La présente invention se rapporte aux utilisations, notamment dans des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques à usage vaginal, d'oiigosaccharides prébiotiques sélectionnés pour leur capacité à favoriser la croissance de souches bactériennes vaginales endogènes bénéfiques.

L homme et les animaux sont l'hôte de populations de microorganismes qui se développent naturellement tant à la surface que dans les cavités de leur corps. Ces flores microbiennes, ou microflores endogènes, sont caractéristiques de l'espèce et de la région du corps où elles se développent. En contact étroit avec leur hôte, certains microorganismes sont connus pour leur action bénéfique sur la peau ou la muqueuse vaginale, par exemple en maintenant un environnement légèrement acide et/ou en participant à la protection de l'organisme vis-à-vis d infections par des microorganismes pathogènes habituellement peu ou pas présents sur la peau ou sur la muqueuse vaginale.

On recherche, depuis bon nombre d'années, des composés, aliments ou ingrédients dits « santé » en ce qu'ils sont capables de favoriser le développement de la flore locale saine, par opposition à la flore pathogène. Les concepts suivants ont ainsi été développés :

a) Les probiotiques sont constitués par des bactéries vivantes exogènes qui sont apportées notamment par l'alimentation et dont les effets sont favorables à l'organisme hôte. Par exemple, les souches probiotiques bénéfiques pour la flore intestinale et utilisées chez l'homme (laits fermentes et compléments alimentaires) sont principalement des bifidobactéries et des lactobacilles. Ces bactéries jouent un rôle favorable sur la santé en complémentant la flore naturelle du colon. b) Les ingrédients prébiotiques sont essentiellement des oligosaccharides capables de stimuler de manière sélective la croissance et l'activité métabolique de souches bactériennes endogènes pour un effet bénéfique sur l'organisme hôte. A titre d'exemple, on citera notamment les galacto- et les fructo- oligosaccharides, l'inuline ou encore des amidons résistants.

Afin de préserver l'homme et la femme vis-à-vis d'infections microbiennes, notamment bactériennes, diverses et parfois sévères, et outre les moyens pharmaceutiques et thérapeutiques actuels, tels que les antibiothérapies, moyens plus ou moins contraignants et parfois pourvus d'effets secondaires gênants, les industriels cherchent à mettre au point des soins, qui permettent de créer un milieu favorable au développement de la flore endogène bénéfique et d'orienter le métabolisme de I ensemble de la microflore endogène, de sorte que cette dernière participe au maintien du bon équilibre physico-chimique de la peau et des muqueuses, tout en ne favorisant pas concomitamment le développement de microorganismes pathogènes.

Par exemple, le brevet européen EP 0 591 443 décrit l'utilisation d'oligosaccharides choisis parmi les glucooligosaccharides, les fructooligosaccharides, les α- et β-galacto-oligosaccharides et leurs mélanges, qui sont métabolisables par des souches bénéfiques de la microflore cutanée ou vaginale, mais peu ou pas métabolisables par des souches pathogènes ou opportunistes, pour préparer des compositions destinées à favoriser le développement et la croissance d'une microflore cutanée ou vaginale bénéfique.

_n38Ce brevet décrit en particulier les applications cosmétiques de telles compositions.

La Demanderesse s'est, dans le cadre de la présente invention, plus particulièrement intéressée aux oligosaccharides prébiotiques susceptibles de favoriser la microflore vaginale bénéfique.

Grâce aux résultats issus de ses travaux de recherche, la Demanderesse a pu sélectionner des oligosaccharides spécifiques dotés de propriétés prébiotiques particulièrement avantageuses vis-à-vis de la flore saprophyte bénéfique du vagin, essentiellement constituée de lactobacilles.

Les oligosaccharides spécifiques sélectionnés par la Demanderesse sont le fructooligosaccharide (FOS) de formule GF2 et les glucooligosaccharides (GOS) comprenant des liaisons glucosidiques α(1→ 6) pouvant contenir une liaison glucosidique de type α(1→ 4) à l'extrémité réductrice, et de degré de polymérisation supérieur ou égal à 4.

Le FOS GF2 est constitué d'une molécule de glucose et de deux molécules de fructose. Il s'agit d'un FOS de degré de polymérisation 3 (DP3), communément appelé 1-cétose. Cet oligosaccharide est notamment présent dans le mélange commercialisé sous la désignation Actilight® (vendu par Beghin-Meiji Industries, Paris, France). Le mélange FOS Actilight® est préparé à partir de saccharose à l'aide d'une enzyme de transfert, la β-fructosyltransférase, notamment produite par Aspergillus niger ou Aureobasidium pullulans (Hidaka et al. (1991), J. Carbohydrate Chemistry 10 (4), 509-522).

Les GOS α(1→ 6) sont des glucanes à courte chaîne constitués d'enchaînements linéaires de glucoses liés en α(1→ 6). Au niveau industriel, ces GOS sont généralement obtenus par transglucosylation enzymatique du glucose (P. Monsan et F. Paul (1995), FEMS Microbiology Reviews 16, 187-192), c'est-à-dire par transfert enzymatique du glucose à partir du saccharose sur le maltose à l'aide d'une glucosyltransférase provenant de l'espèce bactérienne Leuconostoc mesenteroides, telle que L. mesenteroides NRRL B-512F. Cette technique est bien connue de l'homme du métier. Conformément à la description expérimentale qui suit, la Demanderesse a pu démontrer que ces oligosaccharides particuliers représentent des substrats carbonés spécifiques de la flore saprophyte bénéfique du vagin, et sont à ce titre capables de favoriser l'effet barrière vis-à-vis de microorganismes pathogènes responsables d'infections urogénitales souvent récidivantes.

A cet égard, la Demanderesse a plus précisément étudié la flore saprophyte bénéfique du vagin et a ainsi pu identifier les 3 lactobacilles suivants :

- Lactobacillus sp. oral clone (ou L vaginalis) enregistrée le 29/07/2004 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) (Institut Pasteur, France) sous le numéro 1-3255;

- L crispatus enregistrée le 20/12/2001 à la CNCM sous le numéro I- 2769; et

- L. jensenii enregistrée le 29/07/2004 à la CNCM sous le numéro I- 3256.

Ces 3 souches de lactobacilles ont été isolées par la Demanderesse à partir de prélèvements vaginaux sains et ont été sélectionnées pour leurs propriétés probiotiques intéressantes, notamment : (i) forte production de peroxyde d'hydrogène, (ii) forte production d'acide lactique, (iii) adhésion à la muqueuse vaginale, (iv) présence d'arginine désaminase (voir partie expérimentale ci-dessous). Elles ont été identifiées d'un point de vue taxonomique par détermination de la séquence de l'ARN 16S par l'Institut Pasteur (Lille, France).

De plus, une souche de l'espèce Lactobacillus gasseri enregistrée le 25/08/05 à la CNCM sous le numéro I-3495, présente fréquemment dans la flore de Doderleïn (Tarnberg et al. (2002), Acta Pathologica Microbiologica et Immunologica Scandinavica 110 (11), 802-810) a également été étudiée vis-à-vis de son aptitude à utiliser les oligosaccharides sélectionnés comme source de carbone.

Compte tenu, d'une part de leur présence ubiquitaire au niveau de la flore vaginale endogène saine, et d'autre part de leurs propriétés probiotiques d'intérêt, il s'agit là de souches de lactobacilles vaginales bénéfiques, dont il convient de favoriser le développement et la croissance.

Selon un premier aspect, la présente invention concerne des compositions cosmétiques ou pharmaceutiques comprenant au moins un oligosaccharide choisi parmi :

- le FOS de formule GF2 (1-cétose), où G est un résidu de glucose et F un résidu de fructose ;

- les GOS de structure linéaire comprenant des liaisons glucosidiques de type α(1→ 6), le cas échéant contenant une liaison glucosidique de type α(1→ 4) à l'extrémité réductrice, de degré de polymérisation (DP) supérieur ou égal à 4 ; et

- leurs mélanges.

Le DP des GOS α(1→ 6) sera compris de préférence entre 4 et 10, et de manière encore préférée, 4, 5, 6 ou 7.

De manière encore préférée, la composition pharmaceutique comprend et/ou est constituée par au moins le GOS linéaire α(1→ 6), le cas échéant contenant une liaison α(1→ 4) à l'extrémité réductrice de DP égal à au moins 4. Ainsi, grâce à la présence d'un ou plusieurs des oligosaccharides susmentionnés, les compositions de l'invention permettent de maintenir un milieu favorable au développement de la flore vaginale endogène bénéfique.

De préférence, les compositions selon l'invention sont destinées au traitement de la muqueuse vaginale, et plus particulièrement au traitement ou à la prévention d'une vaginose bactérienne.

Selon une autre préférence, les compositions selon l'invention sont des produits d'hygiène.

La quantité d'oligosaccharide(s) présente dans la composition de l'invention peut aller d'environ 0,1 % en poids à 20 % et plus, de préférence d'environ 1 à 10 % en poids, de manière encore préférée, d'environ 1 à 5 % en poids. En dessous de 0,1 % en poids, l'effet du ou des oligosaccharides devient le plus souvent négligeable. Par ailleurs, il n'y a généralement pas d'avantages particuliers à incorporer plus d'environ 20 % en poids d'oligosaccharide(s), bien que cela soit tout à fait possible. Bien souvent, des considérations d'ordre économique amènent à limiter la quantité d'oligosaccharide(s) à environ 20 % en poids, de préférence à environ 10 % en poids, et plus préférentiellement à environ 5 % en poids.

Très avantageusement, le constituant oligosaccharide est en fait un mélange d'oligosaccharides choisis parmi les oligosaccharides susmentionnés, dans la mesure où les procédés de fabrication de ces structures produisent de tels mélanges.

Outre le constituant oligosaccharide, les compositions de l'invention peuvent contenir les ingrédients habituellement incorporés dans ce genre de compositions. Il va de soi évidemment qu'il convient d'éviter d'incorporer aux compositions des ingrédients dont les propriétés interféreraient avec le but recherché, qui est de favoriser le développement de la microflore vaginale bénéfique et le maintien de conditions acides.

A cet égard, il convient d'éviter d'incorporer des ingrédients bactéricides en des proportions qui annihileraient la microflore endogène ou des ingrédients conférant à la composition un caractère basique prononcé.

Par exemple, il serait préférable d'éviter d'utiliser de fortes proportions d'agents tensio-actifs ioniques, tels que le laurylsulfate de sodium, dont les propriétés bactéricides sont bien connues. Si l'on souhaite incorporer une forte proportion d'un agent tensio-actif dans la composition (par exemple dans le cas d'un savon liquide), on utilisera plutôt un agent tensio-actif non-ionique, tel qu'un alkyl glucoside ou un ester de dialkyle.

Cependant, incorporer aux compositions de l'invention une faible proportion (par exemple moins d'environ 1 % en poids) d'agent conservateur ayant une action bactériostatique et, éventuellement, anti¬ fongique peut être toléré, voire même se révéler avantageux, pour permettre la conservation desdites compositions pendant de longues périodes.

Avantageusement, les compositions de l'invention contiennent un tampon acide ajustant le pH de la composition dans la gamme de 4 à 7, de préférence de 4,5 à 6, tel qu'un tampon acide lactique/lactate de sodium, de façon à favoriser la réimplantation rapide de la microflore.

Les oligosaccharides peuvent être incorporés à n'importe quel type de composition appropriée pour une application locale au niveau du vagin, telle que savon liquide, gel vaginal, etc., canule ou ovule à usage intra- vaginal, ou tout dispositif médical adapté.

De préférence, il s'agit d'un canule ou ovule à usage intra-vaginal.

Une telle composition est plus particulièrement destinée à Ia prévention et au traitement des vaginoses bactériennes, par un effet de stimulation/reconstitution de la flore lactique résidente par effet direct d'un oligosaccharide de structure bien déterminée.

Ces compositions peuvent être préparées facilement par les techniques couramment en usage dans le domaine ici considéré.

Selon un deuxième aspect, la présente invention concerne l'utilisation d'au moins un oligosaccharide choisi parmi les oligosaccharides sélectionnés par la Demanderesse pour la préparation d'une composition, de préférence destinée au traitement de la muqueuse vaginale, visant à favoriser le développement et la croissance d'une microflore vaginale bénéfique.

De préférence, ledit oligosaccharide est le GOS α(1→ 6), le cas échéant contenant une liaison α(1→ 4) à l'extrémité réductrice, de DP égal à au moins 4.

Une telle microflore comprend en particulier des lactobacilles et, de préférence, au moins un lactobacille choisi parmi les lactobacilles suivants : Lactobacillus sp. oral clone (ou L. vaginalis) enregistrée le 29/07/04 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro 1-3255; L crispatus enregistrée le 20/12/01 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I-2769; L jensenii enregistrée le 29/07/04 à la Collection Nationale de Cultures de Microorganismes (CNCM) sous le numéro I- 3256 ; et L gasseri enregistrée le 25/08/05 à la CNCM sous le numéro I- 3495.

De préférence, ladite composition est destinée à prévenir ou à traiter une vaginose bactérienne.

La composition ainsi préparée est également particulièrement utile pour une application cosmétique, essentiellement locale. D'autres aspects et avantages de la présente invention ressortiront de manière claire de la description expérimentale détaillée ci-après, comprenant des exemples fournis à titre purement illustratif.

PARTIE EXPERIMENTALE

I- Les oligosaccharides

1-1 Les fructo-oligosaccharides (FOS)

Les FOS sont des fructo-oligosaccharides à courte chaîne constitués de molécules de fructose et pouvant contenir une molécule de glucose à l'une des extrémités (en fonction de l'origine du FOS). Les FOS existent à l'état naturel dans un certain nombre de plantes comme l'oignon, la tomate, l'artichaut, la banane, le topinamb.our, l'asperge, le poireau, le blé, le seigle et l'ail.

Les FOS peuvent être produits industriellement par 2 procédés différents : - le FOS Raftilose® (Orafti, Belgique) provenant de l'hydrolyse de l'inuline de chicorée; il existe également d'autres producteurs de ce type de FOS, - le FOS Actilight® (Béghin Meiji, France) obtenu par synthèse enzymatique. o Le FOS Raftilose ®1

Le FOS Raftilose® est obtenu à partir de l'inuline de racine de chicorée hydrolysée partiellement par une endoinulinase spécifique. L'inuline est un polymère linéaire de fructose lié en /?2-1 avec à l'une des extrémités un glucose lié en αλ- β2.

endoinulinase (Fra)n- Fru- Glc ^ (Fru)m - Fru - Fm + (Fru)p - Fru - GIc β2-l β2-αl β2-l β2-l β2-l β2-αl inuline FOS Raftilose® GIc = résidu glucoside / Fru = résidu fructoside β2-αl = liaison de type β-(2ol)-α / β2-l = liaison de type β-(2→l) n » m > p

Mode de production du FOS Raftilose ®

A partir d'inuline dont le degré de polymérisation (DP) varie de 2 à 60

environ, un mélange d'oligofructoses (DP2 à DP7) ainsi que quelques

résidus de glucose, fructose et saccharose sont obtenus.

-1

Structure du FOS Raftilose ® o Le FOS Actilight®

Le FOS Actilight® est produit à partir de saccharose et d'une enzyme, la β~ fructosyl transférase selon le mécanisme enzymatique suivant :

fructosyltransférase n (Fru-Glc) ^ (Fm)n-1 - Fru - GIc + (n- I) GIc β2-αl β2-l β2-αl saccharose FOS Actilight® GIc = résidu glucoside ou glucose / Fm = résidu fructoside β2-αl = liaison de type β-(2<-»l)-α / β2-l = liaison de type β-(2→l)

Synthèse enzymatique du FOS Actilight®

La fructosyl-transférase est produite par Aspergillus niger ou Aureobasidium pullulans (Hidaka ét al. (1991)).

A partir de n molécules de saccharose, un mélange de saccharose, glucose et de fructooligosaccharides est obtenu. Le FOS Actilight® est ensuite purifié par chromatographie. Le FOS Actilight® est constitué de 3 molécules : - G-F2 (DP3) contenant une molécule de glucose et deux molécules de fructose, - G-F3 (DP4) contenant une molécule de glucose et 3 molécules de fructose, - G-F4 (DP5) contenant une molécule de glucose et 4 molécules de fructose (Bornet, Industries Alimentaires et Agricoles Juillet-Août (2001 ), pages 74-80). Structure du FOS Actilight .©

G-F3 G-F4 Nystose Fructosyl

1-2 Les gluco-oligosaccharides (GOS)

Les GOS sont des gluco-oligosaccharides à courte chaîne constitués d'un

enchaînement d'unités glucose liées en a^-6 et pouvant contenir

également des liaisons α1-2, α1-3 et σ1-4 (Monsan et Paul, 1995).

o Le GOS a1-6

Le GOS alpha 1-6 est un gluco-oligosaccharide linéaire constitué d'un

enchaînement d'unités glucose liées entre elles par des liaisons alpha 1-6.

Il est obtenu par une réaction de transglucosylation enzymatique à partir

d'un donneur, le saccharose, sur un accepteur qui peut être le glucose,

l'alpha-glucoside de méthyle, l'isomaltose, l'isomaltotriose et le maltose. Cette réaction est catalysée par la glucosyltransférase de Leuconostoc

mesenteroides NRRL B-512(F) selon la réaction suivante :

glucane-sacchaïase mélange GIc - GIc + n (Glc-Fru) W (GIc)n-GIc-GIc + nFru αl-4 αl-β2 αl-6 αl-4 maltose saccharose GOS αl-6/αl-4 (accepteur) (donneur) GIc = résidu glucoside / Fm = résidu fructoside ou fructose αl-x = liaison de type α-(l→x) / cd-β2 = liaison de type α-(l-θ-2)-β

Synthèse enzymatïque du GOS or 1-6

Structure du GOS σ1-6

Dans les exemples ci-après, l'accepteur utilisé est le maltose

(disaccharide glucosylα1-4glucose). Les oligosaccharides GOS α1-6

contiennent donc tous la liaison glucosidique α1-4 de l'accepteur maltose

à leur extrémité réductrice.

o Le GOS a1-2/a1-6

Le GOS α1-2/1-6 est constitué d'un enchaînement de résidus de glucose

liés en α1-6 et contenant des liaisons en α1-2 (point de ramification ou extrémité non réductrice). Il est obtenu selon le même procédé que celui utilisé pour la production du GOS α1-6, mais l'enzyme utilisée est produite par une autre souche, Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299.

Structure du GOS cr1-2/1-6

II - Exemple 1

11-1 Isolement et caractérisatîon des souches de lactobacilles d'origine vaginale

Des souches vaginales ont été sélectionnées à partir d'une population de 1000 femmes menstruées et âgées de 18 à 40 ans en fonction de 3 critères : • Critères biologiques : - absence d'infections du type vaginite ou vaginose - flore vaginale normale à forte population en lactobacilles • Critères technologiques des souches isolées : - croissance correcte sur milieu de type MRS (Man, Rogosa et Sharpe) - résistance à la conservation à -8O0C. • Critères de sélection des souches isolées : - adhésion aux cellules épithéliales vaginales - forte production de peroxyde d'hydrogène (H2O2) et d'acide lactique - inhibition de la croissance de souches pathogènes vaginales - présence d'une activité arginine désaminase

3 souches de lactobacilles vaginaux ont ainsi pu être sélectionnées et identifiées par séquençage de I'ADNR 16S (Centre de typage moléculaire, Institut Pasteur de Lille, France) : • 1-3255 : 99% d'homologie de séquence avec Lactobacillus sp. Oral clone 96% d'homologie de séquence avec Lactobacillus vaginalis représentative de Lactobacillus vaginalis (hétérofermentaire stricte, produit les formes D et L de l'acide lactique) • 1-2769 : 99% d'homologie de séquence avec Lactobacillus crispatus représentative de Lactobacillus crispatus (homofermentaire stricte, produit les formes D et L de l'acide lactique) • 1-3256 : 99% d'homologie de séquence avec Lactobacillus jensenii représentative de Lactobacillus jensenii (homofermentaire stricte, produit seulement la forme D de l'acide lactique)

Ces souches sont représentatives de la flore de Doderleïn (flore lactique endogène protectrice naturelle de la muqueuse vaginale). Elles ont été retenues pour leur capacité à produire du peroxyde d'hydrogène, à acidifier rapidement le milieu de culture et à adhérer fortement aux cellules de la muqueuse vaginale.

De plus, une souche de l'espèce Lactobacillus gasseri, enregistrée le 25/08/05 à la CNCM sous le numéro 1-3495, présente fréquemment dans la flore de Doderleïn (Tarnberg et al., 2002), a également été étudiée vis à vis de son aptitude à utiliser les oligosaccharides sélectionnés comme source de carbone.

11-2 Souches pathogènes

Les souches choisies sont celles qui provoquent les pathologies les plus fréquentes du système urogénital à savoir : • Candida albicans (souche ATCC 2091 ), responsable de certaines vaginites • Escherichia coli uropathogène (souche CIP 54.8T), responsable d'infections urinaires • Gardnerella vaginalis (souche issue d'un isolement clinique), responsable de vaginoses bactériennes.

11-3 Oligosaccharides testés

4 oligosaccharides ont été testés :

- FOS Actilight® 950P (fourni par la société BEGHIN-MEIJI (France)).

- FOS Raftilose® P95 (fourni par la société ORAFTI (Belgique)).

- GOS α1-2/α1-6 (fourni par la société SOLABIA (France)).

- GOS α1 -6 (produit fabriqué par GENIBIO (France)).

Leur composition est précisée dans le Tableau 1. Tableau 1. Structure et composition des oligosaccharides testés.

5 * Glcp = résidu glucopyranoside

FrUf = résidu fructofuranoside

f n = 1 à 3 et m = 1 à 6 (m peut être > à 6, jusqu'à environ 15-20 en 10 fonction des conditions de réaction) 11-4 Mise en œuvre des cultures de lactobacilles et de pathogènes vaginaux

Pour évaluer la capacité de chaque souche à utiliser les oligosaccharides étudiés comme source de carbone, le glucose présent à l'origine dans les milieux de culture spécifiques de chaque souche, est remplacé par l'oligosaccharide testé.

L'évolution de la croissance de la microflore est suivie au cours du temps par différents paramètres :

- turbidité du milieu de fermentation (mesure de la turbidité à 640 nm), - pH du milieu de fermentation, - nombre de cellules microbiennes (numération sur cellule de Malassez), - consommation des oligosaccharides par un dosage HPLC.

Les lactobacilles produisent de l'acide lactique qui est un des moyens de défense de l'écosystème vaginal contre la colonisation des pathogènes. Ce dernier est dosé selon une méthode enzymatique.

II-4.1 JOUR 1 : Pré-culture des souches

Afin de diminuer la durée de la phase de latence lors de la fermentation, une pré-culture de 24h est réalisée. Dans 15 mL de bouillon de culture spécifique de la souche étudiée, environ 107 bactéries sont introduites (équivalent à 1 cryotube contenant 1 mL de culture à 35 % de transmittance à 640 nm et conservé à -2O0C).

Le Tableau 2 présente pour chaque souche le milieu de culture utilisé et les conditions d'incubation. Tableau 2. Milieux de culture et conditions d'incubation pour chaque souche.

II- 4. 2 JOURS 2-3-4 : culture des souches

En fonction de l'objectif de l'expérience et des souches étudiées, les milieux et les volumes de fermentation ainsi que les conditions d'incubation ne sont pas les mêmes (Tableau 3). Des fermentations en petits volumes sont réalisées afin d'identifier rapidement des souches ou des sucres intéressants. Des fermentations en grand volume permettent de faire un suivi plus précis au cours du temps. Tableau 3. Conditions de culture en fonction de la souche étudiée

Dans tous les cas, le milieu de fermentation est additionné de

l'oligosaccharide à tester à une concentration de 10 g/L. L'inoculation de Ia

culture est réalisée avec un volume de la pré-culture égal à 2 % du volume

de la culture. L'incubation dure 48h à 370C.

Une fermentation témoin avec chaque milieu de culture spécifique utilisé

contenant 10 g/L de glucose au lieu de 10 g/L d'oligosaccharide est

également réalisée. Composition des milieux de fermentation

o Bouillon MRS reconstitué sans glucide (g/1) Tryptone 10

Extrait de viande 10

Extrait de levure 5

Tween 80 1 ,08

K2HPO4 2 Acétate de sodium 5

Ammonium citrate 2

MgSO4, 7H2O 0,2 MnSO4, H2O 0,05

PH 6,4

o illon Trypcase Soja reconstitué sans Peptone pancréatique de 17 caséine

Peptone papaïnique de soja 3

NaCI 5

K2HPO4 2,5

PH 7,3

o Bouillon Sabouraud reconstitué sans glucide (g/L) Peptone pancréatique de 5 caséine

Extrait de viande 5

pH 5,7 Bouillon Schaëdler reconstitué sans glucide (g/L) Tryptone 5 Extrait de levure 5 Peptone de caséine 5,67 peptone de soja 1 NaCI 1 ,67 K2HPO4 0,83 Tris trizma base 3 Hémine 0,01 L~cystine 0,4 Vitamine K3 0,0005 Sang de mouton stérile 5%

PH 7,3

Le sang est ajouté après avoir stérilisé le bouillon par la chaleur. 11-5 ANALYSES EFFECTUÉES

11-5.1 Suivi de la croissance

11-5.1.1 Mesure de la turbidité

La turbidité de la culture microbienne est évaluée par spectrophotométrie à 640 nm, après dilution au 1/10éme (HeΛios β - Thermospectronic, Royaume Uni). La cinétique d'augmentation de la turbidité permet ensuite de calculer les paramètres physiologiques de croissance pour chaque souche en fonction de l'oligosaccharide. Le temps de génération est déterminé grâce au logiciel LISEXEL (Jean-Louis Uribelarrea, DGBA- INSA, Toulouse, France).

11-5. 1.2 Numération cellulaire

La numération cellulaire est réalisée par un dénombrement sur cellule de Malassez. Une numération de la pré-culture est effectuée, ainsi que toutes les 24h sur la culture afin d'estimer la population tout au long de la fermentation. Cette numération sur cellule de Malassez permet également de vérifier la pureté de la culture.

11-5.2 Suivi de l'acidité

11-5.2.1 Mesure du pH Le suivi du pH dans le milieu au cours de la fermentation est réalisé à l'aide d'un pH - mètre (Denver Instrument, Allemagne). 11-5. 2. 2 Dosage de l'acide lactique

L'acide lactique présent dans les surnageants de fermentation (après centrifugation du milieu de culture pendant 5 min à 12 000g pour éliminer les bactéries) est dosé à l'aide d'un kit enzymatique (Enzytec™ D/L-lactic acid, Diffchamb, France).

Il- 5.3 Dosage des sucres par HPLC

//- 5. 3. 1 Traitement des échantillons issus de la fermentation

Les milieux de fermentation utilisés étant complexes, de nombreux pics apparaissent sur le profil chromatographique et gênent l'interprétation des oligosaccharides. Avant l'analyse, les échantillons sont préalablement déminéralisés à l'aide de résines échangeuses d'ions. 2 types de cartouches SPE ont été utilisés : - Cartouche SAX Extract-clean (Alltech, France) : résine échangeuse d'anions sous forme acétate, éliminant les composés chargés négativement, - Cartouche SCX Extract-clean (Alltech, France) : résine échangeuse de cations sous forme H+, éliminant les composés chargés positivement.

//- 5.3.2 Conditions d'analyse HPLC Les conditions d'analyse HPLC mise au point pour l'étude de la consommation de sucres par la microflore sont définies dans le Tableau 4. Tableau 4. Conditions d'analyses HPLC selon les sucres étudiés

Dans tous les cas, la détection se fait par réfractométrie.

Malgré le traitement des échantillons sur cartouches SPE, certains milieux de fermentation créent des interférences qui ne permettent pas de suivre la consommation de certains DP. Seuls les DP ≥3 du FOS Actilight et les DP >4 du FOS Raftilose, des GOS σ1-6 et des GOS α1-2 / α1-6 ont pu être analysés. 11-6 Résultats et interprétation

Tableau 5. Paramètres de croissance des 3 souches de lactobacilles

sélectionnées en présence des différents glucides. LACTOBACILLES GLUCIDE PARAMETRES DE CROISSANCE SELECTIONNES Δmax T ' Δmax pH * [lactate] §

glucose 0,598 00:48 2,2 10,9

1-3255 FOS Actilight® 0,318 00:58 1,6 4,1 Lb. vaginalis FOS Raftîlose ® 0,055 01:31 0,6 1,2

GOSα-1,6 0,173 01:10 1-4 3,9

GOSα-1,2/α-1,6 0,208 01:30 1,3 3,4

glucose 0,466 01:01 1,9 10,7

FOS Actilight ® 0,274 01:00 1,4 3,3 1-2769 FOS Raftîlose ® 0,083 01:24 0,6 0,0 Lb. crispatus GOS α-1,6 0,344 01:10 1,6 7,3

GOSα-1,2/α-1,6 0,262 01:13 1,2 3,0

glucose 0,392 01:00 1,9 9,1

FOS Actilight® 0,236 01:01 1,3 3,3 1-3256 FOS Raftilose ® 0,083 01:15 0,3 0,4 Lb. jensenii GOS α-1,6 0,262 01:01 1,8 7,6

GOSα-1,2/α-1,6 0,345 01:06 1,3 3,3 * Δmax T = variation maximale de turbidité à 640 nm comparée à la valeur

initiale

f G = temps de génération (h :min)

* Δmax pH = variation maximale de pH comparée à la valeur initiale

§ [lactate] = concentration de lactate en fin de fermentation (g/L) Les valeurs de consommation du glucose et des oligosaccharides indiqués dans les Tableaux 6 à 10 sont exprimées en % de la quantité initiale présente dans le milieu de culture.

Tableau 6. Consommation de chaque glucide après 48 h de fermentation par les 3 souches de lactobacilles sélectionnées (%).

LACTOBACILLES DEGRE DE GLUCIDE I-3255 1-2769 1-3256 POLYMERISATION Lb. Lb. Lb. vaginalis cήspatus jensenii glucose - 100 100 100 DP3 76 76 81 FOS Actilight ® DP4 <10 24 <10 DP5 <10 ≤10 ≤10 DP4 ≤10 <10 ≤10 FOS Raftilose ® DP5 <10 ≤10 ≤10 DP4 37 100 100 OS α-1,6 DP5 <10 94 96 DP6 ≤10 96 94 DP4 39 80 100 DP5 (α-1,2) <10 ≤10 ≤10 OS α-1,2/α-1,6 DP5 <10 71 100 DP6 (α-1,2) ≤10 ≤10 ≤10 DP6 ≤10 36 86 Tableau 7. Consommation des 2 oligosaccharides sélectionnés par la souche Lactobacillus gasseri 1-3495 après 48 h de fermentation (%).

Tableau 8. Consommation des 2 oligosaccharides sélectioi vi v vinnés après 48 h O O O de fermentation par les 3 souches de microorganismes pathogènes (%). MICROORGANISMES DEGRE DE PATHOGENES GLUCIDE POLYMERISATION C. albicans E. coli G. vaginalis ATCC 2091 CIP 548T CIP 7074T glucose - 93 52 ≤10 DP3 ≤10 21 <10 FOS Actilight ® DP4 ≤10 19 ≤10 DP5 <10 14 ≤10 DP4 <10 ≤10 GOS α-1,6 DP5 <10 <10 DP6 ≤10 ≤10 Tableau 9. Consommation de différents glucides en fonction du degré de polymérisation par les 2 souches de lactobacilles sélectionnées (%). LACTOBACILLES DEGRE DE GLUCIDE POLYMERISATION I-2769 I-3256 Lb. crispatus Lb. jensenii

glucose - 99 95

panose DP3 81 77

GOS α-1,6/α-1,4 DP4 à DP6 90 82

Le panose, ou GOS α-1 ,6/α-1,4 de DP égal à 3, possède la formule

suivante :

GIc - GIc - GIc α1-6 α1-4

Tableau 10. Consommation de différents glucides en fonction du degré de

polymérisation par 2 souches de microorganismes pathogènes (%).

MICROORGANISME DEGRE DE PATHOGENE GLUCIDE POLYMERISATION C. albicans E. coli ATCC 2091 CIP 548T

glucose - 98 41

panose DP3 46 < 10

GOS α-1,6/α-1,4 DP4 à DP6 < 10 < 10

Les consommations inférieures ou égales à 10% sont négligeables.

Parmi les 4 oligosaccharides testés, le FOS Raftilose® n'est quasiment

pas consommé et ne permet donc pas une croissance suffisante des

souches.

Concernant le GOS α1-2/α1-6, les oligosaccharides, contenant au moins

une liaison α1-2, ne sont pas consommés par les lactobacilles. Ce type de

liaison n'est pas hydrolysable par les enzymes bactériennes.

Pour le FOS Actilight®, seul le DP3 est consommé. Il assure une croissance « efficace » des lactobacilles à lui seul. En effet, il permet l'obtention d'un faible temps de génération, avec une turbidité maximale et une bonne acidification du milieu de fermentation. Le GOS α1-6 est particulièrement bien consommé par les 3 souches I- 2769, I-3256 et I-3495. Il permet d'obtenir un bon niveau de croissance et de production d'acide lactique. Par contre, le FOS Actilight® et le GOS α1-6 ne sont pas consommés par les 3 pathogènes du système urogénital. Ces 2 oligosaccharides présentent donc un potentiel prébiotique remarquable vis à vis de la flore vaginale bénéfique (flore lactique dite de Doderleïn), car ils constituent un substrat de croissance de cette flore à la fois très efficace et très spécifique. Les résultats présentés dans les tableaux 9 et 10 montrent l'utilisation sélective des GOS α-1, 6/ α-1 ,4 de DP>4 par les lactobacilles. Bien que la souche pathogène E.coli consomme très faiblement le GOS α-1, 6/ σ-1,4 de DP3 (panose), le fait que C. albicans consomme 46% du DP3 est suffisant pour permettre à cette souche pathogène de se développer. Par contre, les souches E. coli et C. albicans ne consomment pas les GOS α-1 ,6/ α-1 ,4 de DP4 à DP7, contrairement aux lactobacilles. Ainsi, l'utilisation d'une composition comprenant au moins ou étant constitué par le GOS linéaire #-1,6/ σ-1 ,4 de DP égal à 4 et, le cas échéant, comprenant et/ou étant constitué par en outre les GOS α-1 , 6/ α- 1 ,4 de DP>4, favorise la croissance d'une microflore vaginale bénéfique.

III- Exemple 2

Un mélange constitué de FOS Actilight®, de GOS α1-6 et d'acide lactique a été formulé de la façon suivante : • FOS Actilight® : 50% (p/p) • GOS α1-6 : 40% (p/p) • acide lactique : 10% (p/p). Des cultures des lactobacilles vaginaux 1-3255, 1-2769 et 1-3256, ainsi que

des pathogènes E. coli, C. albicans et G. vaginalis, ont ensuite été

réalisées dans le milieu de culture standard reconstitué et additionné de

10 g/L du mélange ainsi préparé. Les résultats sont présentés dans le

Tableau 11.

Tableau 11. Résultats des fermentations des 3 souches de lactobacilles

vaginaux en présence du mélange FOS Actilight®/GOS α1-6/acide

lactique à 10 g/L.

* Δmax T = variation maximale de turbidité à 640 nm comparée à la valeur

initiale

f G = temps de génération (h :min)

* Δmax pH = variation maximale de pH comparée à la valeur initiale

Les croissances des lactobacilles observées avec le mélange FOS

Actilight®/GOS α1-6 / acide lactique atteignent les mêmes niveaux qu'avec

chaque oligosaccharide utlisé seul.

Le mélange FOS Actilight®/GOSα1-6 / acide lactique est bien consommé

par les 3 souches probiotiques testées, alors qu'il ne l'est pas par les

souches pathogènes. Au vu de ces résultats, il apparaît clairement que le GOS α1 -6 (> DP4) et le FOS Actilight® (DP 3) constituent des oligosaccharides prébiotiques spécifiques vis-à-vis de la flore vaginale bénéfique. Tous les oligosaccharides prébiotiques à visée intestinale et en particulier ceux décrits dans EP 591 443 ne sont donc pas utilisables dans le cadre de la présente invention. Il va de soi que les modes de réalisation décrits ne sont que des exemples et l'on pourrait les modifier, notamment par substitution déquivalents techniques, sans sortir pour cela du cadre de l'invention.