pernas, M.A., Pastrana, L . , Fuciños, P., Rúa, M.L.

Regulation of the interfacial activation ithin the Candida rugosa lipase family. J. Phys . Org. Chem. , 2009; 22: 508-514.

Breve descripción de la invención

En esta solicitud de patente se describe un procedimiento de hidrólisis regioselectiva, preferentemente en medios acuosos, de triacetina soluble para producir 1,2- diacetina con altos rendimientos catalizada por diferentes enzimas, preferentmente, lipasas. Se diseña la reacción de forma que se minimiza la migración de grupos acilos y gracias a la diferente hidrofobicidad de diacetina y triacetina, al uso de enzimas 1, 3 especificas, se consigue acoplar 1,2- diacetina.

Asi esta solicitud se refiere a un procedimiento de obtención de 1 , 2-diacetina caracterizado porque comprende realizar una hidrólisis de triacetina catalizada por un enzima, preferentemente una lipasa, a un pH comprendido entre 2 y 6, ambos valores incluidos.

La hidrólisis se realiza a temperaturas variables y preferentemente a una temperatura comprendida entre 4 y 30 °C.

Según este procedimiento el pH es preferentemente entre 4 y 5.5.

La enzima, tal como una lipasa, para su uso en este procedimiento puede estar inmovilizada sobre un soporte. Dicho soporte puede ser a modo de ejemplo un soporte acrílico, vidrio poroso, agarosa, sílice, celulosa, poliestireno, poliestireno divinilbenceno o poliuretano.

Además, las lipasas pueden estar inmovilizadas por adsorción física, por ejemplo, por adsorción física sobre soportes hidrofóbicos .

Según otras realizaciones, la lipasa se inmoviliza como agregado enzimático covalente entrecruzado o cristal enzimático entrecruzado.

Lipasas útiles pueden ser lipasas de microorganismos de los géneros Candida , Thermomyces , Bacillus, Aspergillus,

Mucor, Rhizomucor .

Según realizaciones particulara además se pueden añadir disolventes solubles en agua entre el 10-90% v/v. Esos disolventes pueden ser por ejemplo, acetonitrilo, dioxano, tetrahidrofurano , dimetil formamida, metanol, etanol o propanol .

También se puede realizar la hidrólisis en un disolvente inmiscible con el agua, saturado en agua.

Según otras realizaciones particulares se usa como disolvente dietil éter.

Según otras realizaciones particulares adicionales el procedimiento comprende la adición de disolventes solubles en agua entre el 10-90%. v/v, los cuales pueden estar seleccionados entre, por ejemplo, acetonitrilo, dioxano, tetrahidrofurano , dimetil formamida, metanol, etanol, propanol y mezclas de ellos.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la reacción así como las posibles reacciones no deseadas

La figura 2 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina a pH 5,5 y 22°C catalizada por CALB inmovilizada en Sepabeads glutaraldehido . (Círculos: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina . ) La figura 3 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina a pH 5,5 y 22°C catalizada por CALB inmovilizada en Sepabeads C18. Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina.

La figura 4 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina a pH 5,5 y 22°C catalizada por RML inmovilizada en Sepabeads C18. (Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina) .

La figura 5 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina a pH 5,5 y 22°C en 20% aceonitrilo catalizada por RML inmovilizada en Sepabeads C18. Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina.

La figura 6 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina a pH 5,5 y 22°C en 20% aceonitrilo catalizada por CALB inmovilizada en Sepabeads glutaraldehido . (Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina) .

Descripción detallada de la invención

Se pretende conseguir frenar la hidrólisis de triacetina catalizada por diferentes lipasas 1,3 especificas (e.g., las de los géneros Candida, Thermomyces, Bacillus, Aspergillus , Mucor, Rhizomucor) de forma libre o inmovilizada en diferentes soportes (e.g. soportes acrilicos, vidrio poroso, agarosa, sílice, celulosa, poliestireno , poliestireno divinilbenceno , poliuretano) , bien de forma covalente o bien por absorción física, en 1 , 2-diacetina (figura 1), para su posterior empleo en el diseño de diferentes productos regio y enantioespecífieos .

A pH 7 y 4°C o 25°C se produce la migración de acilos obteniéndose en el momento en el que se consume toda la triacetina una mezcla de 1,2- y 1 , 3-diacetina, además de una cierta cantidad de 1- y 2-monoacetina e incluso glicerol.

Sin embargo en el intervalo de pH 6-3 y en el intervalo de temperaturas de 4 a 37 °C se consigue evitar la formación de 1 , 3-diacetina por migración y además se produce la acumulación de 1 , 2-diacetina, con muy alto rendimiento (por encima del 80% e incluso cercano al 100%), para todas las preparaciones de las diferentes lipasas utilizadas. Los resultados no se afectaban apenas por el uso de diferentes concentraciones de triacetina, desde 100 mM (en el que la triacetina es totalmente soluble) a 5 M de triacetina (en este caso se forma un sistema bifásico con parte de la triacetina soluble y el resto en una fase insoluble triacetina, que se va consumiendo hasta producir entre un 80% y > 98% de 1 , 2-diacetina) .

El control del pH es critico. Se recomienda utilizar tampones muy concentrados (e.g., 1 molar de fosfato o de acetato) y solo subir el pH hasta 5.5 cuando el pH desciende por debajo de pH 3 utilizando un tampón saturado a pH 7 y muy buena agitación para evitar gradientes de pH donde se producirá la migración de los grupos acilos

La reacción bajaba en velocidad pero aumentaba los rendimientos de 1 , 2-diacetina si se utilizan codisolventes miscible (5-75% v/v) con agua (por ejemplo acetonitrilo, dioxano, tetrahidrofurano , dimetil formamida, metanol, etanol, propanol, etc) , posiblemente al inhibir de forma más acusada la hidrólisis de la 1,2 diacetina que al de triacetina.

Se ensayó también la reacción de hidrólisis en dietil éter saturado en agua, un disolvente descrito como inhibidor de la migración de acilos. En este caso se utilizaron solo enzimas inmovilizadas o agregadas, el disolvente está saturado previamente en tampón acetato a pH 5, añadiéndose progresivamente este tampón a lo largo de la reacción para compensar el agua consumida por la hidrólisis. La velocidad de reacción fue menor con la mayoría de las preparaciones de lipasas, pero los rendimientos conseguidos de 1,2 diacetina fueron similares (80- >98%) .

Para todos los casos ensayados, usando las diferentes lipasas descritas anteriormente libres o inmovilizadas en diferentes soportes, en condiciones donde la migración de acilo era disminuida o eliminada se conseguían rendimientos superiores al 80% de 1 , 2-diacetina . Ejemplos de la invención

Ejemplo 1. Hidrólisis de triacetina a pH 5.5 por la lipasa B de Candida antárctica inmovilizada sobre Sepabeads C 18.

Glutaraldehído-Sepabeads fue preparado suspendiendo 10 g de soporte EC-HA-Sepabeads húmedo en 20 mL del5% glutaraldehido (v/v) en fosfato 200 mM a pH 7.0. La suspensión se mantuvo bajo agitación suave a 25°C durante 15 h. Después de ese tiempo, el soporte activado se filtró y se lavó exhaustivamente con agua destilada. Este tratamiento se realizó para activar todos los aminos primarios del soporte con dos moléculas de glutaraldehido. El soporte activado se utilizó inmediatamente después de su preparación.

10 g de glutaraldehido-Sepabeads se añadieron a 400 mL de una disolución de lipasa (0,5 mg/mL) en fosfato sódico 10 mM a pH 7 en presencia de 0.1 % (v/v) Tritón X -100. Tras 7 horas a 22 °C bajo agitación a 250 rpm, la suspensión se filtro y la lipasa inmovilizada se lavó 5 veces con 10 volúmenes de agua destilada, el biocatalizador húmedo se almacenó a 4°C.

Por otro lado se preparó una disolución de 100 mM de triacetina en 500 mM de fosfato sódico y su pH se ajustó a pH 5.5. El sustrato era completamente soluble en estas condiciones .

Se añade una muestra de 1,5 g de biocatalizador húmedo a 40 mL de la disolución de triacetina y las suspensiones de reacción se agitaron suavemente en un agitador a 250 rpm y 22°C. Periódicamente se sacaron muestras de esta suspensión, se descartó el biocatalizador por centrifugación y la concentración de los productos de reacción se analizó por HPLC. Diacetina y triacetina se analizaron usando 10% acetonitrilo/ 90% agua (v/v) como fase móvil a un flujo de 1 ml/min y una columna RP-HPLC (con una bomba Spectra Physic SP 100 y un detector UV Spectra Physic SP 8450) usando una columna Kromasil C18 (15 cm x 0,46 cm) , los volúmenes de retención fueron 32.0 mi para triacetina, 5,8 mi para 1,2- diacetina, 4.8 mi para 1 , 3-diacetina . Las concentraciones de triacetmas y ambas diacetinas se calcularon usando muestras curvas de referencia usando muestras comerciales. Monoacetina se analizó usando la misma columna y flujo, pero la fase móvil, fue 1,5% acetonitrilo/ 98,5% agua (v/v) , con un volumen de retención de 3.6 mi mientras el ácido acético eluye en 3.0 mi.

Tras 2 horas de reacción se habla consumido toda la triacetina, con un 95% de de 1 , 2-diacetina y un 5% de 2- monoacetina. El catalizador pudo reutilizarse en 5 ciclos sin que se observase variación en velocidad o rendimiento. La figura 2 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina catalizada por CALB inmovilizada en Sepabeads glutaraldehido at pH 5,5 y 22°C. (Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina.)

Ejemplo 2. Hidrólisis de triacetina a pH 5.5 por la lipasa B de Candida antárctica inmovilizada sobre Sepabeads-C 18.

10 gramos de octadecil-Sepabeads se añadieron a 400 mL de CALB en una disolución de lipasa (0.5 mg/mL) en tampón fosfato 10 mM a pH 7 y 22°C. Después de 7 h bajo agitación a 250 rpm, la suspensión se filtro y la lipasa se lavó 5 veces con 10 volúmenes de agua destilada. La preparación húmeda se almacenó a 4°C.

Por otro lado se preparó una disolución de 100 mM de triacetina en 500 mM de fosfato sódico y su pH se ajustó a pH 5.5. El sustrato era completamente soluble en estas condiciones .

Se añade una muestra de 1,5 g de biocatalizador húmedo a 40 mL de la disolución de triacetina y las suspensiones de reacción se agitaron suavemente en un Shaker a 250 rpm y 22 °C. Periódicamente se sacaron muestras de esta suspensión, se descartó el biocatalizador por centrifugación y la concentración de los productos de reacción se analizó por HPLC. Diacetina y triacetina se analizaron usando 10% acetonitrilo/ 90% agua (v/v) como fase móvil a un flujo de 1 ml/min y una columna RP-HPLC (con una bomba Spectra Physic SP 100 y un detector UV Spectra Physic SP 8450) usando una columna Kromasil C18 (15 cm x 0,46 era) , volúmenes de retención fueron 32.0 mi para triacetina, 5,8 mi para 1 , 2-diacetina, 4.8 mi para 1 , 3-diacetina . Las concentraciones de triacetinas y ambas diacetinas se calcularon usando muestras curvas de referencia usando muestras comerciales. Monoacetina se analizó usando la misma columna y flujo, pero la fase móvil, fue 1,5% acetonitrilo/ 98,5% agua (v/v), con un volumen de retención de 3.6 mi mientras el ácido acético eluye en 3.0 mi.

Tras 60 minutos de reacción se agota la triacetina y se consigue un rendimiento del 87% de 1,2 diacetina y 13% de 2- monoacetina. La figura 3 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina catalizada por CALB inmovilizada en Sepabeads C18 at pH 5,5 y 22°C. Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina.

Ejemplo 3. Hidrólisis de triacetina a pH 5.5 por la lipasa de Rhizomucor miehei (RML) inmovilizada sobre Sepabeads-C 18.

10 gramos de octadecil-Sepabeads se añadieron a 55 mL (RML) de una disolución de lipasa (0.5 mg/mL) en tampón fosfato 10 mM a pH 7 y 22°C. Después de 7 h bajo agitación a 250 rpm, la suspensión se filtró y la lipasa se lavó 5 veces con 10 volúmenes de agua destilada. La preparación húmeda se almacenó a 4°C.

Por otro lado se preparó una disolución de 100 mM de triacetina en 500 mM de fosfato sódico y su pH se ajustó a pH 5.5. El sustrato era completamente soluble en estas condiciones .

Se añade una muestra de 1,5 g de biocatalizador húmedo a 40 mL de la disolución de triacetina y las suspensiones de reacción se agitaron suavemente en un Shaker a 250 rpm y 22°C. Periódicamente se sacaron muestras de esta suspensión se descarto el biocatalizador por centrifugación y la concentración de los productos de reacción se analizó por HPLC. Diacetina y triacetina se analizaron usando 10% acetonitrilo/ 90% agua (v/v) como fase móvil a un flujo de 1 ml/min y una columna RP-HPLC (con una bomba Spectra Physic SP 100 y un detector UV Spectra Physic SP 8450) usando una columna Kromasil C18 (15 cm x 0,46 era) , los volúmenes de retención fueron 32.0 mi para triacetina, 5,8 mi para 1,2- diacetina, 4.8 mi para 1 , 3-diacetina . Las concentraciones de triacetinas y ambas diacetinas se calcularon usando muestras curvas de referencia usando muestras comerciales. Monoacetina se analizó usando la misma columna y flujo, pero la fase móvil fue 1,5% acetonitrilo/ 98,5% agua (v/v) , con un volumen de retención de 3.6 mi mientras el ácido acético eluye en 3.0 mi.

Tras 1 hora se consigue un 88% de 1,2 diacetina y un 12% de 2-monoacetina . La figura 4 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina catalizada por RML inmovilizada en Sepabeads C18 at pH 5,5 y 22°C. (Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina) .

Ejemplo 4. Hidrólisis de triacetina a pH 5.5 en presencia de 20% acetonitrilo por la lipasa de Rhizomucor miehei (RML) inmovilizada sobre Sepabeads-C 18.

10 gramos de octadecil-Sepabeads se añadieron a 55 mL (RML) de una disolución de lipasa (0.5 mg/mL) en tampón fosfato 10 mM a pH 7 y 22°C. Después de 7 h bajo agitación a 250 rpm, la suspensión se filtró y la lipasa se lavó 5 veces con 10 volúmenes de agua destilada. La preparación húmeda se almacenó a 4°C.

Por otro lado se preparó una disolución de 100 mM de triacetina en 500 mM de fosfato sódico /20% acetonitrilo (v/v) y su pH se ajustó a pH 5.5. El sustrato era completamente soluble en estas condiciones.

Se añade una muestra de 1,5 g de biocatalizador húmedo a 40 mL de la disolución de triacetina y las suspensiones de reacción se agitaron suavemente en un Shaker a 250 rpm y 22°C. Periódicamente se sacaron muestras de esta suspensión, se descartó el biocatalizador por centrifugación y la concentración de los productos de reacción se analizó por HPLC. Diacetina y triacetina se analizaron usando 10% acetonitrilo/ 90% agua (v/v) como fase móvil a un flujo de 1 ml/min y una columna RP-HPLC (con una bomba Spectra Physic SP 100 y un detector UV Spectra Physic SP 8450) usando una columna Kromasil C18 (15 cm x 0,46 era) , volúmenes de retención fueron 32.0 mi para triacetina, 5,8 mi para 1,2 diacetina, 4.8 mi para 1 , 3-diacetina . Las concentraciones de triacetinas y ambas diacetinas se calcularon usando muestras curvas de referencia usando muestras comerciales. Monoacetina se analizó usando la misma columna y flujo, pero la fase móvil, fue 1,5% acetonitrilo/ 98,5% agua (v/v), con un volumen de retención de 3.6 mi mientras el ácido acético eluye en 3.0 mi.

Tras 4 h de reacción, el rendimiento supera el 95%.

La figura 5 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina catalizada por RML inmovilizada en Sepabeads C18 at pH 5,5 y 22°C en 20% aceonitrilo. Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina.

Ejemplo 5. Hidrólisis de triacetina a pH 5.5 en 20% acetonitrilo catalizada por la lipasa B de Candida antárctica inmovilizada sobre Sepabeads-glutaraldehido .

10 gramos de octadecil-Sepabeads se añadieron a 400 mL de CALB en una disolución de lipasa (0.5 mg/mL) en tampón fosfato 10 mM a pH 7 y 22°C. Después de 7 h bajo agitación a 250 rpm, la suspensión se filtró y la lipasa se lavó 5 veces con 10 volúmenes de agua destilada. La preparación húmeda se almacenó a 4°C.

Por otro lado se preparó una disolución de 100 mM de triacetina en 500 mM de fosfato sódico y su pH se ajustó a pH 5.5. El sustrato era completamente soluble en estas condiciones .

Se añade una muestra de 1,5 g de biocatalizador húmedo a 40 mL de la disolución de triacetina y las suspensiones de reacción se agitaron suavemente en un Shaker a 250 rpm y 22°C. Periódicamente se sacaron muestras de esta suspensión se descarto el biocatalizador por centrifugación y la concentración de los productos de reacción se analizó por HPLC. Diacetina y triacetina se analizaron usando 10% acetonitrilo/ 90% agua (v/v) como fase móvil a un flujo de 1 ml/min y una columna RP-HPLC (con una bomba Spectra Physic SP 100 y un detector UV Spectra Physic SP 8450) usando una columna Kromasil C18 (15 cm x 0,46 cm) , volúmenes de retención fueron 32.0 mi para triacetina, 5,8 mi para 1 , 2-diacetina, 4.8 mi para 1 , 3-diacetina . Las concentraciones de triacetinas y ambas diacetinas se calcularon usando muestras curvas de referencia usando muestras comerciales. Monoacetina se analizo usando la misma columna y flujo, pero la fase móvil, fue 1,5% acetonitrilo/ 98,5% agua (v/v), con un volumen de retención de 3.6 mi mientras el ácido acético eluye en 3.0 mi.

Tras 2 un 97% de 1,2 diacetina podia ser observado con un 1% de triacetina aun presente en el medio de reacción, a las 3 h un 98% de diacetina podia ser observado y a las 4 aun se mantiene un 87%. La figura 6 muestra el curso de reacción de la hidrólisis de triacetina catalizada por CALB inmovilizada en Sepabeads glutaraldehido at pH 5,5 y 22°C en 20% aceonitrilo. (Circuios: triacetina, Triángulos: diacetina; cuadrados: monoacetina) .