La présente invention concerne un procédé de production de polysaccharide K5, mettant en œuvre une étape de fermentation à partir d'Escherichia coli puis une étape de purification.

Des procédés d' obtention du polysaccharide K5 sont connus. Il peut être obtenu à partir de souches d'E. coli responsables d'infections extra-intestinales.

Le polysaccharide K5 est composé en quantités équimoléculaires d'acide glucuronique et de N- acétylglucosamine, qui constituent l'unité de base 4- beta-glucuronil-1, 4 alpha-N-acetylglucosamine répétée linéairement dans la chaîne de polysaccharide K5.

Cette unité de base présente une analogie structurale avec l'héparine complètement désulfatée et N-acétylée, ce qui permet d'envisager une alternative très intéressante à l'obtention d'héparine par extraction d'organes animaux, à savoir la production d'héparine par modification chimique du polysaccharide K5 produit par fermentation.

L'héparine obtenue par biosynthèse est préparée de la façon suivante : le microorganisme E. coli est cultivé pour obtenir le polysaccharide K5, qui est ensuite traité chimiquement pour obtenir l'héparine. Des méthodes de préparation de l'héparine à partir de polysaccharide K5 sont décrites [Biochem J. , 1991, 275 (l) :151-8 ; WO 92/17507 ; Semin. Thromb. Hemost. , 2001, 27 (5) : 437- 43 ; Nat. Biotech. , 2003, 21 (11) : 1343-46) . De façon générale, pour une synthèse d'héparine à partir du polysaccharide K5, il faut prévoir des étapes de désacétylation et N-resulfatation, C-5 épimérisation et O-sulfatation.

L'héparine est utilisée notamment pour ses propriétés anticoagulantes et antithrombotiques. L'héparine présente cependant des inconvénients qui limitent les conditions de son utilisation. En particulier, son activité anticoagulante importante (alla) peut occasionner des hémorragies {Semin. Thromb. Hemost., 5 sup. 3, 1999) . Selon l'invention, par voie de dépolymérisation enzymatique ou chimique, il est possible par exemple d'obtenir à partir de l'héparine hemisynthétique des héparines de bas poids moléculaire (3000-6500 Da) ou encore des héparines de très bas poids moléculaire (1500- 3000 Da) pour lesquelles les activités AntiXa sont notamment comprises entre 140 et 190 Ul/mg pour des activités anti lia inférieure à 5 Ul/mg.

De nombreuses méthodes de préparation du polysaccharide K5 sont décrites dans l'art antérieur {Eur. J. Biochem, 1981, 116 : 359-364; EP0489 647, WO01/02597, Eur. J. Biochem, 1988, 117 : 112-125) . Elles comprennent notamment une étape de fermentation ά'E. coli consistant en une seule phase de croissance en glucose à 370C suivie d'une étape de purification du polysaccharide K5 consistant essentiellement en un passage sur colonne échangeuse d'ions. Quant à elle, l'étape de fermentation du procédé selon la présente invention comprend plusieurs phases de croissance, dont au moins une avec alimentation, et une phase de refroidissement, qui permettent d'obtenir, en combinaison avec l'étape de purification, des rendements jusqu'à dix fois supérieurs à ceux décrits dans l'art antérieur. En effet, les méthodes de biosynthèse de polysaccharide K5 décrites dans l'art antérieur par fermentation d'E. coli présentent toutes l'inconvénient d'avoir un très faible rendement. Par exemple, la production de polysaccharide K5 sous forme extracellulaire selon l'art antérieur ne permet d' obtenir un polysaccharide K5 isolé qu'avec des rendements de 200 à 850 mg/1. Des rendements si faibles ne permettent pas d'envisager une production industrielle de polysaccharide K5 puis, par hemisynthèse, d'héparine hemi-synthétique. Or il existe un besoin important d'obtenir de l'héparine et également des héparines de bas poids moléculaire ou de très bas poids moléculaire d'origine non animale.

L'invention a donc pour objet une nouvelle méthode de préparation du polysaccharide K5 sous forme extracellulaire.

Le procédé selon l'invention comprend essentiellement deux étapes : une étape de fermentation et une étape de purification.

Selon le procédé selon l'invention, il est possible d'obtenir des concentrations en polysaccharide K5 jusqu'à dix fois supérieures à celles obtenues avec les méthodes décrites dans l'art antérieur. On peut ainsi obtenir selon l'invention jusqu'à 10 g/1 de polysaccharide K5. L'obtention de telles concentrations est liée à la combinaison des étapes de fermentation et de purification.

L'invention a pour objet un procédé de préparation du polysaccharide K5 comprenant : — une étape de fermentation, pouvant se faire en fermenteur, d'une souche d'Escherichia coli qui produit du polysaccharide K5, comprenant : — une phase de croissance en mode discontinu, - une ou plusieurs phases de croissance en mode discontinu avec alimentation, — une phase de refroidissement, pendant laquelle la température est abaissée et le pH du milieu remonte jusqu'à une valeur qui peut être 9 au maximum, — une phase de séparation du milieu de culture de la biomasse, - une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse, — et une étape de purification à partir du milieu de culture et/ou de la biomasse.

L'invention a plus particulièrement pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut, dont l'étape de purification à partir du milieu de culture et/ou de la biomasse ne comprend pas d'étape de passage sur colonne échangeuse d'ions, mais comprend dans l'ordre : - un ajustement du pH entre environ 7 et environ 11, - une précipitation, - la dissolution du précipité, — une filtration de la suspension résultante et - la précipitation dans un alcool.

Fermentation Les souches d'E. coli utilisables pour la production du polysaccharide K5 suivant l'invention peuvent être obtenues auprès des collections publiques, telles que la CNCM (Collection Nationale de Cultures de Microorganismes, France) ou ATCC (American Type Culture Collection, USA) . Alternativement, ces souches peuvent être obtenues par isolement clinique suivi de la caractérisation du type antigénique de la capsule, tels que décrits dans la littérature (Eur. J. Biochem, 1988 117 : 112-125) .

L'étape de fermentation selon l'invention est réalisée à partir du microorganisme E. coli dans un fermenteur, et comprend : — une phase de croissance en mode discontinu, — un ou plusieurs cycles de croissance en mode discontinu avec alimentation, qui peut être exponentielle ou constante, — une phase de refroidissement pendant laquelle la température peut être abaissée aux environs de 10- 12° C et le pH remonte jusqu'à environ 7,5 - 9, une phase de séparation du milieu de culture de la biomasse et — une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse.

Par croissance en mode discontinu, on entend selon l'invention une croissance d'un microorganisme dans un réacteur sans alimentation ni soutirage. Par croissance en mode discontinu avec alimentation, on entend selon l'invention une croissance d'un microorganisme dans un réacteur avec apport contrôlé en substrat et sans soutirage.

L'étape de fermentation selon l'invention comprend en particulier deux phases de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat qui succèdent à la phase de croissance en mode discontinu.

L'étape de fermentation selon l'invention comprend une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation constante en substrat précédant la phase de refroidissement.

Dans l'étape de fermentation selon l'invention, la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation commence à l'épuisement de la source de carbone dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu.

Plus particulièrement, selon l'invention, la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation commence à l'épuisement de la source de carbone dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu et, le cas échéant, les phases suivantes de croissance en mode discontinu avec alimentation commencent quand la concentration en oxygène dissout chute significativement par conséquence d'une limitation du transfert d'oxygène.

Selon l'invention, chacune des phases de de croissance en mode discontinu commence ainsi que décrit plus haut et la phase de refroidissement commence quand tout le milieu d'alimentation de culture a été injecté dans le fermenteur, ou quand une variation de pH est détectée.

Selon l'invention, après la phase de croissance en mode discontinu, la ou les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation et la phase de refroidissement, la biomasse est séparée du milieu par centrifugation. Après séparation, la biomasse et le milieu de culture sont décontaminés ; en particulier, ils sont inactivés pendant une durée variant entre Ih et 3h à une température d'environ 800C. Le surnageant et/ou le culot sont ensuite utilisés pour la purification du polysaccharide K5.

Le pH est maintenu à environ 6,5 pendant les phases de croissance en mode discontinu et de croissance en mode discontinu avec alimentation par addition de NH4OH ou de NH3, et remonte jusqu'à environ 8,5 pendant la dernière phase. La concentration d'oxygène dissout est maintenue entre environ 15 et environ 80% de la saturation en air par action sur la vitesse d'agitation, le débit d'air, l'enrichissement en oxygène de l'air d'entrée ou par ajout de peroxyde d'hydrogène;

La température de croissance durant l'étape de fermentation selon l'invention se situe entre environ 100C et environ 4O0C. Elle est plus particulièrement d'environ 3O0C durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation et d'environ 250C le cas échéant durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation. Le passage de 3O0C à 25°C est particulièrement important pour obtenir des rendements élevés en polysaccharide K5.

Le milieu de culture utilisé est un milieu de culture synthétique. La source de carbone selon l'invention est soit le glucose, soit le glycérol. La source de carbone préférée selon l'invention est le glycérol.

Plus particulièrement, la source de carbone dans l'étape de fermentation selon l'invention est le glycérol à une concentration comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation. L'exemple expérimental 1 illustre l'importance de l'utilisation de glycérol comme source de carbone et de l'augmentation de la concentration en glycérol dans le milieu d'alimentation pour l'obtention de concentrations élevées de polysaccharide K5. La source d' azote dans le milieu durant la phase de croissance discontinue selon l'invention peut être des extraits de levure, des acides casaminés, des peptones, NH4OH, NH3 ou (NH4J2HPO4.

Selon l'invention, la source d'azote dans le milieu de culture initial durant la phase de croissance en mode discontinu est plus particulièrement NH4OH, NH3 ou (NH4J2HPO4. Elle est en particulier utilisée à une concentration comprise entre environ environ 1 et environ 10 g/1.

Durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation selon l'invention, la source d'azote est fournie par NH4OH ou NH3 pour la régulation du pH. Sa concentration est de préférence d'environ 20%.

Plus particulièrement, dans l'étape de fermentation selon l'invention, la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu est NH4OH, NH3 ou (NH4J2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation.

L'invention a pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de fermentation dans laquelle : la source de carbone est le glycérol à une concentration comprise : — entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et - entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation, et la température de croissance est : - d'environ 300C durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et - d'environ 25°C le cas échéant durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation.

L'invention a aussi pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de fermentation dans laquelle : la source de carbone est le glycérol à une concentration comprise : - entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial pour la phase de croissance en mode discontinu, et - entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation pour les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation ; et la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu : - est NH4OH, NH3 ou (NH4) 2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et - est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation. L'invention a aussi pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de fermentation dans laquelle : la source d'azote dans le milieu durant la phase de croissance en mode discontinu : est NH4OH, NH3 ou (NH4)2HPO4, à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial et - est fournie par NH4OH ou NH3 à une concentration d'environ 20% pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation ; et - la température de croissance est : - d'environ 300C durant la phase de croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et - d'environ 25°C le cas échéant durant les autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation.

L'invention a tout particulièrement pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut dans lequel: • l'étape de fermentation comprend les étapes suivantes dans l'ordre : — une phase de croissance en mode discontinu, — une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant à l'épuisement complet de la source de carbone durant la phase précédente, — une deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute 5 significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente, — un cycle de croissance en mode discontinu 10 avec alimentation constante en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture 15 durant la phase précédente, et — une phase de refroidissement pendant laquelle la température est abaissée à environ 120C et le pH remonte jusqu'à une valeur comprise entre 7,5 environ et 9 20 environ, — une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse, • et est effectuée avec les paramètres suivants : — la température est : 25 - 3O0C environ durant la croissance en mode discontinu et la première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation, et — 250C environ durant les deux autres 30 phases de croissance en mode discontinu avec alimentation; — la source d'azote est fournie par: - (NH4) 2HPO4, NH4OH ou NH3 à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial, — l'ajout de NH4OH ou NH3 concentré à 20% environ pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation, - la source de carbone est le glycérol : — à une concentration comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial durant la première phase de croissance en mode discontinu, et — à une concentration comprise entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d' alimentation durant les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation.

Deuxième étape : purification du polysaccharidβ K5 L'invention a également pour objet le procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de purification durant laquelle le pH de la solution contenant le polysaccharide K5, et qui peut être le surnageant de la centrifugation du moût de fermentation ou le culot de cette centrifugation remis en suspension, est ajusté entre environ 7 et environ 11, et le polysaccharide est précipité à partir de cette solution. Le précipité est ensuite lavé, remis en solution et filtré, puis précipité.

Selon l'invention, la première précipitation de l'étape de purification se fait à l'aide d'un sel d'ammonium quaternaire. Cette précipitation se fait plus particulièrement à l'aide de chlorure de benzéthonium. Dans l'étape de purification selon l'invention, le premier précipité est remis en solution dans l'acétate de sodium, utilisé notamment à une concentration delθ%.

D'autre part, le méthanol est utilisé pour précipiter le filtrat dans l'étape de purification selon l'invention.

Plus particulièrement, la première précipitation de l'étape de purification selon l'invention se fait à l'aide de chlorure de benzéthonium, le précipité est dissout dans l'acétate de sodium puis filtré, et le filtrat de l'étape de purification est précipité au méthanol.

Selon l'invention, le produit purifié ainsi qu'indiqué plus haut peut éventuellement subir une ou plusieurs décoloration au peroxyde d'hydrogène. Il subit en particulier trois traitements au peroxyde d'hydrogène après la purification.

Le cas échéant, le produit purifié ainsi qu'indiqué plus haut subit après les trois décolorations au peroxyde d'hydrogène un traitement supplémentaire au peroxyde d'hydrogène, pour éliminer les contaminations restantes. Ce traitement permet une amélioration de la pureté du produit obtenu. L'invention a donc aussi pour objet un procédé de préparation du polysaccharide K5 comprenant une autre décoloration au peroxyde d'hydrogène après purification et trois traitements au peroxyde d'hydrogène.

Le cas échéant, le polysaccharide K5 est traité avec une protéase après l'une quelconque des étapes de purification sus-mentionnées. Comme indiqué plus bas dans l'exemple expérimental 8, le traitement à la protéase permet d' augmenter significativement la pureté du polysaccharide K5 produit avec un rendement presque quantitatif. L'invention a donc pour objet en particulier un procédé de préparation du polysaccharide K5 comprenant un traitement avec une protéase durant l'étape de purification. La protéase selon l'invention est de préférence l'alcalase.

Finalement, le polysaccharide K5 est précipité, centrifugé et séché.

L'invention a donc tout particulièrement pour objet un procédé de préparation du polysaccharide K5 tel que décrit plus haut comprenant une étape de purification durant laquelle on met en œuvre les étapes suivantes : - centrifugation de la culture pour séparer le milieu de culture de la biomasse ; à partir du surnageant de la centrifugation du moût de fermentation : - ajustement du pH entre environ 7 et environ 11, - précipitation au chlorure de benzéthonium, - lavage du précipité, - dissolution du précipité dans l'acétate de sodium 10%, - filtration de la solution d'acétate de sodium 10%, - précipitation du filtrat au méthanol, - trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat, - un traitement à l'alcalase ;

en parallèle, à partir du culot résultant de la centrifugation du moût de fermentation : - remise en suspension du culot, - ajustement du pH entre environ 7 et environ 11, - précipitation au chlorure de benzéthonium, - lavage du précipité, - remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%, - filtration de la solution d'acétate de sodium 10%, - précipitation du filtrat au méthanol, - trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat, - un traitement à l'alcalase ; réunion des deux préparations à l'une quelconque des étapes de la purification ; - précipitation, centrifugation et séchage du polysaccharide K5.

L'invention a donc de préférence pour objet un procédé de préparation du polysaccharide K5 comprenant : • une étape de fermentation qui: comprend les étapes suivantes dans l'ordre : - une phase de croissance en mode discontinu, - une phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant à l'épuisement complet de la source de carbone durant la phase précédente, - une deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente, - un cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation constante en substrat commençant quand la concentration en oxygène chute significativement en conséquence d'une limitation du transfert en oxygène dans le milieu de culture durant la phase précédente, et — une phase de refroidissement pendant laquelle la température est abaissée à 5 environ 120C et le pH remonte jusqu'à une valeur comprise entre 7,5 environ et 9 environ, — une phase de décontamination du milieu de culture de la biomasse, 10 - et est effectuée avec les paramètres suivants : — la température est : — 3O0C environ durant la croissance en mode discontinu et la première phase 15 de croissance en mode discontinu avec alimentation, et — 250C environ durant les deux autres phases de croissance en mode discontinu avec alimentation; 20 - la source d'azote est fournie par: — (NH4)2HPO4, NH4OH ou NH3 à une concentration comprise entre environ 1 et environ 10 g/1 dans le milieu de culture initial, 25 - l'ajout de NH4OH ou NH3 concentré à 20% environ pour la régulation du pH durant les phases de croissance en mode discontinu et en mode discontinu avec alimentation, 30 - la source de carbone est le glycérol : — à une concentration comprise entre environ 10 et environ 90 g/1 dans le milieu de culture initial durant la première phase de croissance en mode 35 discontinu, et - à une concentration comprise entre environ 250 et environ 1200 g/1 dans le milieu d'alimentation durant les phases de croissance en mode discontinu avec alimentation ;

• une étape de purification durant laquelle les étapes suivantes sont réalisées : — centrifugation de la culture pour séparer le milieu de culture de la biomasse ; - à partir du surnageant de la centrifugation du moût de fermentation : - ajustement du pH entre environ 7 et environ 11, - précipitation au chlorure de benzéthonium, - lavage du précipité, - remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%, - filtration de la solution d'acétate de sodium 10%, - précipitation du filtrat au méthanol, - trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat, - un traitement à l'alcalase ; — en parallèle, à partir du culot résultant de la centrifugation du moût de fermentation : - remise en suspension du culot, - ajustement du pH entre environ 7 et environ 11, - précipitation au chlorure de benzéthonium, - lavage du précipité, - remise en solution du précipité dans l'acétate de sodium 10%, — filtration de la solution d' acétate de sodium 10%, — précipitation du filtrat au méthanol, - trois décolorations au peroxyde d'hydrogène du filtrat, - un traitement à l'alcalase ; — réunion des deux préparations à l'une quelconque des étapes de la purification ; — précipitation, centrifugation et séchage du polysaccharide K5.

Le procédé selon l'invention permet ainsi d'obtenir des rendements qui peuvent être jusqu'à 10 fois supérieurs aux rendements obtenus avec les méthodes décrites dans l'art antérieur.

Selon l'invention le polysaccharide K5 produit ainsi que décrit plus haut est alors utilisé comme substrat pour une réaction chimique et/ou enzymatique de désacétylation, N-resulfatation, C-5 épimérisation et/ou O-sulfatation. Il est plus particulièrement utilisé selon l'invention comme substrat dans une des réactions susmentionnées pour obtenir une héparine hemi-synthétique (biohéparine) .

La biohéparine obtenue est ensuite utilisée selon l'invention comme substrat dans une réaction de fragmentation pour obtenir une HBPM (héparine de bas poids moléculaire) , dont le poids moléculaire est compris entre environ 1500 et environ 6500 Da.

Il est aussi possible selon l'invention d'utiliser la biohéparine obtenue comme substrat dans une réaction de fragmentation pour obtenir une HBPM (héparine de bas poids moléculaire) , dont le poids moléculaire est compris plus particulièrement entre environ 3500 et environ 5500 Da ou une HTBPM (héparine de très bas poids moléculaire) , dont le poids moléculaire est compris plus particulièrement entre environ 1500 et environ 3000 Da.

Les exemples suivants illustrent l'invention sans toutefois la limiter.

Exemples d'application

Exemple 1

1) Mode opératoire a) Fermentation

La fermentation est réalisée à partir de la souche ά'E. coli ATCC23506 dans un fermenteur 20 litres.

Une préculture de la souche ά'E. coli est réalisée à partir de 1,8 ml d'une ampoule congelée sur la nuit à 30° C dans un erlenmeyer de 500 ml contenant 100 ml du milieu suivant : glycérol 5 à 60 g.l"1, KH2PO4 0,5 à 3 g.l'1, (NH4) 2HPO4 1 à 10 g.l"1, MgSO40,5 à 5 g.l"1, acide citrique 0,2 à 4 g.l'1, ainsi que des oligo-éléments. La croissance est réalisée à 3O0C sous agitation à 200 tours/minute. Cette préculture est utilisée pour ensemencer le fermenteur de production. Celui-ci peut aussi être directement ensemencé à partir de l'ampoule glycérolée, l'objectif de la préculture n'étant que de réduire la durée de la phase de croissance en mode discontinu dans le fermenteur. Les milieux utilisés sont des variantes du milieu RFB MIL 11/04 (J. of Biotechnology, 1995, 39 : 59-65) et leurs compositions sont données dans le tableau I.

Tableau I : Composition des milieux utilisés en modes de croissance en mode discontinu et de croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat. Les cultures sont réalisées dans des fermenteurs de type TECHFORS (20 1 volume total, 12 1 de volume utile) sous le contrôle du programme IRIS (Infors) basé sur un algorithme de contrôle auto-adaptatif. La concentration en oxygène dissout dans le milieu, le pH, la vitesse d'agitation, la température, le débit d'air d'aération, la pression ainsi que les débits de pompe (régulation basique, alimentation, antimousse) sont mesurés et contrôlés en ligne. L'analyse des gaz de sortie des fermenteurs est réalisée à l'aide d'un spectromètre de masse (PRIMA 600S) .

La fermentation est réalisée en mode discontinu avec les caractéristiques suivantes : - Volume utile de 12 1, - Volume initial de 8 1, - Volume ajouté de 4 1, - Volume final de 12 1 plus le volume de base, Oxygène dissout maintenu entre 15 et 80% de la saturation en air (préférentiellement maintenu à 30%), - Température entre 20 et 4O0C (préférentiellement 3O0C), pH régulé entre 6,0 et 7,5 (préférentiellement maintenu à 6,5) par addition de NH4OH ou de NH3 concentrés, - Pression de 0,3 bar, 0,5 bar et 0,8 bar, - Aération initiale de 4 l.min"1 (0.5 VVM) (régulée entre 4 et 20 l.min"1), et - Vitesse d'agitation initiale de 200 tours/minute (régulée entre 200 et 1500 tours/minute) .

Les cultures peuvent comprendre jusqu'à cinq étapes : une croissance en de croissance en mode discontinu suivie de trois étapes différentes de croissance en mode discontinu avec alimentation en substrat, et une étape finale de refroidissement.

1. Phase de croissance en mode discontinu Au cours de la phase de culture en mode discontinu, le temps de génération de la souche est estimé à partir de la mesure de production de dioxyde de carbone et le débit initial de la première partie de la croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat est calculé :

Qθ = ( CO2pmax X VθlFer) / ( 1000 X MWC02 X Ycθ2/glycérol X G0 ) Qo: débit initial d'alimentation en milieu concentré (l.h~ 1) ; Cθ2Pmaχ: production maximale de dioxyde de carbone (mmol. l"1.hf1) ; Go: concentration en glycérol ou en glucose dans le milieu concentré utilisé lors de la croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat (750 g.l"1); volume de liquide dans le fermenteur ; MWCo2 : poids moléculaire du CO2 (g.l"1) et YCo2/giycéroi : rendement du CO2 produit par quantité de glycérol consommé.

2. Première phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat A l'épuisement de la source de carbone, un cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat est initié par alimentation en milieu concentré, afin d'augmenter la concentration en biomasse. La pompe d'alimentation en milieu frais est activée. Son débit suit une augmentation exponentielle au cours du temps: Q(t) = Q0 x 2 ct ' <τ x 2-4>l

Qo : débit d'alimentation initial (l.h"1) de la pompe d'alimentation ; t : temps écoulé depuis le démarrage du cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat ; τ : temps de génération de la souche mesuré au cours de la croissance en mode discontinu. Ce débit d'alimentation prend en compte le temps de génération précédemment mesuré multiplié par un facteur correctif pouvant varier de 1 à 10 (préférentiellement 2,4) . Ce débit d'alimentation impose un taux de croissance spécifique au microorganisme compris entre 0,05 h"1 et 0,65 h"1.

3. Deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat A la première limitation de transfert d'oxygène (oxygène dissout < 20%, vitesse d'agitation > 1350 tours/minute, débit d'air > 19,5 l.min"1, pression = 0,5 bars), ce premier cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat est stoppé. Une autre alimentation exponentiellele est démarrée sur la base d'un débit initial de 8,4 ml.h"1 au démarrage du premier cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat. Le temps de génération est multiplié par un nouveau facteur correctif compris entre 4 et 10 (préférentiellement 6) comme durant le précédent cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat. Ce débit d'alimentation impose un taux de croissance spécifique au microorganisme compris entre 0,OSh"1 et 0,16 h " 1. Au même instant, la consigne de température du fermenteur est rabaissée entre 20 et 25°C (préférentiellement 25°C) afin d'augmenter la solubilité de l'oxygène dans le milieu. Le nouvel algorithme de commande de la pompe d'alimentation est:

Q' (t) = 0,0084 x 2 tfc / <τ* 6)] t : temps écoulé depuis le démarrage du cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat ; τ : temps de génération de la souche mesuré au cours de la croissance en mode discontinu. Alors que cette limitation de transfert d'oxygène apparaît vers 30 h de croissance (incluant les 10 h du premier cycle de croissance en mode discontinu avec alimentation contrôlée en substrat) le débit initial réel de la pompe d'alimentation en milieu est d'environ 15 ml.h"1 (t = 1Oh) . Ce débit d'alimentation plus faible permet à nouveau au système de réguler l'oxygène dissout à 30% de la saturation tout en conservant la croissance du microorganisme. Cette alimentation va continuer jusqu'à l'apparition d'une seconde limitation en transfert d'oxygène.

4. Phase d'alimentation constantee en substrat A l'apparition de la seconde limitation en transfert d'oxygène (oxygène dissout < 20%, vitesse d'agitation > 1350 tours/minute, débit d'air > 19,5 l.min"1, pression = 0,5 bar), l'alimentation exponentiellele du milieu est transformée en un débit constant compris entre 1 et 20 ml.1"^h"1 (préférentiellement 4,2 ml.l^.h"1) . Cette alimentation continue jusqu'à ce que les 4 1 de milieu d'alimentation aient été injectés ou jusqu'à ce qu'une chute significative du pH soit détectée (consommation totale du NH4OH indiquant une forte limitation en oxygène) .

5. Phase de refroidissement La pompe d' alimentation est alors arrêtée et la température du fermenteur est amenée à 100C tandis que le pH remonte naturellement ou peut être ajusté à une valeur comprise entre 7,5 et 9 (préférentiellement 8,5), favorable à l'activité de l'enzyme polysaccharide K5 lyase. Ces conditions sont maintenues pendant une durée de 0 à 1Oh. Après que le fermenteur a été réfrigéré à 100C, la biomasse est récoltée en conditions de travail de risque biologique de niveau 2 dans un container hermétique. Le moût est centrifugé pour séparer la biomasse du surnageant de culture. Après séparation, le surnageant est décontaminé sous agitation par un traitement thermique à 800C pendant lh.30. La biomasse est quant à elle décontaminée par un passage à 800C durant 2h30. Le surnageant et la biomasse peuvent être stockés à -2O0C.

Les conditions utilisées dans ces essais sont : - COL5K000/ 001: phase de croissance en mode discontinu à 300C/ phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 300C / phase de refroidissement. - COL5K002 : phase de croissance en mode discontinu à 300C/ phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 3O0C / deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 300C / phase de refroidissement. - COL5K003/04 : phase de croissance en mode discontinu à 300C/ phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 300C / deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 25°C / phase de refroidissement. - COL5K005/ 006 : phase de croissance en mode discontinu à 300C/ phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 3O0C / deuxième phase de croissance en mode discontinu avec alimentation exponentielle en substrat à 250C / phase de croissance en mode discontinu avec alimentation constante en substrat à 25°C / phase de refroidissement.

b) Analyse des polysaccharides

L'analyse des polysaccharides se déroule en deux temps : 1. les polysaccharides sont d'abord dépolymérisés en leurs disaccharides constitutifs, 2. le mélange de disaccharides est analysé par CHLP.

1. Dépolymérisation des polysaccharides On remet en suspension environ 40 mg d'échantillon à analyser dans 2 ml de tampon acétate pH = 7 (0,29 ml d'acide acétique, 5 mg de BSA, 15,8 mg d'acétate de calcium, eau déminéralisée qsp 50 ml, pH ajusté à 7 avec de l'hydroxyde de sodium 2N) afin d'obtenir une solution à 20 mg/ml. Dans le même temps, on prépare des solutions d'héparinases I, II et III à 0,5 Ul/ml en tampon phosphate (68 mg de dihydrogénophosphate de potassium, 10 mg de BSA, eau déminéralisée qsp 50 ml, pH ajusté à 7 avec de l'hydroxyde de potassium N) . Ces solutions sont ensuite mélangées dans des proportions égales pour obtenir la solution finale d'héparinases 123. On mélange ensuite 25 μl de la solution d'échantillon à 20 mg/ml, 25 μl de tampon acétate et 25 μl de solution d'héparinases 123 dans un tube de 300 μl. Le mélange est bien homogénéisé et incubé pendant 24 heures à température ambiante, de façon à obtenir une dépolymérisation totale.

2. Analyse des polysaccharides par CHLP Le mélange précédent est analysé par CLHP en gradient suivant la méthode bien connue de l'homme de métier. Les conditions d'analyse sont : - Colonne : Spherisorb SAX 5 μm, 250 x 3 mm, Waters Température de la colonne : 400C Débit : 0,5 ml/min Volume d'injection : 10 μl - Détection UV à 234 nm Phase mobile : o Solvant A : NaH2PO4 2,5 mM pH = 2,9 o Solvant B : NaClO4 M, NaH2PO4 2,5 mM pH = 3 Gradient :

On détecte en CHLP le disaccharide 4-beta-glucuronil-l, 4 alpha-N-acetylglucosamine.

2) Résultats Six essais différents de fermentation (COL5K001 à 006) ont été réalisés, en sus du témoin, COL5K000.

Les concentrations en polysaccharide K5 obtenues lors de ces essais sont résumées dans le tableau 2.

Tableau 2 :

Les résultats (figure 1, annexe 1) montrent clairement que chacun des modes opératoires utilisés a permis de produire entre 2 et 10 fois plus de polysaccharide K5 que le témoin COL5K000. Le profil des principaux paramètres de COLK006 montre que l'augmentation de la concentration du polysaccharide K5 dans le milieu est liée à l'entrée dans la seconde phase de croissance en mode discontinu avec alimentation (figure 2, annexe 1) .

L'étude réalisée a permis décupler la concentration maximale en polysaccharide produit dans le milieu par rapport à ce qui était décrit dans la littérature : celle-ci était de 900 mg.l"1, alors que nous avons obtenu une concentration supérieure à 10 g.l"1. Les principales modifications apportées au procédé entre les opérations COL5K000 et COL5K006 ayant permis d' augmenter la concentration en polysaccharide dans le milieu de culture ont été : l'utilisation de glycérol au lieu de glucose comme source de carbone, - l'augmentation de la durée totale de fermentation, en ajoutant des séquences d'alimentation en substrat à taux de croissance spécifique diminué (deuxième et troisième séquence d'alimentation) lors de l'apparition de la limitation de transfert d'oxygène, l'augmentation de la concentration en glycérol de la solution de feeding (passage de 500 g.l"1 à 750 g.1"1), et l'augmentation de pH en fin d'opération, qui permet de se placer dans des conditions favorables à l'activité de la polysaccharide K5 lyase et d' augmenter la quantité de polysaccharide disponible dans le milieu de culture.

Exemple 2

Procédé d'extraction Les étapes d'extraction décrites ci-dessous ont été mises en œuvre afin d'isoler le polysaccharide K5 à partir du surnageant de fermentation obtenu précédemment. On a obtenu dans l'exemple 1 6,5 litres de surnageant inactivé thermiquement, qui contiennent 24,7 g de polysaccharide K5, à partir du fermenteur COL5K001. Le pH de cette solution a été ajusté à 7,2 à l'aide de soude 5 N et 663 ml d'une solution aqueuse à 50 g/1 de chlorure de benzéthonium ont été ajoutés par coulée (soit 1,2 équivalent molaire de chlorure de benzéthonium par rapport au polysaccharide K5) . Le milieu réactionnel a été agité à température ambiante pendant 30 minutes puis centrifugé à 4 000 tours/minutes pendant 10 minutes. Le culot obtenu a été lavé deux fois avec 4 litres d'eau déminéralisée, puis il a été agité dans 5 litres d'une solution d'acétate de sodium à 10%. Le surnageant obtenu dans la première précipitation au chlorure de benzéthonium a été re-traité : on a ajusté son pH à 7,2 à l'aide de soude 5 N, ajouté 663 ml de chlorure de benzéthonium à 50 g/1, et agité le mélange 30 minutes avant de le centrifuger. Le culot obtenu a été lavé deux fois avec 4 litres d' eau déminéralisée, puis il a été agité dans 5 litres d'une solution d'acétate de sodium à 10%. Les solutions contenant les deux culots resuspendus ont été réunies puis filtrées sur verre fritte muni d'une pré-couche de clarcel. Le filtrat a été coulé sur 40 litres de méthanol. Le mélange résultant a été agité pendant 25 minutes, après quoi il a décanté une nuit. Le lendemain, il a été centrifugé à 4000 G pendant 10 minutes. Le culot a été lavé au méthanol, puis séché 36 heures à 5O0C sous 20 Torrs. On a ainsi obtenu 31,5 g de polysaccharide K5 avec un titre de 54% ; le rendement était de 68,8%. Exemple 3

Purification Le titre du produit isolé dans l'exemple 2 étant faible (seulement 54%) , des étapes de purification supplémentaires ont été réalisées.

Le produit brut obtenu dans l'exemple 2, qui pèse 31,5 g, a été remis en suspension avec 1,2 litre d'eau déminéralisée dans un erlenmeyer sous agitation magnétique. Après que le pH a été ajusté à 11 à l'aide de soude 5N, 15 g de chlorure de sodium et 6 ml de peroxyde d'hydrogène à 30% ont été ajoutés à la solution. Le mélange a été agité 10 minutes puis laissé la nuit à température ambiante sans agitation. On a précipité le polysaccharide K5 par addition de 4 volumes de méthanol dans la solution ; le mélange a été agité 30 minutes puis centrifugé à 4000 tours/minutes pendant 15 minutes. Le culot a été séché à l'étuve 36 heures à 45°C sous 20 Torrs. On a ainsi obtenu 23,5 g de polysaccharide K5 avec un titre qui a été amélioré de 54 à 65%.

Exemple 4

Extraction et Purification Le polysaccharide K5 brut a été extrait et purifié à partir du fermenteur COL5K002 de l'exemple 1.

On a obtenu dans l'exemple 1 5,4 litres de surnageant inactivé thermiquement, qui contiennent 21,1 g de polysaccharide K5, à partir du fermenteur COL5K002. Le surnageant COL5K002 a été traité au chlorure de benzéthonium et les culots sont agités dans une solution d'acétate puis filtrés sur verre fritte muni d'une pré¬ couche de clarcel, comme expliqué dans l'exemple 2. Le polysaccharide K5 contenu dans le filtrat a été précipité au méthanol, comme expliqué dans l'exemple 2, puis il a subi une décoloration au peroxyde d'hydrogène, ainsi que détaillé dans l'exemple 3, suivie d'une deuxième décoloration au peroxyde d'hydrogène. On a finalement obtenu 25,3 g de polysaccharide K5 avec un titre de 78% et un rendement supérieur à 90%.

Exemple 5

Extraction et purification Le polysaccharide K5 brut a été extrait et purifié à partir du fermenteur COL5K003 de l'exemple 4.

On a obtenu dans l'exemple 1 6 litres de surnageant inactivé thermiquement, qui contiennent 45 g de polysaccharide K5, à partir du fermenteur COL5K003. Le surnageant COL5K003 a été traité au chlorure de benzéthonium et les culots sont agités dans une solution d'acétate puis filtrés sur verre fritte muni d'une pré- couche de clarcel, comme expliqué dans l'exemple 2. Le polysaccharide K5 contenu dans le filtrat a été précipité au méthanol, comme expliqué dans l'exemple 2, puis a subi deux traitements au peroxyde d'hydrogène, comme dans l'exemple 4, suivis d'une troisième décoloration au peroxyde d'hydrogène.

Finalement, on a obtenu 39,5 g de polysaccharide K5 avec un titre de 81% et un rendement de 71%

Exemple 6

Traitement du culot et amélioration de la purification Seuls les surnageants ont été extraits et purifiés dans les essais précédents. Afin de récupérer le polysaccharide K5 présent dans les sédiments de centrifugation, le culot du fermenteur COL5K002 de l'exemple 1 (5 kg contenant 31,9 g de polysaccharide K5) a été remis en suspension dans un volume d'eau déminéralisée et le pH a été ajusté à 7,2 avec NaOH 5N. Le mélange a ensuite été agité 2 heures à température ambiante, avant d'être centrifugé 90 minutes à 4700 G. Le surnageant a été traité au chlorure de benzéthonium et les culots sont agités dans une solution d'acétate puis filtrés sur verre fritte muni d'une pré-couche de clarcel, comme expliqué dans l'exemple 2. Le polysaccharide K5 contenu dans le filtrat a été précipité au méthanol, comme expliqué dans l'exemple 2, puis il a été traité trois fois au peroxyde d'hydrogène, comme dans l'exemple 5.

On a obtenu 29,6 g de polysaccharide K5 avec un titre de 73% et un rendement final de 68%.

Exemple 7

Traitement du culot et amélioration de la purification

Le culot du fermenteur COL5K003 de l'exemple 1 (4,75 kg contenant 28,5 g de polysaccharide K5) a été remis en suspension dans 4,75 litres d'eau déminéralisée et le pH a été ajusté à 1,2 avec NaOH 5N. Le mélange a ensuite été agité 2 heures à température ambiante, avant d'être centrifugé 2 heures à 4700 G.

Le surnageant a été traité au chlorure de benzéthonium et les culots sont agités dans une solution d' acétate puis filtrés sur verre fritte muni d'une pré-couche de clarcel, comme expliqué dans l'exemple 2. Le polysaccharide K5 contenu dans le filtrat a été précipité au méthanol, comme expliqué dans l'exemple 2, puis il a subi deux traitements au peroxyde d'hydrogène, comme dans l'exemple 4. On a obtenu 25,9 g de polysaccharide K5 avec un titre de 69% et un rendement de 63%.

Exemple 8

Purification comprenant une étape de déprotéinisation enzymatique Une étape de déprotéinisation enzymatique a été mise en œuvre afin d'améliorer la pureté du produit final. On a remis en suspension 45,5 g de polysaccharide K5, dont 15,9 g provenant de l'exemple 7 et 29,6 g provenant de l'exemple 6, dans 1,8 litre d'eau déminéralisée. Après que le pH a été ajusté à 7,0, 910 μl d' alcalase liquide sont ajoutés et le mélange est incubé 5 heures à 60°C avec agitation. On a ensuite ajouté 23 g de sel et 7,2 litres de méthanol, agité le mélange 30 minutes, avant de le centrifuger pendant 15 minutes à 4000 G. Le culot a été remis en suspension dans 1,8 litre d'eau déminéralisée et traité au peroxyde d'hydrogène, comme expliqué dans l'exemple 3.

On a obtenu 36,4 g de polysaccharide K5 avec un titre de 89% et un rendement de 98%.

Exemple 9

Comparaison de l'efficacité de la déprotéinisation enzymatique par rapport à la décoloration.

On a traité 5 g de polysaccharide K5 provenant de l'exemple 7 soit au peroxyde d'hydrogène, soit à 1' alcalase alcaline, afin d'estimer l'efficacité relative des deux traitements.

On a ainsi remis en suspension 5 g de polysaccharide K5 provenant de l'exemple 7 dans 200 ml d'eau déminéralisée et traité la solution au peroxyde d'hydrogène, comme dans l'exemple 3. On a obtenu 3,75 g de polysaccharide K5 avec un titre de 76,9% et un rendement de 83%.

De la même façon, on a remis en suspension 5 g de polysaccharide K5 provenant de l'exemple 7 dans 200 ml d'eau déminéralisée. Cependant, au lieu d'être traitée au peroxyde d'hydrogène, cette solution a été chauffée à 6O0C et son pH ajusté à 7. On a ensuite ajouté 100 μl d' alcalase et incubé le mélange 5 heures à 600C. Celui-ci a ensuite été précipité au méthanol, comme détaillé dans l'exemple 2. On a obtenu 3,62 g de polysaccharide K5 avec un titre de 83% et un rendement de 87%, à comparer au titre de 76,9% et au rendement de 83% obtenus avec le traitement au peroxyde d'hydrogène. L'étape de déprotéinisation permet donc d'obtenir un meilleur rendement ainsi qu'une plus grande pureté par rapport à un troisième traitement avec le peroxyde d'hydrogène.

En fin de fermentation telle que décrite dans l'exemple 1, les pertes dans le culot ont atteint 60% dans COL5K002 et 40% dans COL5K003. Le procédé de retraitement de ce culot mis au point et décrit dans les exemples 6 et 7 a permis d'augmenter le rendement global d'extraction du polysaccharide K5 de 37 à 78% pour COL5K002 et de 43 à 68% pour COL5K003.

L'étape de déprotéinisation finale décrite dans l'exemple 8 permet d'amener la pureté du polysaccharide K5 à 89% avec un rendement quantitatif (98%) .

Figure 1 :

Quantité de polysaccharide exploitable pour les opérations COL5K000 à COL5K006. Les barres pleines représentent la quantité exploitable de polysaccharide estimée (en g) ; les barres hachurées la concentration finale de polysaccharide dans le surnageant (x 20, en g/1) ; les triangles les DOδOOnm atteintes par les cultures. Figure 2 : Profil des principaux paramètres de l'opération COL5K006. La courbe 1 représente le pourcentage d'oxygène dissout dans le milieu, la courbe 2 la vitesse de production de CO2 dans la culture COLK006 (en nmol.l"1^1) , la courbe 3 le volume apporté/20 en g.l x, et la courbe 4 la concentration de polysaccharide K5 dans le surnageant (en g.1"1) .