La presente invención se refiere a un virus recombínante de la cepa virulenta BA71 del virus de la peste porcina africana, deficiente en replicación, a las partículas virales vacías que se producen en células aisladas tras la infección con dicho virus y al uso de dicho material para la elaboración de una vacuna contra el virus de la peste porcina africana. ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

El virus de la peste porcina africana (VPPA) es un virus de DNA de doble cadena de la familia Asfarviridae que provoca una enfermedad hemorrágica muy grave en el cerdo doméstico. Dicha enfermedad produce grandes pérdidas económicas en el continente africano, donde es endémica, y desde donde se ha extendido desde 2007 a países de la región del Cáucaso y a Rusia, lo que supone un peligro de reentrada en Europa occidental y, asimismo, una amenaza para China y otros países asiáticos (Rowlands et al. 2008. Emerg Infect Dis 14:1870-1874). El desarrollo de una vacuna eficaz es, por lo tanto, fundamental para controlar la propagación de esta enfermedad.

A pesar del conocimiento que se tiene actualmente sobre la biología del VPPA, los esfuerzos realizados hasta ahora para conseguir una vacuna eficaz han sido escasos e infructuosos. Se han utilizado preparados inactivados del VPPA que aunque son capaces de inducir una respuesta humoral no protegen frente al virus (Stone y Hess. 1967. Am J Vet Res 28:475-481 ). También se han usado sin éxito cepas atenuadas del VPPA, ya que la inmunización de cerdos con cepas atenuadas del virus induce protección solamente frente al virus virulento homólogo pero no frente al heterólogo (Mebus. 1988. Ad Virus Res 35:251 -269). Por otra parte, también se han utilizado vacunas basadas en proteínas virales, pero la gran complejidad del VPPA, que codifica por más de 150 proteínas, dificulta la selección de los antígenos virales candidatos para el desarrollo de este tipo de vacunas. No obstante, se ha descrito el potencial de protección de tres proteínas estructurales del virus, p54, p30 y pEP402R (también conocida como CD2 o hemaglutinina), expresadas en un sistema de baculovirus y administradas con adyuvante de Freund's, que inducen anticuerpos neutralizantes y una protección parcial (Ruiz-Gonzalvo et al. 1996. Virol 218:285-289; Gómez-Puertas et al. 1998. Virol 243:461 -471 ).

En relación a la producción de virus recombinantes deficientes en replicación, se han producido virus derivados de la cepa atenuada BA71 V (adaptada a crecer en células Vero) pero no se ha podido realizar ningún estudio inmunológico con dichos virus ni con las partículas vacías derivadas de estos, porque no son patogénicos (Zsak et al. 2001 . J Virol 75:3066-3076). Por lo tanto, es imposible la utilización de virus derivados de la cepa BA71 V como componentes de una vacuna frente al VPPA que produzca una respuesta inmune efectiva in vivo. Por otra parte, para la producción de dichos virus derivados de la cepa atenuada BA71 V, se han producido estirpes del VPPA deficientes en replicación mediante la expresión condicional de ciertos genes virales requeridos para la morfogénesis y encapsidación del genoma. Para ello, los genes virales se situaron bajo el control de un promotor inducible por IPTG (ísopropil-B-D-1 -tíogalactopiranósido), medíante la introducción en el genoma viral del sistema represor/operador del operón lac de Escherichia coli (García- Escudero et al. 1998. J Virol 72:3185-3195). De esta manera, se han construido virus atenuados BA71 V con represión de las poliproteínas pp220 (Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666), pp62 (Suárez et al. 2010. J Virol 84:176-187) y de la proteína pB438L (Epifano et al. 2006. J Virol 80:1 1456-1 1466). En estos estudios se ha observado que, cuando no se añade IPTG durante el proceso de producción viral, no se expresan las proteínas reguladas por el promotor inducible y se generan partículas virales vacías, en el caso de la represión de pp220 o pp62, de estructura icosaédrica y carentes de los dominios internos del virus y del DNA y, en el caso de la represión de pB438L, estructuras tubulares carentes de DNA. En todos estos casos, las partículas virales aberrantes no son infecciosas al carecer de DNA, pero contienen los dominios externos (envuelta interna y cápsida) y pueden salir eficazmente de la célula infectada.

Otros virus recombinantes construidos utilizando la cepa atenuada y no patogénica BA71 V son virus que no expresan genes dispensables para la replicación pero importantes para la virulencia y para la inhibición de la respuesta inmune del hospedador. Es el caso de los virus que no expresan el gen de la timidina quinasa (TK) generados mediante la introducción de un cassette de represor+selección en el locus de este gen (Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666). Mediante la introducción del cassette se elimina la expresión de la TK y se seleccionan los recombinantes. Este sistema se ha utilizado para generar virus TK- mediante la introducción en el locus de TK del gen lac I del represor Lac, bajo el control del promotor viral pU104 y, como marcador de selección, el gen gusA (gen de la β-glucuronidasa) bajo el control del promotor viral p72. También se han creado virus que no expresan la proteína homologa del receptor de adhesión CD2, una proteína estructural presente en los dominios externos del virus y que actúa como inmunosupresor (dificulta la respuesta inmune del organismo infectado), introduciendo el gen LacZ mediante recombinación homologa bajo el control de p72, rompiendo así el marco de lectura del gen EP402R que codifica por la CD2 (Rodríguez et al. 1993. J Virol 67:5312-5320; Ruiz-Gonzalvo et al. 1996. Virology 218:285-298). Nuevamente, en ninguno de estos casos se pudieron realizar estudios inmunológicos in vivo ya que estos virus deficientes en genes dispensables para la replicación derivaban de la cepa no patogénica BA7 V.

La producción de virus recombinantes deficientes en replicación que además no expresan alguno de los genes dispensables para la replicación, como el gen de la TK, se ha realizado hasta la fecha también en virus de la cepa atenuada BA71 V, haciendo imposible su uso en vacunación (Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666, Suárez et al. 2010. J Virol 84:176-187 y Epifano et al. 2006. J Virol 80:1 1456-1 1466, respectivamente). Es el caso de virus TK- e índucíbles en el gen de la pp220 (virus BA71 V.v220i.TK-) (Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666), en el de la pp62 (virus BA71 V.v62i.TK-) (Suárez et al. 2010. J Vírol 84:176-187) y en el de la pB438L (virus BA71 V.vB438Li.TK-) (Epifano et al. 2006. J Virol 80:1 1456-1 1466). Las herramientas para ia generación de los mismos fueron las siguientes: la represión de la expresión de TK mediante la introducción del cassette de represor+selección compuesto por el gen /acl bajo el control del promotor viral pU104 y el gen marcador gusA bajo el control del promotor viral p72 y la sustitución de los promotores origínales de los genes de pp220, pp62 y pB438L por el promotor inducible por IPTG p72.l compuesto por el promotor tardío p72.4 y la secuencia del operador del operón lac de E. co/ ; y además del gen marcador lacZ para la selección de los recombinantes. En ninguno de los casos se han utilizado los virus o las partículas virales aberrantes que se generan en ausencia de inductor en inmunización para el VPPA. La cepa atenuada BA71 V derivada de la cepa patogénica BA71 (la cepa utilizada en la invención y que es de libre acceso al público), se generó tras su adaptación a células Vero, y su genoma está secuenciado (Yáñez et al. 1995. Virology 208:249-278). Las dos cepas difieren en los extremos del DNA, ya que BA71 V contiene dos deleciones de 2.5 y 7 kb de longitud en dichas regiones terminales (Blasco et al. 1989. Virology 1 68:330-338). Además, en la cepa BA71 V se han descrito deleciones significativas en la región terminal izquierda (LVR) que contiene genes de los miembros de las familias multigénicas MGF360 y de la MGF530. Estos genes son esenciales en la supervivencia de las células infectadas e importantes en la patogénesis y virulencia (Zsak et al. 2001 . J Vírol 75:3066-3076). La comparación de mapas de restricción entre 23 aislados virales de VPPA reveló que el genoma viral se mantiene constante en la zona central (de 125 kb de longitud) mientras que existen dos regiones variables en los extremos, de 38-47 kb en el extremo izquierdo y de 13-16 kb en el extremo derecho (Blasco et al. 1989. Virology 68:330-338). Como se ha señalado anteriormente, los virus recombinantes deficientes en replicación derivados de la cepa atenuada BA71 V no han sido utilizados en vacunación in vivo al no ser virus infectivos. Dado que ninguno de los abordajes que se han utilizado hasta el momento han conseguido generar una vacuna eficaz contra el VPPA, se hace necesario un nuevo enfoque para el desarrollo de una nueva vacuna efectiva. EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a virus recombinantes deficientes en replicación derivados de la cepa virulenta o patogénica BA71 , a las partículas vacías que se generan en cultivos de células aisladas infectadas por estos virus recombinantes en condiciones de represión y al uso de ambas para la elaboración de un medicamento, preferiblemente una vacuna frente al virus de la peste porcina africana. Esta invención ofrece una alternativa novedosa a los tratamientos actuales frente a la peste porcina africana al ser capaz de generar una respuesta inmunológica en el animal capaz de inducir una protección eficaz frente al virus.

Los virus recombinantes de la presente invención deficientes en replicación derivados de la cepa patogénica BA71 poseen ciertos genes vírales situados bajo el control de un promotor inducible que permite su expresión condicional. De este modo, en condiciones de represión, se generan virus defectivos sin DNA, pero con todos los dominios extemos de la partícula viral y que pueden salir eficazmente de la célula infectada. Así, la infección con estos virus inducibles mimetiza una infección normal, sintetizándose todas las proteínas virales, excepto aquellas cuya expresión está reprimida en el virus recombinante, y se puede por tanto inducir una fuerte respuesta inmune. En este sentido, presentan una clara ventaja frente a la utilización como antígenos de proteínas virales individuales o en determinadas combinaciones. Respecto a la utilización de virus atenuados, estos virus recombinantes inducibles presentan mayor seguridad, dado que las partículas vírales producidas no son infectivas, y hay un solo ciclo de replicación. Además, el sistema de la invención es compatible con la deleción de otros genes virales, como aquellos implicados en el control de la respuesta inmune por parte del virus, en la virulencia o en la reparación del DNA, lo que aumentaría la eficiencia y seguridad de la vacuna.

Dado que la cepa virulenta BA71 presenta con respecto a la no patogénica BA71 V diferencias en los extremos del DNA, pero no hay diferencias en las zonas necesarias para la generación de los virus recombinantes, se han podido utilizar las mismas herramientas descritas en la generación de virus deficientes en replicación derivados de BA71 V descritas anteriormente. Así, se han podido construir virus patogénicos que pueden crecerse en células aisladas en presencia del inductor (IPTG), pero que, una vez han infectado al hospedador, al no haber inductor son defectivos en su replicación, únicamente generan partículas virales vacías, siendo por lo tanto muy seguros como vacunas potenciales. Una ventaja adicional de la cepa BA71 es que puede crecer y formar placas de lisis en células COS (ATCC, CRL-1650™), una línea celular que puede ser transfectada muy eficazmente, lo que es muy útil para la construcción de los virus recombinantes por recombínación homologa. Además, el virus producido en estas células conserva su virulencia, incluso después del alto número de pases que se requieren para la construcción y purificación del virus recombinante. De este modo, se ha conseguido generar con éxito una vacuna que comprende virus recombinantes deficientes en replicación derivados de la cepa patogénica BA71 capaces de infectar in vivo y de generar una respuesta inmune efectiva, lo que es imposible en los virus derivados de la cepa atenuada BA71 V. Además, se han generado partículas virales vacías de dichos virus para su uso en vacunación frente a aislados virulentos del VPPA que, al ser derivadas del virus patogénico, mimetizan los antígenos virales de éste y serían más efectivas que las vacunas de proteínas recombinantes desarrolladas previamente, al incluir muchas de las proteínas estructurales del virus.

Los virus recombinantes de la presente invención expresan de modo inducible uno o varios de los genes pp220, pp62 y pB438L y además tienen reprimida la expresión de genes implicados en el control de la respuesta inmune por parte del virus o en la virulencia, tales como el gen de la timidina quinasa (TK), y/o el homólogo del receptor de adhesión CD2 (CD2); y/o el gen de reparación de la DNA polimerasa X (pol X) para conferirles mayor seguridad. Así, un primer aspecto de la invención se refiere a un virus recombínante caracterizado porque se obtiene a partir de la cepa virulenta BA71 del virus de la peste porcina africana y porque es deficiente en la replicación del virus (en adelante, "virus de la invención"). El término "Virus de la Peste Porcina Africana", también llamado en la literatura "VPPA", "ASFV", "African Swine Fever Virus ^" , se refiere a un virus de DNA de cadena doble con envoltura de la familia Asfarvirídae que infecta, entre otros, a animales de la familia Suidae. La cepa BA71 se refiere al virus de la peste porcina africana aislada en Badajoz en 1971 que es altamente virulenta y cuyo DNA contiene 178 kpb {Enjuanes et al. 1976. J Gen Virol 32: 471 -477). Actualmente, la secuencia del genoma de la cepa BA71 no está publicada. La cepa BA71 es de acceso libre al público.

Los virus de la invención se han generado mediante la modificación del genoma viral para permitir la expresión inducible de uno o varios de los genes que codifican las proteínas pp220, pp62 o pB438L, respectivamente. Por lo que una realización preferida de la invención se refiere al virus de la invención que tiene reprimida la expresión de al menos un gen que codifica para la proteína seleccionada de la lista que comprende la poliproteína pp220, la poliproteína pp62 y la proteína pB438L.

La poliproteína pp220 en la presente invención se refiere a la poliproteína codificada por la cepa BA71 que es homologa a la pp220 codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La pp220 de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 1 (número de acceso NP_042785.1 ) El término "proteína homologa" se refiere a aquella proteína que tiene una secuencia similar y que ejerce igual función en el virus de la peste porcina africana, independientemente de la cepa del virus. En la presente invención, se refiere a las proteínas de la cepa BA71 que tienen una secuencia de aminoácidos similar a las de la cepa BA71 V, donde secuencia similar se refiere a una secuencia con una similitud superior al 95%, que realizan la misma función en el virus.

Así, una realización más preferida se refiere a los virus de la invención donde el gen reprimido es el que codifica para la poliproteína pp220.

La poliproteína pp62 en la presente invención se refiere a la poliproteína codificada por la cepa BA71 que es homologa a la pp62 codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La pp62 de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 2 (número de acceso NP_042787).

Así, otra realización más preferida de la invención se refiere a los virus de la invención donde el gen reprimido es el que codifica para la poliproteína pp62. La proteína pB438L en la presente invención se refiere a la proteína codificada por la cepa BA71 que es homologa a la pB438L codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La pB438L de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 3 (número de acceso NP_042769.1 ). Así, otra realización más preferida se refiere a los virus de la invención donde el gen reprimido es el que codifica para la proteína pB438L.

La expresión inducible de los genes que codifican las poliproteínas pp220 o pp62 o la proteína pB438L se ha realizado mediante la sustitución del promotor original de estos genes por el promotor inducible p72.l formado por el promotor viral tardío p72.4 y la secuencia del operador O _? del operón Lac de E. coli. En esta invención también se puede utilizar el promotor inducible ρ74. que se diferencia del p74.l en la distancia desde la secuencia operadora hasta el inicio de la transcripción del gen índucíble (2 y 8 bases, respectivamente). Ambos promotores son inducibles por IPTG. La presente invención también se refiere a virus de la invención donde los genes son inducidos por otros inductores, por ejemplo tetraciclina, y que contienen promotores inducibles por los mismos.

Por lo que una realización aún más preferida de la invención se refiere al virus de la invención donde dicho virus comprende una construcción genética que comprende un promotor inducible capaz de dirigir dicha represión.

Una construcción genética se entiende como una secuencia de nucleótidos que comprende la secuencia codificante del virus de la invención operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia, y con otras secuencias necesarias o apropiadas para regular su transcripción, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, señal de poliadenilacíón, origen de replicación, activadores transcripcionales {enhancers), silenciadores transcripcionales {silencers), etc.

Un promotor es una secuencia de nucleótidos que controla la transcripción de un gen dado. El término "índucíble", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a la posibilidad de que el promotor tenga un elemento de control que permita activar o desactivar (reprimir) la transcripción del gen que regula, en presencia de un factor externo al promotor, como por ejemplo, la adición de una sustancia al medio de cultivo en el que crece el organismo que contiene el virus de la invención. Un promotor inducible por IPTG es aquel que presenta los elementos necesarios para que la transcripción se produzca únicamente en presencia de esta sustancia.

Los virus recombínantes contienen asimismo al menos un gen de selección (lacZ que codifica para la β-Galactosidasa u otro gen de selección) bajo el control del promotor viral p72. Así, en otra realización aún más preferida los virus de la invención además comprenden al menos un gen de selección. El término "gen de selección", tal y como se emplea en la presente descripción, se refiere a un gen que codifica para una proteína que confiere una característica al organismo en el que se expresa dicho gen y que no se encuentra en dicho organismo de forma natural, como puede ser que sobreviva a la presencia de un antibiótico, que produzca una sustancia coloreada en presencia de un reactivo determinado o que emita luz. Un gen de resistencia a antibiótico codifica para una proteína que confiere a la célula que la expresa, que normalmente sería sensible al antibiótico, la capacidad de superar el efecto del antibiótico. Dicha proteína suele ser un enzima que inactiva el antibiótico en cuestión.

Por lo que otra realización aún más preferida de la invención se refiere al virus de la invención donde dicho virus comprende una construcción genética que comprende al menos un gen de selección.

Otra realización aún más preferida se refiere a los virus de la invención donde dicho virus comprende una construcción genética que comprende un promotor inducible capaz de dirigir dicha represión donde el promotor es inducible por IPTG.

Para aumentar la segundad de los virus de la invención, se ha dispuesto de mecanismos de protección frente a una posible modificación genética (reversión) que los pudiera convertir en virus capaces de replicar. El mecanismo para lograrlo se basa en la represión constitutiva bien de genes implicados en la virulencia (particularmente, el gen de la timidina quínasa), bien de genes que participan en inmunosupresion (particularmente, el gen EP402R que codifica para la CD2) o de genes que participan en la reparación del DNA (como el gen 0174L que codifica para la DNA polimerasa X). En todos ellos ha sido posible utilizar las herramientas descritas anteriormente para la generación de los virus deficientes en replicación derivados de BA71 V ya que no está descrito que existan diferencias significativas entre esta cepa y la cepa de la invención en estos genes dispensables para la replicación. Por recombinación homologa se ha introducido en los genes cuya expresión se quiere reprimir constitutivamente el cassette represor+selección que contiene (i) el gen del represor Lac I del operón Lac de E. coli bajo el control del promotor temprano/tardío del gen U104L (pU104) del VPPA y (íi) el marcador p72GUS, que consiste en el gen de la β-glucuronidasa (β-Gus o gusA) bajo el control del promotor p72 del gen de la proteína p72. Además, la presente invención también admite la deleción de la expresión de genes dispensables para la replicación mediante inserción de un gen de selección (por ejemplo GFP o EGFP, que codifican por la proteína fluorescente verde y la proteína fluorescente verde mejorada ("green fluorescent protein" o "enhanced green fluorescent protein", respectivamente) que interrumpa el marco de lectura del gen dispensable para la replicación. De este modo se han generado virus atenuados (los virus TK-), virus sin inmunosupresores, y que por tanto favorecen la respuesta inmune del hospedador (los virus CD2-) y virus que tienen alterado el sistema de reparación del DNA (los virus pol X-).

La timidina quinasa (TK) en la presente invención se refiere a la proteína codificada por la cepa BA71 que es homologa a la timidina quinasa codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La timidina quinasa de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 4 (número de acceso NP_042744.1 ).

La CD2 (también llamado "homólogo del receptor de adhesión CD2" o "hemaglutinina") en la presente invención se refiere a la proteína codificada por el gen EP402R por la cepa BA71 que es homologa a la CD2 codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La CD2 de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 5 (número de acceso NP__042752.1 ).

La polimerasa X (pol X, "DNA polimerase beta-like protein ^" ) en la presente invención se refiere a la proteína codificada por el gen 0174L por la cepa BA71 que es homologa a la pol X codificada por la cepa BA71 V o a variaciones funcionales de la misma. La pol X de la cepa BA71 V se refiere a la SEQ ID NO: 6 (número de acceso NP_042790.1 ). Por todo esto, un aspecto de la invención se refiere a un virus de la invención que además no expresa al menos un gen dispensable para la repiicación. Preferentemente, los genes dispensables para ia repiicación comprenden al menos un gen que se selecciona de la lista que comprende: gen que participa en la virulencia del virus, gen que participa en inmunosupresíón, y gen que participa en la reparación del DNA. Más preferentemente el gen dispensable para ia repiicación se selecciona de ia lista que comprende: el gen de la timidina quinasa, el gen EP402R y el gen 0174L, o cualquiera de sus combinaciones. Una realización más preferida se refiere al virus de la invención donde los genes dispensables para la repiicación están reprimidos porque tienen variado su marco de lectura y no expresan una proteína viable.

También forman parte de la invención las construcciones genéticas de DNA que codifican secuencias del virus recombinante de la invención. Dicha construcción genética de DNA dirigiría la transcripción intracelular de la secuencia del virus o fragmento del mismo, y comprende, al menos, uno de los siguientes tipos de secuencias: a) secuencia de DNA que comprende, al menos, la secuencia codificante del virus de la invención para su transcripción intracelular, b) un cassette de expresión que comprende la secuencia de DNA definida en a) unido operativamente a elementos de control de la transcripción y opcionalmente de traducción; c) secuencia de DNA correspondiente a un sistema o vector de expresión géníca que comprende la secuencia codificante del virus de la invención, operativamente enlazada con, al menos, un promotor que dirija la transcripción de dicha secuencia, y con otras secuencias para regular su transcripción tales como, por ejemplo, señales de inicio y terminación, sitios de corte, o señal de poliadenilación, donde preferentemente el vector es un plásmido.

Otro aspecto de la invención se refiere a la célula hospedadora que comprende el ácido nucleico, el cassette de expresión o el vector que codifican secuencias del virus de la invención, donde la célula preferentemente es una célula de mamífero (no perteneciente al grupo de las células embrionarias o germinales humanas), de insecto, de levadura o bacteria. La introducción de dichas construcciones génicas se puede realizar con los métodos conocidos en el estado de la técnica. También se refiere al método de producción del virus de la invención que comprende cultivar dichas células hospedadoras.

Otra realización preferida se refiere al uso de los virus de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica.

El término "composición farmacéutica" en esta memoria hace referencia a cualquier sustancia usada para prevención, diagnóstico, alivio, tratamiento o curación de enfermedades. En el contexto de la presente invención se refiere a una composición que comprenda al menos los virus de la invención.

Una realización más preferida se refiere al uso del virus de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de la peste porcina africana, preferiblemente para la profilaxis de la peste porcina africana.

La composición farmacéutica de la invención puede utilizarse tanto sola como en combinación con otras composiciones para el tratamiento o prevención de la peste porcina africana.

"Tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al profiláctico o medidas preventivas. Aquellas necesarias de tratamiento incluyen las ya asociadas con alteraciones así como en aquellas en las que se previene la alteración. Una "alteración" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la composición de la invención, tal y como se describe en el presente documento.

Una realización aún más preferida de la invención se refiere al uso del virus de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis de la peste porcina africana donde dicha composición farmacéutica es una vacuna. En el contexto de la presente invención el término "vacuna" se refiere a una preparación antigénica empleada para provocar una respuesta del sistema inmune a la enfermedad causada por un virus de la peste porcina africana. Es un preparado de antígenos que, una vez dentro del organismo, provoca la respuesta del sistema inmunitarío medíante la producción de anticuerpos, y genera memoria inmunológica produciendo inmunidad permanente o transitoria.

Otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna frente al virus de la peste porcina africana que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva del virus de la invención.

En el sentido utilizado en esta descripción, la expresión "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a la cantidad de agentes moduladores calculada para producir el efecto deseado y, en general, vendrá determinada, entre otras causas, por las características propias de dichos agentes (y construcciones) y el efecto terapéutico a conseguir. Los adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables que pueden ser utilizados en dichas composiciones son los vehículos conocidos por los técnicos en la materia.

En una realización aún más preferida, la vacuna que comprende el virus de la invención además comprende, al menos, un excipiente y/o al menos, un vehículo farmacológicamente aceptables. El término "excipiente" hace referencia a una sustancia que ayuda a la absorción de la vacuna que contiene el virus de la invención, estabiliza dicha vacuna o ayuda a la preparación de la composición farmacéutica en el sentido de darle una consistencia, forma, sabor o cualquier otra característica funcional específica. Así pues, los excipientes podrían tener la función de mantener los ingredientes unidos como por ejemplo almidones, azúcares o celulosas, función de endulzar, función de colorante, función de protección del medicamento como por ejemplo para aislarlo del aire y/o la humedad, función de relleno de una pastilla, cápsula o cualquier otra forma de presentación como por ejemplo el fosfato de calcio dibásico, función desintegradora para facilitar la disolución de los componentes y su absorción en el intestino, sin excluir otro tipo de excipientes no mencionados en este párrafo.

Un "vehículo farmacológicamente aceptable" se refiere a aquellas sustancias, o combinación de sustancias, conocidas en el sector farmacéutico, utilizadas en la elaboración de formas farmacéuticas de administración e incluye, pero sin limitarse, sólidos, líquidos, disolventes o tensíoactivos. El vehículo puede ser una sustancia inerte o de acción análoga a cualquiera de los compuestos de la presente invención y cuya función es facilitar la incorporación del fármaco así como también de otros compuestos, permitir una mejor dosificación y administración o dar consistencia y forma a la composición farmacéutica. Cuando la forma de presentación es líquida, el vehículo es el diluyente. El término "farmacológicamente aceptable" se refiere a que el compuesto al que hace referencia esté permitido y evaluado de modo que no cause daño a los organismos a los que se administra.

Así, la composición farmacéutica o vacuna proporcionada por esta invención puede ser facilitada por cualquier vía de administración, para lo cual dicha composición se formulará en la forma farmacéutica adecuada a la vía de administración elegida.

En una realización más preferida de la invención, la vacuna que contiene los virus de la invención comprende al menos otro principio activo.

La presente invención también se refiere al uso de la vacuna que contiene el virus de la invención para la fabricación de una composición farmacéutica para la profilaxis de animales mamíferos, preferentemente de la familia Suidae, por ejemplo cerdos. Como se ha explicado anteriormente, en condiciones de represión (es decir, en ausencia del inductor del promotor bajo cuyo control se han colocado ciertos genes virales) los virus de la invención son capaces de infectar la célula huésped pero no de producir virus completos, y las partículas virales que salen de la célula están vacías, ya que carecen del DNA. Por lo tanto en una infección in vivo con los virus de la invención se producen de forma natural dichas partículas virales vacías en el interior del animal infectado al tratarse éste de un sistema que carece del inductor. Como estas partículas virales vacías poseen todos los dominios externos (envuelta interna, cápsída y envuelta extema) podrían participar en la generación de la respuesta inmune observada frente al VPPA en el animal infectado por los virus de la invención. De esta manera podrían constituir una herramienta alternativa y/o complementaría para el tratamiento de la peste porcina africana. Así, una realización preferida es el procedimiento para la obtención de partículas virales vacías (de ahora en adelante, "partículas virales de la invención") que comprende la infección de células aisladas con el virus recombinante de la invención en ausencia del agente inductor del promotor que controla los genes virales cuya transcripción se desea reprimir.

Se entiende por "infección" en la presente invención aquella patología generada por la invasión o colonización de cualquier tejido de un hospedador por parte del virus de la peste porcina africana. La "infección de células aisladas" se entiende que es una infección in vitro en la que la células aisladas infectadas por el virus de la invención son deprivadas del inductor para la correcta generación de las partículas virales vacías.

Se entiende en esta memoria el término "célula aislada" aquella célula cultivada in vitro para la producción de las partículas vírales vacías cuando no son cultivadas con el agente inductor o para la producción de los virus recombinantes de la invención cuando son cultivadas con el inductor. Las células aisladas son preferentemente líneas celulares. Una realización aún más preferida de la invención, se refiere a la partícula viral vacía generada por infección de las células aisladas con los virus de la invención, en adelante "partícula viral de la invención". Otra realización preferida de la invención se refiere al uso de la partícula viral de la invención que se genera por infección por el virus de la invención para la elaboración de una composición farmacéutica, preferiblemente para el tratamiento de la peste porcina africana, más preferiblemente para la profilaxis de la peste porcina africana. Más preferiblemente dicha composición farmacéutica es una vacuna. Dicha vacuna comprende además una cantidad terapéuticamente efectiva de las partículas virales de la invención, y preferiblemente comprende también al menos un adyuvante, un excipiente y/o un vehículo farmacéuticamente aceptables, donde en otra realización aún más preferida el adyuvante es el adyuvante de Freund's, y que además puede comprender al menos otro principio activo.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la vacuna que contiene las partículas virales de la invención frente al virus de la peste porcina africana para la elaboración de una composición farmacéutica para la profilaxis de anímales mamíferos, preferiblemente de la familia Suidae, por ejemplo cerdos.

Los términos "polinucleótido" y el término "ácido nucleico" se refieren a una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucieótidos como desoxirribonucleótidos. Los términos "péptido", "oligopéptido", "polipéptido", "poliproteína" y el término "proteína" se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, cuya secuencia les permite ejercer una función biológícaT

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones, la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes figuras y ejemplos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

DESCRIPCION DE LAS FIGURAS

Figura 1. Ensayo de virulencia de la cepa BA71 crecida en células COS. Se ensayó la virulencia de virus de la cepa BA71 crecido en células COS para comprobar que su virulencia no se veía afectada por su crecimiento en dicha línea celular. A, determinación de la temperatura rectal de cerdos infectados con distintas dosis (10 ⁴ Dl ₅₀ y 100 Dl _50j siendo Dl ₅₀ la dosis infecciosa 50%) de virus BA71 antes (BA71 ) y después (BA71 Cos) de 10 ciclos de proliferación en células COS. dO, día en el que se realizó la inoculación con el virus; d1 -10, días post inoculación. B, ensayo de supervivencia de los cerdos infectados según se ha descrito en A; "n" es el número de anímales en cada grupo.

Figura 2. Construcción del virus recombinante deficiente en replicación, BA71.v220i.TK-. Se construyó el virus BA71 .v220i.TK- que expresa induciblemente la poliproteína pp220 y no es virulento al no expresar la tímidina quinasa (TK), utilizando las herramientas moleculares descritas previamente partiendo de la cepa no patogénica BA71 V. A, esquema del virus BA71 .v220i.TK-. Se aprecia que el gen del represor Lac I y el gen marcador de la β-glucuronidasa (B-gus) se insertan en el locus de la TK para generar el virus intermedio BA71 .vGUSREP.TK-. A partir de éste, se obtiene el virus BA71 .v220i.TK- situando el gen de la poliproteína pp220 bajo el control del promotor inducible p72.L Un gen marcador, lac Z, que codifica para la B- galactosidasa permite la selección de los recombinantes. B, Western blot para detectar la expresión de pp220 en células COS tras infección con el virus BA71 .v220i.TK- en presencia (+) o en ausencia (-) del inductor IPTG. Se muestra la ausencia de pp220 en dos clones de células COS infectadas y crecidas en ausencia de IPTG (1 y 2) y como la presencia de IPTG en el medio de cultivo resulta en la expresión de pp220. Como control de carga se utilizó la proteína de la cápsida p72. NI, células no infectadas. Figura 3 Construcción dei virus recombinante deficiente en repiicación BA71.v220i.CD2-. Se construyó el virus BA71 .v220i.CD2- que expresa induciblemente pp220 y no expresa la proteína CD2, utilizando las herramientas moleculares descritas previamente partiendo de la cepa no patogénica BA71 V. A, Vector de transferencia para la construcción de los virus CD2- que contiene el cassette represor+selección que contiene el gen lac I bajo el control del promotor constitutivo pU104 del virus, el gen marcador B-gus bajo el control del promotor viral tardío p72 y las regiones flanqueantes del gen EP402R (CD2 viral) para la recombinación homologa con BA71 , donde 10T son señales de terminación de la transcripción. Se señalan las dianas de restricción utilizadas: Spe\ y Af B, esquema del virus BA71 .v220i.CD2- El gen de la poliproteína pp220 se sitúa bajo el control del promotor inducible p72.i. Un gen marcador, lac Z, que codifica para la B-galactosídasa permite la selección de los recombinantes. Se aprecia que el gen del represor Lac I y el gen marcador de la B-glucuronidasa { B-gus) se insertan en el locus del gen de CD2 bajo el control de los promotores pU104 y p72, respectivamente. Figura 4. Construcción del virus recombinante deficiente en replicación BA71.v220i.CD2-.PolX-. Se construyó el virus BA71 .v220i.CD2-.PolX- utilizando las herramientas descritas previamente para los virus recombinantes deficientes en replicación derivados de la cepa no patogénica BA71 V. En una primera fase se generó el virus intermedio BA71 .pp220 con el gen de pp220 bajo el control del promotor p72.f y, como gen marcador, lac Z, que codifica para la β-galactosidasa permitiendo la selección de los recombinantes según se ha descrito anteriormente. Posteriormente se insertan el gen del represor Lac I y el gen marcador β-gus o gusA en el locus del gen de la CD2, generándose así el virus BA71 .v220i.CD2-. Partiendo de dicho virus, se deleciona la expresión del gen pol X mediante inserción del gen EGFP {"enhanced green fluorescent protein") bajo el promotor p72. 061R es un gen utilizado en esta construcción para la recombinación homologa. Figura 5. Ensayos inmunológicos con el virus BA71.v220i.TK-. A, ELISA que muestra los niveles de anticuerpos anti-VPPA en cerdos vacunados con 10 ⁵ Dl ₅₀ (P4 a P9), 10 ⁷ Dl ₅₀ {P10 a P15) del virus inducible BA71 .v220.TK- o inoculados con PBS (tampón fosfato salino) como control (P1 a P3), e infectados posteriormente con 10 ³ Dl ₅₀ del virus parental virulento BA71 . El análisis se realizó con muestras obtenidas antes de la inmunización (preinm), tras la primera inmunización (1 st-inmun), tras la segunda inmunización (2nd- inmun) y en los días 3, 5 y 7 después de la segunda inmunización, (d3pí, d5pi y d7pí, respectivamente). La flecha indica que el día en el que se realizó la segunda inmunización también se infectó con 10 ³ Dl ₅₀ del virus parental virulento BA71 . B, ELISPOT que muestra la producción de INF-γ por parte de células T específicas en respuesta a la estimulación in vitro con el virus BA71 .v220.TK- inducible (BA71 índ). Las barras blancas corresponden a la primera vacunación (1 st vac) y las negras a la segunda (2nd vac). C, Ensayo de supervivencia de cerdos vacunados con el virus BA71 .v220i.TK- (BA71 índ) a las mismas concentraciones que en A, o con PBS; "n" es el número de animales en cada grupo. EJEMPLOS DE REALIZACION DE LA INVENCIÓN

Los siguientes ejemplos específicos que se proporcionan en este documento de patente sirven para ilustrar la naturaleza de la presente invención. Estos ejemplos se incluyen solamente con fines ilustrativos y no han de ser interpretados como limitaciones a la invención que aquí se reivindica. Por tanto, los ejemplos descritos más adelante ilustran la invención sin limitar el campo de aplicación de la misma.

EJEMPLO 1 : El virus BA71 conserva la virulencia tras crecimiento células COS.

Dado que para la generación de los virus recombínantes y las partículas virales vacías se utilizan las células COS (ATCC, CRL-1650™), para comprobar que el crecimiento en dichas células no atenúa la cepa virulenta BA71 , se analizó si la virulencia de la cepa BA71 se veía afectada por su proliferación en dichas células.

Para ello, se inocularon 12 cerdos machos de la raza Duroc x Landrace, de tres meses e ínmunológicamente maduros. La inoculación se llevó a cabo después de 5 días de adaptación, utilizando 3 cerdos por dosis y aislado de virus, como se índica en la Tabla 1 . Los cerdos se inocularon intramuscularmente con 2 mi de PBS conteniendo 10 ² ó 10 ⁴ Dl ₅₀ (dosis infecciosa 50%) del aislado virulento BA71 antes (BA71 ) y después (BA71 Cos) de 10 ciclos de proliferación en células COS. Se recogió suero a los 3, 5, 7 y 9 días post-inoculación para titular el virus y se determinó la temperatura rectal (Fig. 1 A) y la supervivencia (Fig. 1 B).

Tabla 1 . Composición de los grupos de inmunización con BA71

10 ² Dl ₅₀ 10 ⁴ Dl ₅₀

BA71 (cerdos 1 -3) (cerdos 4-6)

BA71 Cos (cerdos 7-9) (cerdos 10-12) Como se esperaba, la inoculación con virus de la cepa BA71 fue muy patogénica, causando síntomas clínicos severos, incluyendo fiebre alta desde el día 3 post-inocuiación hasta el final del experimento, e independientemente de la dosis utilizada. Con una dosis de 10 ⁴ Dl ₅₀ del virus BA71 pasado por COS (Ba71 Cos), la enfermedad seguía el mismo curso que con el virus BA71 sin ese pase (BA71 ), aunque con dosis más bajas (10 ² Dl ₅₀ ) algunos cerdos sufrían un ligero retraso en la aparición de los síntomas clínicos, incluyendo la fiebre (Fig. 1 A), y en la disminución de su supervivencia (Fig. 1 B). EJEMPLO 2: Obtención de los virus recombinantes que no expresan ei gen de la timidina quinasa BA71.v220i.TK-, BA71.v62i.TK- y BA71.vB438Li.TK- y en los que la expresión de las proteínas pp220, pp62 y pB438, respectivamente, es inducible. Para obtener estos virus recombinantes deficientes en replicación, timidina quinasa negativos (TK-) a partir de la cepa BA71 se utilizaron las herramientas moleculares descritas anteriormente y en Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654- 2666; Suárez et al. 2010. J Virol 84:176-187; y Epifano et al. 2006. J Virol 80:1 1456-1 1466; con alguna modificación que pasamos a detallar.

Para generar el virus BA71 .v220i.TK-, un virus recombinante atenuado, deficiente en replicación y en el que la expresión de la pp220 es inducible por IPTG, se partió de un virus de la cepa BA71 . Primero se delecionó la expresión de la TK (Fíg.2A) utilizando un cassette represor+selección de recombinacíón homologa que se inserta en el locus de la TK. Este cassette contenía (i) el gen del represor de la lactosa {Lac I) bajo el control del promotor temprano/tardío del gen U104L del VPPA (pU104) y (ií) el marcador p72GUS, que consiste en el gen de la β-glucuronidasa bajo el control del promotor tardío p72 (Fig. 2A). El virus intermedio, BA71 .GUSREP.TK- se purificó mediante rondas sucesivas de proliferación y aislamiento de placas de lisis en células COS hasta su completa pureza. En una segunda fase, se construyó el virus BA71.v220i.TK- inducible en el gen de la poliproteína pp220 a partir del virus intermedio BA71 .GUSREP.TK-, mediante la introducción del gen de pp220 bajo el control del promotor inducible por IPTG ( Z2./), que consiste en el promotor p72, el operador lac de E. coli y el gen tac Z (que codifica la β-galactosidasa utilizada como marcador para seleccionar los virus recombinantes), siguiendo el procedimiento descrito para la construcción de un virus recombínante similar partiendo de la cepa BA71 V descrito en Andrés et al. J Virol 2002. 76:2654- 2666. El virus BA71 .v220i.TK- resultante se purificó mediante rondas sucesivas de aislamiento de placas de lisis en células COS. Para validar la construcción vírica BA71 .v220i.TK-, se determinó la expresión de pp220 en células COS infectadas con este virus y crecidas en medios con y sin IPTG. La expresión de la poliproteína pp220 se examinó por Western blot utilizando anticuerpos específicos (Andrés et al. J Virol 202. 76:2654-2666). Como se muestra en la Fig. 2B, la expresión de pp220 sólo se produce al cultivar las células infectadas en un medio suplementado con IPTG.

Los virus BA71 .v62i.TK- y BA71 .vB438Li.TK- se generaron con las mismas herramientas que para el BA71 .v220i.TK- pero los genes que se regulan por el promotor inducible codifican para la pp62 y la pB438L, respectivamente.

EJEMPLO 3: Obtención del virus inducible BA71.v220i.CD2-.

Para obtener este virus deficiente en replícacíón y que no expresa la proteína CD2 (implicada en la respuesta inmune del hospedador) y en el que la expresión de la pp220 es inducible se utilizaron las herramientas para la elaboración de virus deficientes en replicación aplicadas a la cepa BA71 V descritas en García-Escudero et al. 1998. J Virol 72:3185-3195; Rodrígez et al. 1993. J Virol 67:5312-5320; y Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666; con alguna modificación que pasamos a detallar.

Para generar el virus recombínante deficiente en replicación que carezca de algún gen implicado en la respuesta inmune, primero se construyó un virus con la expresión de la pp220 inducible, partiendo de un virus de la cepa BA71 y colocando el gen de la poliproteína pp220 bajo el control del promotor inducible por IPTG (p72.f) (Fig. 3B). En el virus intermedio BA71 .pp220, se insertó, por recombinación homologa un cassette represor+selección (esencialmente idéntico al empleado para la construcción de los virus TK-) en el gen de la CD2, el EP402R (Fig. 3A), delecionando así su expresión.

EJEMPLO 4: Obtención del virus inducible BA71.v220i.CD2- PolX-. Para obtener este virus recombinante deficiente en replicacion, con expresión de ia DNA polimerasa X y la CD2 delecíonada, y expresión inducible de la pp220 como se ha explicado anteriormente, se utilizaron las herramientas para la elaboración de virus deficientes en replicacion derivados de la cepa BA71 V descritas en García-Escudero et al. 1998. J Virol 72:3185-3195; Rodrígez et al. 1993. J Virol 67:5312-5320; y Andrés et al. 2002. J Virol 76:2654-2666; con alguna modificación que pasamos a detallar.

Para generar una vacuna contra el virus VPPA basada en virus recombinantes deficientes en replicacion que carezcan de un gen implicado en el sistema de reparación del DNA, se construyó otro virus que era TK+ y CD2- y que no expresaba el gen 0174L, que codifica para la DNA polimerasa reparativa, pol X.. La metodología utilizada es la descrita anteriormente. Se siguieron los procedimientos que se han descrito previamente en la presente invención partiendo del virus BA71 .v220i.CD2- que tiene el cassette represor+selección insertado en el gen de la CD2. El virus pol X- se generó introduciendo en el gen de la pol X el gen EGFP, que sirve como marcador de selección, bajo el control del promotor p72, como se muestra en el esquema de la Figura 4.

EJEMPLO 5: Ensayos de inmunización y supervivencia con el virus inducible BA71.v220i.TK-. Para evaluar la actividad de los virus recombinantes deficientes en replicación como vacunas frente a la peste porcina africana, se inmunizaron grupos de cerdos con 10 ⁷ ufp o 10 ⁵ ufp (unidades formadoras de placas) de BA71 .v220i.TK- (seis cerdos por grupo, dos veces en un intervalo de dos semanas) y se compararon los resultados con cerdos control a los que se les inoculó PBS (tres animales). Al mismo tiempo que se inmunizó la segunda vez con el virus BA71 .v220i.TK-, todos los cerdos se infectaron con 10 ³ Dl ₅₀ de virus parental virulento BA71 . Se recogieron muestras de suero y sangre después de cada dosis de vacuna a distintos días después de la infección para estudiar la respuesta humoral y celular inducida mediante un ensayo de ELISA específico para detectar VPPA (Fig. 5A) y un ensayo de ELISPOT (Fig. 5B). Como estímulo específico en el ensayo ELISPOT, se utilizó 10 ⁵ ufp de BA71 .v220i.TK- por millón de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) en un ensayo de 20 h.

Se observó una respuesta humoral significativa en la mayoría de los once cerdos vacunados (9 de 12) a partir del día 7 tras la inoculación con cualquiera de las dos dosis de virus (Fig. 5A). Un animal (P5) presentó respuesta significativa en el segundo día post-inoculación con la dosis más baja. Además, también se observó aumento en el número de células T específicas capaces de secretar interferón-gamma (INF-γ) en respuesta a la estimulación in vitro con el virus BA71 .v220i.TK- (Fig. 5B).

El ensayo de supervivencia reveló que los cerdos inoculados con PBS morían antes del día 7 tras la infección, mientras que el 50% de los cerdos vacunados con la dosis máxima de BA71 .v220i.TK- sobrevivían hasta el día 9 tras la infección (Fig. 5C).

EJEMPLO 6: Obtención de partículas icosaédricas vacías y estructuras virales tubulares. Como ya se ha mencionado, en condiciones represoras (ausencia del inductor IPTG) se producen partículas icosaédricas vacías que contienen los dominios externos del virus (envuelta interna, cápsida y envuelta externa), pero no los internos (dominio intermedio y nucleoide) y por lo tanto carecen también del DNA del virus. Para producir estas partículas virales vacías se infectaron células COS con 0,1 ufp del virus inducible BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- o BA71 .vB438Li.TK- por célula y se cultivaron en ausencia del inductor. Las partículas virales se purificaron del medio por centrifugación en gradiente de Percoll y cromatografía en columnas de Sephacryll (Carrascosa et al. J Virol 1985. 54:337-344). Se obtuvieron partículas virales vacías generadas por represión de pp220, pp62 y pB438L, respectivamente.

MATERIAL Y MÉTODOS EMPLEADOS. Obtención de los virus BA71.v220i.TK-, BA71.v62i.TK- y BA71.vB438Li.TK-

Se infectaron monocapas preconfluentes de células COS (25 placas P150) con el virus BA71 .v220i.TK-, el virus BA71 .v62i.TK- o el virus BA71 .vB438Li.TK-, a una multiplicidad de infección de 0, 1 ufp por célula. Las células se mantenían en medio DMEM con suero fetal de ternera al 2% e IPTG al 1 mM. Después de 2 horas de adsorción del virus a 37 ⁹ C, en un incubador con CO ₂ al 5%, se retiró el inoculo y se añadió medio fresco con IPTG a la misma concentración, incubándose como antes a 37 ^S C hasta que se observó un efecto cítopático total (generalmente después de 48-72 horas). Se recogió el medio de cultivo que contenía el virus extracelular producido y se centrifugó a baja velocidad (rotor Sorvall GS3 a 2500 rpm durante 15 min a 4 ^Q C) para eliminar restos celulares y, a continuación, se centrifugó a alta velocidad (rotor Sorvall GS3 a 6500 rpm durante 8.5 h a 4 ^δ C) para sedimentar el virus. El sedimento se resuspendió en 1 /100 del volumen inicial y se purificó el virus por centrifugación durante 1 h a 4 ⁹ C sobre un colchón de sacarosa al 25 % en PBS, usando un rotor Sorvall SW41 .TÍ a 100.000g. El sedimento obtenido se resuspendió en 1 /500 del volumen inicial y se tituló en células COS en presencia de la misma concentración de IPTG por el método de formación de placas de lisis (Enjuanes et al. 1976. J Gen Vírol 32:471 -477). La concentración del virus se expresa como unidades formadoras de placa (ufp) por mi. Análisis por western bíot

Se lísaron células COS infectadas por BA71 .v220i.TK- en presencia o ausencia del inductor IPTG y se analizaron los niveles de pp220 mediante inmunoblot o western bíot con anticuerpos específicos descritos en Andrés et al. J Virol 202. 76:2654-2666. Se utilizó el anticuerpo frente a p72 como control de carga.

Ensayos de protección y supervivencia tras inmunización con ei virus BA71.v220i.TK-. Se utilizaron cerdos inmunológicamente maduros de la estirpe Duroc x Landrace. Se inmunizaron dos grupos de 6 cerdos dos veces (en un intervalo de dos semanas) con 10 ⁵ y con 10 ⁷ ufp del virus BA71 .v220i.TK-, respectivamente y otros 3 cerdos se inmunizaron con PBS como control del ensayo. Quince días después de la segunda inmunización, todos los cerdos se inocularon por vía intramuscular con 10 ³ ID ₅₀ de virus BA71 . A distintos días después de la inoculación, se obtuvieron muestras de suero y sangre para estudiar la respuesta humoral y celular utilizando un ensayo de ELISA específico de VPPA y un ensayo IFN-y-ELISPOT, respectivamente. Para el ensayo de supervivencia, se comparó la supervivencia de los tres grupos de anímales. Además, también se monítorizó en dichos animales la viremia y los síntomas clínicos de la enfermedad tales como fiebre anorexia, letargía y temblores.

Determinación de anticuerpos frente ai VPPA en ei suero de cerdos vacunados mediante ELISA La determinación de la presencia de anticuerpos específicos frente al VPPA en el suero de cerdos vacunados se realizó como se describe en Díaz y Mateu. 2005. Vet Immunol lmmunopathol.106:107-12, utilizando antígeno soluble obtenido a partir de células infectadas con VPPA (Escribano et al. 1989. Am J Vet Res 50:1 1 18-1 122).

Cada pocilio de una placa de ELISA de 96 pocilios se tapiza durante 12 horas a 4 ^s C con 100 μΙ de la proteína correspondiente diluida {5 Mg/ml) en tampón carbonato-bicarbonato pH 9,6, y se incuba durante 12 horas a 4 ⁹ C. Tras lavar 3 veces las placas con PBS-Tween 20 al 0,05% (v/v), éstas se bloquean con 100 μΙ de PBS-1 % albúmina sérica bovina (BSA) durante 1 hora a 37 ^S C. Se añaden las muestras de suero a las diluciones pertinentes a cada pocilio y se incuban 1 hora a 37 ⁹ C, tras lo cual se lavan las placas y se añade el anticuerpo secundario conjugado a peroxidasa (anti-lgG de cerdo a 1 :20000; Sigma), y se incuban 1 hora a 37 ^Q C. Tras los últimos lavados, las placas fueron reveladas utilizando TMB soluble (Calbiochem) como sustrato, parando la reacción con ácido sulfúrico 3N. Los resultados obtenidos para cada reacción se representan como la absorbancia de la solución de cada pocilio a una longitud de onda de 405nm.

Obtención de PBMCs (células mononucieares de sangre periférica) para el ensayo de ELISPOT

Las PBMCs se purificaron a partir de sangre recogida en presencia del anticoagulante EDTA (2,5 mM), utilizando un gradiente de densidad sobre Histopaque 1077 (Sigma). Se depositaron 20 mi de sangre diluida 1 :1 con PBS sobre un colchón de 4 mi de Histopaque 1077 y, tras su centrifugación durante 30 minutos a 500xg, se recogió la interfase entre el plasma y el Histopaque, que contiene las PBMCs y a continuación se lisaron los eritrocitos. ELISPOT

La cantidad de células secretoras de IFNy porcino específicas frente al VPPA se determinó mediante un ensayo de ELISPOT siguiendo el método descrito en Díaz and Mateu. 2005. Vet Immunol Immunopathol 106:107-12. Para ello, se tapizaron placas de 96 pocilios (Costar 3590, Corning) con 50 μΙ/pocillo de un anticuerpo anti-IFNy porcino (BD Pharmingen, clon P2G10) a una dilución 1 :100 en tampón carbonato-bicarbonato pH 9,6, durante 14 horas a 4 ^S C. Tras lavar 3 veces con PBS-1 % Tween 20 y bloquear las placas con medio RPMI completo durante 1 hora a 37 ^e C, se añadieron 5 x 10 ⁵ PBMCs en cada pocilio en ausencia o presencia de los estímulos correspondientes y en un volumen total de 200 μΙ de medio por pocilio. Como estímulo específico se utilizó 10 ⁵ ufp del virus BA71 .v220i.TK- por millón de PBMCs. Como control positivo de estimulación, se utilizó fitohemaglutinina (10 Mg/ml). Tras 20 horas de estimulación a 37 ^e C las células se retiraron y tras extensos lavados, se procedió a realizar la inmuno-tinción. Para ello, se utilizaron 50μΙ/ροοϊΙΙο de un anticuerpo anti-IFNy porcino biotinilado {BD Pharmingen) diluido 1 :1000 en PBS, y, tras 1 hora de incubación a 37 ^S C, se añadió estreptavidina-peroxidasa (Biosource) diluida a 0,5 Mg/ml, como anticuerpo secundario. Finalmente, la reacción fue revelada utilizando como sustrato TMB insoluble (Calbiochem). Los resultados obtenidos con el ELISPOT se representan como el número de células secretoras de IFNy por cada millón de PBMCs, una vez sustraídos los valores obtenidos a partir de los pocilios control sin estimulo (medio solo). En todos los caso, los experimentos con los estímulos se hicieron por triplicado.

Producción, expansión y purificación de ias partículas virales vacías BA71.v220i.TK-, BA71.v62i.TK- y BA71.pB438L.TK- en células COS

Se infectaron células COS crecidas en medio DMEM con suero fetal de ternera al 2% en ausencia del inductor IPTG a una concentración de 0, 1 ufp/célula de los virus BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- y BA71 .pB438L.TK-. Las partículas virales vacías se purificaron según se ha descrito para purificar los virus BA71 .v220i.TK-, BA71 .v62i.TK- y BA71 .vB438Li.TK-.