Insbesondere das mittlere Spektrum der UV-Strahlung (UVB, 280-210 nm) ist verantwortlich für diesen Effekt in Keratinozyten. Neben akuten Effekten wie Sonnenbrand und Immunsuppression können als Langzeiteffekte Hauttumore entstehen. Die Verbindung zwischen UV-Strahlung und deregulierter Genexpression bei Hauterkrankungen läßt vermuten, daß Gene, die an der physiologischen UV-Antwort beteiligt sind, ebenfalls bei pathologischen Prozessen in der Haut von Bedeutung sind.

Die molekularen Vorgänge bei der physiologischen UV-Antwort und der UV- Karzinogenese sind nur unvollständig aufgeklärt und erst wenige Gene konnten in diesem Kontext identifiziert werden.

Bedingt durch die methodischen Ansätze wurde bisher der reprimierende Effekt auf die Genexpression der UV-Strahlung nicht systematisch erfaßt (1-3).

Der Familie der Serin-Proteinase-Inhibitoren (Serpine) beinhaltet hochmolekulare (40-60 kDa) Proteine mit einer einzigen Aminosäurekette, die durch eine hoch geordnete Tertiärstruktur charakterisiert ist. Definiert wird diese Tertiärstruktur durch al-Antitrypsin (al-PI) (5), dem Prototyp aller Serpine. Die aus 9 a- Helices und 3 ß-Faltblattern bestehende Tertiärstruktur mit spezifischen Faltungseigenschaften ist elementar für die Funktion der Proteaseinhibitoren. Die inhibitorische Spezifität wird dabei in erster Linie durch die Aminosäureester in

Pl-Pl'Position im reaktiven Zustand nahe des C-Terminus des Proteins bestimmt. Dieser metastabile Zustand des Proteins macht infolge einer Interaktion mit dem reaktiven Zentrum einer Zielprotease eine Konformationsänderung durch und bildet schließlich einen kovalenten Serpin-Proteinase-Komplex (6).

Durch Aminosäurevergleiche, charakteristische Eigenschaften der Proteine und Genomorganisation konnte innerhalb der großen Serpinfamilie die Ovalbumin- Familie (Ov-Serpine) von intrazellulären Serpinen identifiziert werden (7).

Serpine sind an einer Vielzahl von wichtigen Proteinase-vermittelten physiologischen Funktionen wie Blutgerinnung, Fibrinolyse, Entzündung, Zellmigration, Umbau extrazellulärer Matrix (8) sowie Aktivierung von Interleukin-Vorläufern (9) beteiligt.

Eine wachsende Zahl neuer Daten zeigt eine Beteiligung von Serpinen bei der Regulation von Proteinasen, die an Schlüsselstellen apoptotischer Vorgänge stehen (10-13). In humanen Keratinozyten sind Serpine, wie für PAI-1 gezeigt (14), bei der Migration und Differenzierung von Zellen sowie im Kontext der Wundheilung von Bedeutung. Für PAI-2 konnte in Keratinozyten eine Beteiligung an intrazellulären Prozessen, die mit der terminalen Differenzierung und Bildung der verhornten Zellwand ("cornified envelope") in Zusammenhang stehen, demonstriert werden (15).

Der Erfindung liegt das technische Problem zugrunde, ein Werkzeug zu finden, mittels welchem die eingangs genannten Krankheiten bzw. Effekte untersucht werden können und mittels welchem Wirkstoffe zur Behandlung dieser Krankheiten gefunden werden können. <BR> <BR> <P>Zur Lösung dieses Problems lehrt die Erfindung die Gegenstände der Ansprüche 1 bis 20. Als Allele sind durch Translokation, Punktmutation und/oder Deletion abgeleitete Gene bezeichnet. Als Homologe sind komplementäre bzw. hybridisierte Nukleinsäuren bezeichnet.

Durch die Anwendung der differentiellen mRNA Display Polymerase Kettenreaktion (DD-PCR) (4) boten sich hier neue Möglichkeiten zur Identifizierung und Klonierung UV-regulierter Gene. Ähnlich wie die subtraktive cDNA-Hybridisierung ist keine Kenntnis über die Sequenz der zu isolierenden Gene notwendig. Einzig ein quantitativer Unterschied der relevanten Sequenzen in den zu vergleichenden Zellpopulationen ist für die Identifizierung erforderlich.

Dies ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von bekannten und unbekannten Genen. Im Unterschied zur subtraktiven cDNA-Hybridisierung ist bei der DD- PCR die vergleichende Analyse nicht auf 2 Zellpopulationen beschrankt, sondern es können soviele Populationen nebeneinander analysiert werden, wie gleichzeitig gehandhabt werden können. Da zudem auch quantitative Unterschiede dargestellt werden können, ermöglicht dies die Erfassung der Expressionskinetik UV- regulierter Gene. Dabei können im Unterschied zu anderen Methoden zur gleichen Zeit sowohl UV-induzierte als auch UV-reprimierte Gene erfaßt werden.

Die vorliegende Anmeldung beschreibt die Identifizierung, Aufklärung und Analyse der vollständigen cDNA-Sequenzen eines neuen Serin-Protease- Inhibitors sowie seine Zuordnung als Familie der Ovalbumin-Serpine. Das neue Serpin ist in der Keratinozyten-Zellinie HaCaT als UVB-reprimierbare Sequenz isoliert worden und wurde daher als"hurpin"für HaCaT UV repressible serpin bezeichnet. Das Genom Data Base nomenclature commitee hat für hurpin die systematische Bezeichnung proteinase inhibitor 13 (PI13) reserviert (confidential). Untersuchungen zur Expression zeigen, daß hurpin spezifisch in Keratinozyten exprimiert wird. Darüber hinaus weisen die Ergebnisse auf eine Verknüpfung von hurpin mit der Proliferation und Aktivierung von humanen Keratinozyten hin. Weiterhin zeigt sich bei der Psoriasis eine deutliche Überexpression von hurpin in befallener Haut im Vergleich mit unbefallener Haut.

Eine mögliche Funktion von hurpin in diesem Zusammenhang könnte die Verhinderung von apoptotischen Vorgängen in Keratinozyten sein.

Die Identifizierung eines neuen UV-reprimierbaren Serin-Protease-Inhibitors und die Assoziation mit einer benignen, proliferativen Hauterkrankung (Psoriasis) bietet Ansatzpunkte für : die Aufklärung der molekularen Mechanismen der Erkrankung die Etabilierung neuer klinischer Parameter zur Verlaufskontrolle die Entwicklung neuer Behandlungsstrategien.

Im folgenden werden die Anwendungsbereiche der Erfindung näher erläutert : Die ausschließliche Expression von hurpin in Keratinozyten läßt eine Funktion vermuten, die mit der spezifischen Aufgabe der Haut in Verbindung steht.

Die bisherigen Daten weisen auf eine Beteiligung an Prozessen der Proliferation und Differenzierung der Haut hin. Die Differenzierung der Haut stellt eine spezielle Form des programmierten Zelltodes (Apoptose) dar. Entsprechend wird für hurpin eine Rolle bei dieser speziellen Form von apoptotischen Vorgängen in der Haut postuliert. Allgemein kann damit von einer Rolle für hurpin in der Homöostase der Haut ausgegangen werden. Neben physiologischen Vorgängen die mit der Barrierefunktion der Haut verknüpft sind, schließt dies ebenfalls Vorgänge bei der Wundheilung und entzündlichen Vorgängen der Haut ein.

Hieraus ergibt sich ebenfalls eine Beteiligung von hurpin an pathologischen Störungen dieser Vorgänge wie bisher für die Psonasis gezeigt. Dies schließt insbesondere Störungen der Differenzierung und Proliferation von Keratinozyten im Rahmen der Karzinogenese epidermalen Tumoren ein.

Damit ergeben sich für hurpin folgende Anwendungsschwerpunkte : Diagnose : Pathologische Vorgänge der Haut an denen hurpin beteiligt ist werden durch eine deregulierte Expression von hurpin charakterisiert sein. Entsprechend kann eine Verlaufskontrolle und/oder ein molekulare Typisierung der verschiedenen

klinischen Erscheinungsformen einer Erkrankung durch Untersuchungen zur Expression von hurpin auf Ebene der Nukleinsäure und des Proteins erfolgen.

Diagnostische und prognostische Aussagen lassen sich auch durch den Nachweis von Mutationen des Gens für hurpin machen. Diese Mutationen können sowohl eine funktionelle Veränderung regulatorischer Elemente des Gens als auch ein funktionell verändertes Protein bedingen.

Therapie : Antisense-Therapie : Durch antisense Oligonukleotide die mit Hilfe von Liposomen oder anderen geeigneten Transportern in die epidermalen Keratinozyten eingebracht werden, kann die Tranlation der hurpin-mRNA unterbunden werden. Hierdurch kann die pathologische Überexpression postranskriptionell korrigiert werden.

Inhibitor-Therapie : Eine funktionelle, postranslationelle Korrektur einer pathologischen hurpin Expression kann über die Applikation eines spezifischen, blockierenden Peptids oder Proteins erfolgen. Die Einbringung der Peptide/Proteine in die Keratinozyten würde analog zur Applikation von antisense Oligonukleoiden erfolgen.

Anwendungen bei der Entwicklung von Pharmaka und Kosmetika Zur Selektion von pharmakologisch wirksamen Substanzen kann die Expression von hurpin als Testparameter Anwendung finden. Hierdurch können in der Zellkultur oder im Ex-vivo Hautmodell Substanzen identifiziert werden, die eine Modulation der hurpin Expression ermöglichen.

Aufgrund der UV-Regulation von hurpin können ebenfalls photoprotektive Substanzen in den erwähnten Testmodellen auf ihre Wirksamkeit überprüft werden.

Folgend wird die Erfindung durch verschiedene Versuche näher erläutert.

Methoden Chemikalien, Radioisotope und Enzyme Wenn nicht anders gekennzeichnet, wurden die verwendeten Chemikalien in p. A. Qualität von den Firmen Flow Laboratories, Gibco BRL, Merck, Roth, Serva oder Sigma bezogen.

Die verwendeten Radiochemikalien wurden über ICN bezogen.

Restriktionsendonukleasen und andere Enzyme wurden, wenn nicht anders vermerkt, von Boehringer (Mannheim), Gibco BRL, New England BioLabs oder Pharmacia bezogen.

Zellkultur Das epidermoide Zelline HaCaT wurde von Prof. Fusenig eingesetzt (16). Primäre Keratinozyten werden aus Hautstücken, die bei plastischen Operationen entfernt und normalerweise verworfen werden, gewonnen. Hierzu wurde die in 1 x PBS gelagerte Haut unter sterilen Bedingungen vom Fettgewebe befreit und in kleine Stücke (ca. 5 mm x 5 mm) zerteilt. Die Stücke wurden 1 x PBS gewaschen und anschließend in Petrischalen 12 bis 16 Std. bei 4 °C mit der Epidermis nach oben in Dispase (Grade II, 2,4 U/ml, Boehringer Mannheim) inkubiert. Anschließend wird die Epidermis von der Lederhaut abgezogen und in 1 x PBS gewaschen. Die Stücke werden für 5 bis max. 15 min. in einer Trypsin/EDTA-Lösung (0,2 % Trypsin und 0,2 % EDTA in 1 x PBS gelöst) bei 37 °C inkubiert. Die Keratinozyten wurden aus dem enzymatischen zersetzten Keratingerüst mechanisch freigesetzt. Durch die Zugabe von mindestens dem dreifachen Volumen 10 %-igem FCS wurde die Trypsinisierung abgestoppt. Die pelletierten primären Keratinozyten werden in Medium (s. u.) resuspendiert und für die weitere Kultivierung auf Petrischalen verteilt.

Die Zellkulturen werden in einem Inkubator bei 37 °C in einer wassergesättigten Atmosphäre mit 5 % C02 kultiviert.

HaCaT-Medium : Duibecco's Mod. Eagle Medium w. Sodium Pyruvat (GibcoBRL).

Hinzugefügt werden 5 ml Antibiotikum (Penicillin-/Streptomycin, 10000 Rg/ml, Flow-Laboratories), 5 ml L-Glutamin (200 mM), 50 ml FCS (100 %).

Keratinozyten-Medium : KBM (Keratinozytes Basal Medium, Clonetics).

Hinzugefügt werden 500, ul Gentamincinsulfat (50 mg/ml), 500 p. l Am-photericin (50 µg/ml), 500 p. l Insulin bovine (5 mg/ml), 300 1 Epidermal growth factor (0,1 µg/ml), 500 µl Hydrocortison (0,5 mg/ml).

Jeweils 15 41 des Master-Mixes wurden zu der cDNA gegeben und mit 80 1 Mineralöl als Verdunstungsschutz überschichtet.

Die Taq-Polymerase wird ebenfalls in Form eines Master-Mixes vorbereitet und nach der ersten Denaturierungs-und Bindungsphase (Annealing), dem Ansatz zugefügt ("hotstart").

Enzym-Master-Mix : 0,4 tl Taq-Enzym (5 U/pl) 0,2 µl Taq-Polymerase-Puffer (10 %) ddH2O1,4µl Im Anschluß an die erste Annealing-Phase mit 41 °C verblieben die Proben bei 42 °C. Die Ölphase eines jeden Ansatzes wurde durchgestochen und 2 p1 des Taq- Polymerase Master-Mixes hinzugefügt. Sobald alle Proben mit Enzym versehen sind, wird mit der ersten Elongationsphase begonnen.

DD-PCR-Programm

Denaturierung Primer-hot-start Elongation Bindung 1. Zyklus 95 °C/lmin. 41 °C/1 min. 42 °C 72 °C/1 min.

2. bis 40.94 °C/50 sec.-72 °C/1 min.

42 °C + 0,1 Zyklus 'C/Zykl. min.

Nach Beendigung aller PCR-Zyklen wurde eine 5'Elongationsphase bei 72 °C angehängt.

Ein Aliquot (5-7 p. I) eines jeden Ansatzes wurde mit 1/5 5 x TBE Loading-Buffer versetzt. Die Proben wurden für 3 min. bei 75 °C denaturiert und bis zum Aufragen auf Eis gelagert. Gleiche Probenvolumina wurden dann in einem 5 %- igen PAA-Gel unter denaturierenden Bedingungen bei konstant 40-45 W aufgetrennt, bis der Xylen-Xylanol-Farbmarker des Ladepuffers die untere Gelkante erreicht hatte.

Durch die Behandlung einer der beiden das Gel umgebenden Glasplatten mit Bindesilan haftet das Gel nach dem Auseinanderbau an der behandelten Platte.

Das an der Glasplatte haftende Gel wurde mit Haushaltsfolie abgedeckt. Um die Lage des für die Autoradiographie aufgelegten. Röntgenfilms exakt festzuhalten, wurden mehrere Markierungen mittels"Tracker-Tape" (RPN 2050, Amersham) am Rand des Geles angebracht. Die Exposition des Röntgenfilms erfolgte bei-70 °C ohne Verstärkerfolie.

Elution der cDNAs aus Polyacrylamidgelen Differentielle Banden werden mit seitlichen Punkten auf dem Röntgenfilm markiert und der Film mit Hilfe der"Trackertape"-Markierungen in seine ursprünglichen Position auf dem Gel gebracht und dort fixiert. Mit Hilfe einer

Nadel wurde der Film an den Markierungspunkten durchstochen und so die Position der Bande auf dem PAA-Gel gekennzeichnet. Nach Abnahme des Filmes wurde ein dünner Streifen des Geles zwischen den Einstichstellen mit einem sauberen Skalpell herausgeschnitten. Dieses Stück wurde in ein 1,5 ml Eppendorfgefäß mit 100 p1 ddH20 überführt. Zur Elution der cDNA aus dem Gelfragment wurden die Proben für 20 min. auf 80 °C erhitzt und anschließend für 2 min. bei 13000 rpm (15000 g) zentrifugiert. Der gelfreie Überstand wird in ein neues Gefäß überführt. Durch Zugabe von 10 µl 3 M NaAc (pH 5,2), 2,5 jil Glycogen (20 mg/ml) und 450 jil eiskalten Ethanols (100 %) wird die eluierte cDNA bei 20 °C über Nacht gefällt (optional für mind. 2 Std. in Ethanol auf Trockeneis). Die cDNAs werden bei 4 °C für 30 min. bei 13000 rpm (15000 g) pelletiert, der Überstand abgenommen und das Pellet mit 75 % EtOH gewaschen.

Das Pellet wird in TE (10 mM Tris pH 7,5,1 mM EDTA) gelöst.

Reamplifizierung differentieller cDNAs Die Reamplifizierung der eluierten cDNA-Fragmente erfolgte in einem 40 il PCR-Ansatz mit den gleichen Primerkombinationen, die für ihre ursprüngliche Generierung bei der DD-PCR verwendet wurden.

Jeweils 4 tl der eluierten cDNA in TE werden mit : 4 gl Primer 1 (2 µM) 4 2(2µM)Primer 3,8 p1 Taq-Polymerase-Puffer (10 %) 4 il Gelatine (0,1 %)

3,2 ul dNTP-Mix (250, uM) 15 DEPG-Wasser kombiniert und mit Mineralöl überschichtet. Zur Reduzierung von Pipettierungenauigkeiten wurden die Komponenten für mehrere Ansätze in Form eines Mastermixes kombiniert.

Das Taq-Enzym wurde wie bei der DD-PCR in j-d Ix Taq-Polymerase-Puffer im "hot-start"-Verfarhren zugegeben.

Um die Spezifität der Amplifizierung zu erhöhen wurde im Gegensatz zum DD- PCR Programm bei der Reamplifizierung ein"touch down"Protokoll verwendet. Hierbei wurde in den ersten 5 Zyklen der PCR eine erhöhte Anealing-Temperatur verwendet, die pro Zyklus so verringert wird, daß ab dem 6. Zyklus die für die Primerkombination optimale Temperatur erreicht ist. Durch die anfänglich stringenteren Bedingungen ist die Amplizierungseffektität zwar geringer, es wird aber sichergestellt, daß präferentiell das gewünschte Produkt ampliziert wird.

Nachdem so ausreichende Mengen des gewünschten Templates vorliegen, kann bei der an die Primer angepaßten Anealing-Temperatur mit hoher Effizienz ampliziert werden. Der Erfolg dies Vorgehensweise zeigte sich im nachfolgenden präparativen Agarosegel durch kaum vorhandene unspezifische PCR-Produkte. Denaturierung Primer-Bindung hot-start Elongation 1. Zyklus 95°C/1 min 50°C/1 min 50°C 72°C/2 min 2. bis 5. Zyklus 94°C/50 sec 49°C-1°C/Zykl 1 72°C/2 min min 6. bis 35. Zyklus 94°C/50 sec 45°C/1 min 72°C/2 min + 2 sec/Zykl.

Klonierung von PCR-Produkten Für die Ligation wurden die reamplizierten cDNA-Fragmente nach Größenfraktionierung im Agarosegel mit JetSorb (Genomed) nach Herstellerangaben aus dem Gel eluiert. Für die TA-Klonierung von PCR-

Produkten wurde der TA-Klonierungskit von Invitrogen nach Herstellerangaben verwendet. Die Ligation erfolge im Vektor : cDNA-Verhältnis von 1 : 3.

Herstellung einer lambda-cDNA Bank Zur Isolation von cDNA-Klonen voller Länge wurde mit poly (A) +-RNA aus HaCaT-Zellen eine cDNA-Bank in Uni-ZAP XR (Stratagene, Heidelberg) hergestellt. Die Anreicherung von poly (A) mRNA aus Gesamt-RNA wurde mit Hilfe des Oligotext mRNA Kit (QIAGEN, Hilden, Germany) entsprechend der Herstellungsvorschrift durchgeführt. Für die Herstellung der cDNA-Bank aus 4 Rg poly (A)-RNA wurde der ZAP-cDNA Klonierungskit (Stratagene, Heidelberg, Germany) nach den Vorschlägen des Herstellers mit Ausnahme folgender Modifikationen eingesetzt : * für die Herstellung des 1. Stranges cDNA wurde Superscript II Reverse Transkriptase (Gibco, BRL, Eggenstein) eingesetzt * für die Größenfraktionierung der Xho I gespaltenen cDNA wurde eine S-400 Zentrifugationssäule verwendet.

Nach Ligation der cDNA-Fraktion mit Molekülen >500 bp in Uni-ZAP-XR Vektorarme wurde die Bank unter Verwendung des Gigapack m Gold Verpackungsextraktes (Stratagene, Heidelberg, Germany) in B-Phagenpartikel verpackt.

Die nach einmaliger Amplifizierung erhaltenen cDNA-Bank hatte einen Titer von 1.4xlOlo pfu/ml.

Klonierung von cDNA-Klonen voller Länge Für die Identifizierung von hurpin cDNA-Klonen wurden 106 pfu auf Hybond-N+ Nylonmembranen (Amersham, Braunschweig) unter Verwendung von Standardmethoden (17) übertragen. Als Sonde wurde die 412bp lange HUR7 <BR> <BR> <BR> cDNA, nach radioaktiver Markierung mit [a-32P] dCTP unter Verwendung des Megaprimer DAN Markierungskits (Amersham, Braunschweig, Germany), eingesetzt. Die Nylonmembranen wurden für 2 h bei 88 °C in QuickHyb

(Stratagene, Heidelberg, Germany) prähybridisiert. Die Hybridisierung mit der radioaktiv markierten Sonde wurde dann in der gleichen Lösung über Nacht bei 68 °C durchgeführt. Anschließend wurden die Membranen unter stringenten Bedingungen (final bei 55 °C in 0.1 x SSC, 0.1 % SDS) gewaschen und positive Plaques durch Autoradiographie mit Hyperfilm (Amersham) sichtbar gemacht.

Durch eine zweite Filterhybridisierung mit immobilisierten Phagen jeweils eines positiven Plaques wurden individuelle Phagen identifiziert, die mit der HUR 7- cDNA hybridisierten. Die cDNA-Inserts dieser Phagen wurden durch in vivo Excision des pBlueScript SK Phagemid aus dem Phagengenom nach Herstellerangaben präpariert.

Restriktionsanalyse der cDNA-Klone Die cDNA-Inserts aus den pBS-Vektoren wurden mit Eco RI (2U/g) und Xho 1 herausgeschnitten. Da der pBS-Vektor eine nur unwesentlich andere Größe als sie cDNA-Fragmente hatte, wurde zur besseren Identifizierung und Trennung der Fragmente zusätzlich der Vektor mit Pvu 1 (1,7 U/ug) geschnitten. In allen Restriktionsansätzen wurde mit Boehringer-"high-salt"-Puffer gearbeitet. Für weitere Restriktionsanalysen wurden die Plasmide mit Notl, Pst I, Xba I, Sac I und Bam HI nach Standardvorschrift (17) geschnitten und in einem 1% igen Agarosegel analysiert. <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <P> Nothern-Bloth Analysen<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> 10pg Gesamt-RNA aus HaCAT-Zellen wurden in einem 1% igen Formaldehyd- Agarose-Gel größenfraktioniert und mittels Kapillar-Blot-Verfahren auf Hybond N+-Nylonmembranen (Amersham) transferiert. Northern-Blots mit poly (A) +- mRNA aus verschiedenen humanen Geweben (MTN : multiple tissue Northern blots) wurden von Clontech bezogen.

Für die Hybridisierung von Filtern wurden die DNA-Fragmente, die als Hybridisierungssonden eingesetzt wurden, mit [32P]-dCTP (3000 Ci/mmol ; ICN) unter Verwendung des"Megaprime labeling kit"von Amersham markiert. Freie

Nukleotide wurden durch Chromatographie über eine S300-Zentrifugationssäule (Pharmacia) abgetrennt. Die Einbaurate von [32P]-dCTP in die DAN wurde durch Messen eines Aliquots der Markierungsreaktion in einem Flüssigkeitsszintillationszähler bestimmt. Die spezifische Aktivität betrug 1-2 x 109 cpm/pg DAN.

Die Hybridisierung wurden in DIG-Easy-Hyb-Lösung (Boehringer Mannheim) über Nacht durchgeführt. Nach stringentem Waschen er Membranen (final 55- 60°C, 0.1% SDS, 0.1 x SSC) wurden Signale durch Exposition eines Röntgenfilms (Hyperfilm, Amersham) mit Verstärkerfolie bei-70°C sichtbar gemacht.

RT-PCR Analysen Für die reverse Transkription von RNA in cDNA wurde eine rekombinante Mo- MLV Reverse-Transkriptase ohne Rnase-H Aktivität (Superscript II, Gibco BRL) mit dem mitgelieferten 5xPuffersystem [250 mM Tris-HCI (pH 8.3), 375 mM, KCI, 15 mM MgCI2] eingesetzt. Je Ansatz wurde 1 ug Gesamt-RNA in ddH20 und 10 pmol dTi2-i8-Primer (Pharmacia) eingesetzt (Gesamt-Vol. : 1). Nach Hitzedenaturierung (10'bei 70 °C) der RNA und Abkühlen auf Eis wurden zugegeben : 4 5 x Puffer 2 0. 1 M DTT 1 ul dNTP-Mix (je 10 mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP) 1 µ Rnasin (40 U, Promega) Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1 il (200 U) Reverse-Transkriptase (RT) gestartet und lief bei 42 °C für 1 h. Inaktivierung der RT erfolgte durch 5 miniitige Inkubation des Reaktionsansatzes bei 70 °C. Die so hergestellte cDNA wurde bei -20°C gelagert. Für den Nachweis spezifischer Transkripte wurde mit Hilfe von zwei spezifischen Primern das entsprechende cDNA-Fragment in der PCR amplifiziert. Die Sequenz der verwendeten Primer wurde mit Hilfe des Computerprogramms"Oligo", Version 3.3 optimiert (Kontrolle der Duplex-

Bildung Homologie der 3'und Selbstkomplementarität,zueinander, Schmelztemperatur des Primers). Um die Reaktionsbedingungen in der PCR zu optimieren, wurden mit jedem Primer-Paar und einer Positivkontrolle mehrere Test-PCR-Analysen durchgeführt, in denen die MgCl2-Konzentration (1,5-2,5 mM) und die Temperatur (Variation der mit "Oligo" ermittelten Temperatur) während des Primer-Bindungsschrittes ("annealing") variiert wurden.

Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes : 4,7 gl lOxTaq-Puffer [100 m Tris-HCI (pH8.3 bei 25 °C), 500 mM mMMgCl2]KCl,15 1 dNTP-Mix (je 10 mM dATP, dGTP, DTTP) 0.5 ul Primer 1 (10 µm/µl) 0.5 p1 Primer 2 (10 µm/µl) x p1 60 mM MgCl2 (je nach Primer, um Endkonzentration von 2,0 mM oder 2,5 mM zu erreichen) 47)lddH20 Auflistung der bei RT-PCR-Analysen verwendeten Primer Gen/Primer Sequenz (5'-3') Hybridisierungs-MgC12 Temp. [°C] [mM] 5'TAAAGGGCAATGGGACAGGGAGT581,5hurpin1 hurpin2 GCGGATGTGACAGTAAAGCCTATG CGGGAAATCGTGCGTGACATTAF63ß-Aktin-15' GTTGGCGTACTGGTCTTTGCGGATß-Aktin-23'

ACATTA ,-Aktin-2 3'GTTGGCGTA 63 2,0 CTGGTCTTT GCGGAT Die Verdunstung während der Inkubation wurde durch Überschichten des Reaktionsansatzes mit Mineralöl verhindert. Um das Entstehen unspezifischer Produkte einzuschränken, wurde ein"hot-start"durchgeführt, bei dem 2 U Taq- Polymerase in 3 p1 1 x Taq-Puffer zum Reaktionsansatz nach dem ersten Denaturierungsschritt der PCR zugegeben wurde.

Die Inkubation der Ansätze erfolgte in einem programmierbaren Thermocycler der Fa. Biometra (Trioblock).

Standard-PCR-Programm : 94°C 1 min.

50-88 °C 1 min. (Primer spezifisch) min.72°C2 Wiederholung für 25-30 Zyklen 72 °C 5 min.

Die Analyse der PCR-Produkte erfolgte in 1,5 %-igen Agarosegelen. Die DNA- Fragmente wurden mit Ethidiumbromid angefärbt und unter langwelligem UV- Licht für die Dokumentation sichtbar gemacht.

Methoden Chemikalien, Radioisotope und Enzyme Wenn nicht anders gekennzeichnet, wurden die verwendeten Chemikalien in p. A. Qualität von den Firmen Flow Laboratories, Gibco BRL, Merck, Roth, Serva oder Sigma bezogen. Die verwendeten Radiochemikalien wurden über Amersham ([35S]-Methionin, labeling grade) bezogen. Restriktionsendonukleasen und andere

Enzyme wurden, wenn nicht anders vermerkt, von Boehringer (Mannheim), Gibco BRL, New England BioLabs oder Pharmacia bezogen.

Nicht-radioaktive in situ-Hybridisierung Mit Hilfe der in situ-Hybridisierung ist es möglich, Analysen von Nukleinsäuren auf Einzelzellebene durchzuführen. Zum Nachweis spezifischer mRNAs in Zellen wurden Digoxygenin-markierte RNA-Sonden eingesetzt. Die Hybridisierung wurde durch Umsetzung eines Farbstoffgemisches (NBT/BCIP) mit Hilfe einer alkalischen Phosphatase (AP) nachgewiesen, die mit einem Anti-Dig Fab- Fragment konjungiert war.

Die in situ-Hybridisierung umfaßt mehrere Teilschritte, die im folgenden erläutert werden.

In vitro-Transkription Digoxygenin-markierte RNA-Sonden wurden mittels des Dig RNA labeling Kit (SP6/T7) von Boehringer Mannheim hergestellt.

Um eine möglichst Hurpin-spezifische Sonde herzustellen, wurde ein in anderen Serpinen nicht konservierter Teil aus dem 3'-nicht translatierten Bereich der Hurpin-Sequenz ausgewählt. Mit Hilfe der PCR wurde die entsprechende cDNA unter Verwendung des Plasmid pBS-HPl. l generiert. Um mit Hilfe der T7-RNA- Polymerase unter Verwendung dieser amplifizierten cDNA eine RNA-Sonde herstellen zu können, wurde am 5'der entsprechenden Hurpin-spezifischen Primer eine T7-Promotorsequenz angehängt. Die T7-RNA-Polymerase bindet an diese T7-Promotorsequenz und katalysiert die Transkription der mRNA-Sonde. Die Sonde wird dabei durch den Einbau von digoxygeniertem dUTP (Dig-dUTP) markiert.

Hurpin-spezifische Primer :

HPLF1 (5'-Primer) : TGCATCGCCACAATCCAGTTTTAG HPLF2 (3'-Primer) : CCAGCAATTTCTAGCCTAGGGAATCT Hurpin-spezifische Primer mit T7-Promotorsequenz : HPFL1-T7 (5'-Primer) : ACTCGAGTAATACGACTCACTATAGGGTGCATCGCCACAATCCAGTTT TAG HPLF2-T7 (3'-Primer) : ACTCGAGTAATACGACTCACTATAGGGCCAGCAATTTCTAGCCTAGGG AATCT Für die PCR-Amplifizierung der cDNA-Matrize zur Generierung der"anti- sense"-Sonde wurde die Primerkombination HPLF1/HPLF2-T7, zur Generierung der"sense"-Sonde wurde die Primerkombination HPLF1-T7/HPLF2 eingesetzt.

Die generierten PCR-Produkte hatten eine Größe von 462 bp.

Die PCR wurde, wie unter RT-PCR beschrieben, durchgeführt. Anstelle der cDNA wurde als Template 0,2 ng des Hurpin-Plasmides pBS-HP 12.2 eingesetzt.

PCR-Bedingungen : 1. Zyklus 1 min. Denaturierung bei 95 °C 1 min. Primer-Bindung bei 58 °C 1 min. Polymerisation bei 72 °C 2.-35. Zyklus 55 sec. Denaturierung bei 95 °C

50 sec. Primer-Bindung bei 58 °C 1 min. Polymerisation bei 72 °C Abschließend 5 min. Inkubation bei 72 °C Vor dem Einsatz in der in vitro-Transkription wurden PCR-Produkte (cDNA- Matrize) über ein Agarosegel aufgereinigt.

Herstellung der RNA-Sonden Für die in vitro-Transkription wurden 1 ig cDNA-Matrize zusammen mit 2 p1 NTP Labeling-Mixtur, 2 ul 10 x Transkriptionspuffer und 1 p1 RNase-Inhibitor in ein RNase-freies Gefäß gegeben und mit DEPC behandeltem Wasser auf 18 p1 aufgefüllt. Nach Zugabe der T7-RNA-Polymerase wurde der Ansatz 2 h bei 37 °C inkubiert. Nach der Synthese wurde die DNA-Matrize durch DNase abgebaut. Die Reaktion wurde durch 2 p1 einer 0,2 M EDTA-Lösung gestoppt.

Reinigung der RNA-Sonde Es ist stets notwendig, die nicht eingebauten Nukleotide aus der Lösung der synthetisierten RNA-Sonden zu entfernen, da diese zu unspezifischen Signalen führen. Hierzu wurden 24 ul des Probenansatzes mit 2,5 ßl 4 M L1C1 und 75, ul eiskaltem EtOH (100 % (v/v)) gemischt und die RNA durch Inkubation bei-70°C für 30'präzipitiert. Durch Zentrifugation bei 4 °C und 12000 g wurde die RNA pelletiert, während die Nukleotide im Überstand verblieben. Nach Waschen des Pellets in 50 p1 75 % (v/v) EtOH nachfolgender Zentrifugation (12000g) und anschließendem Trocknen, wurde die RNA in 20 u1 DEPC-behandeltem Wasser resolubilisiert. Die Lagerung der mRNA-Sonde erfolgte bei-70 °C

Quantifizierung der RNA-Sonde Durch Vergleich einer RNA-Verdünnungsreihe bekannter Konzentration mit einer Verdünnungsreihe der synthetisierten Sonde wurde die Konzentration der Sonde bestimmt. Dazu wurde durch Verdünnung einer mitgelieferten Kontroll-RNA eine Eichreihe hergestellt. Je 1 ptl der verdünnten Lösungen wurden auf eine Nylonmembran gedottet. Die synthetisierte Sonde wurde in gleicher Weise verdünnt und ebenfalls auf die Membran gedottet. Durch Backen der Membran wurden die Nukleinsäuren immobilisiert. Danach wurde die Membran kurz in Waschpuffer (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, 0,3 % (v/v) Tween 20, pH 7,5) gewaschen und anschließend 30 min. bei RT in 1 % Blocking-Lösung (Boehringer-Mannheim) in Maleinsäure-Puffer (100 mM Maleinsäure, 150 mM NaCl, pH 7,5) inkubiert. Nach Blockierung freier Bindungsstellen der Membran wurde diese 30 min. in der anti-Dig-Fab-AP-Konjugat-Lösung inkubiert. Das anti-Dig-Fab-AP-Konjugat (Boehringer-Mannheim) wurde in 1 % Blocking- Lösung 5000-fach verdünnt.

Das anti-Dig-Fab-AP-Konjugat bindet spezifisch an die digoxygenierten Nukleotide. Die Membran wurde anschließend zweimal 15 min. mit Waschpuffer gewaschen und dann 2 min. in alkalischen Detektionspuffer (100 mM Tris-Hcl, 100 mM NaCl, pH 9,5) gegeben, wodurch das Enzym aktiviert wurde. Die Membran wurde daraufhin in ein Farbstoffsubstrat-Gemisch überführt. Dieses Gemisch bestand aus 45 pL1 NBT-und 35 ul BCIP-Lösung, die in 10 ml Detektionspuffer aufgenommen worden waren. Die Farbreaktion fand im Dunkeln für 30 min. bis max. 16 h statt und wurde durch Spülen der Membran in TE- Puffer gestoppt. Durch Vergleich der Farbintensität der einzelnen Punkte wurde die Konzentration der Sonden bestimmt.

Die Sonden wurden mit DEPC-Wasser auf eine Konzentration von 10 ng/, ul verdünnt und als 10 p1 Aliquots bei-70°C aufbewahrt Reinheitskontrolle der Sonde

Zur Kontrolle des Transkripts wurden nach der Quantifizierung je Ansatz 75 ng der RNA-Sonde auf einem denaturierenden 2 %-igem Agarosegel aufgetrennt.

Die aufgetrennten Transkripte wurden anschließend auf eine Nylonmembran transferiert. Nach Backen der Membran wurde wie bei der Quantifizierung der synthetisierten Sonde verfahren. Der Umsatz des Substratgemisches zeigt an, ob die Sonde richtig quantifiziert und ob das richtige Transkript synthetisiert wurde.

11.2 In situHybridisierung Gefrierschritte von Hautbiopsien Hautbiopsien wurden nach der Entnahme in Einbettmedium (Eukitt) eingebettet und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Mit Hilfe eines Gefriermikrotoms wurden 7, m dicke Gewebeschnitte angefertigt und auf Polylysin-beschichtete Objektträger übertragen.

Fixierung der Gefrierschnitte Die Objektträger wurden auf RT erwärmt und die Gewebeschnitte mit einem Fön (Kaltluftstufe) getrocknet. Fixierung erfolgte durch 4 % (w/v) Paraformaldehyd (PFA) für 4 h bei 4 °C.

Hybridisierung Die Objektträger wurden in einer Riesenküvette für 5 min. in DEPC-lx PBS mit 0,02 % (v/v) Triton X-100 bei RT geschüttelt. Durch das Detergenz wurden die Zellmembranen permeabilisiert. Das Waschen mit DEPC-lx PBS für 10 min. entfernte das Detergenz. Die Vorhybridisierung erfolgte mit Dig-Easy Hyb (Boehringer) bei 46 °C in einem Hybridisierungsofen für mind. 1h. Anschließend <BR> <BR> <BR> <BR> wurde Prähybridisierungslösung gegen 100 jii Hybridisierungslösung mit der denaturierten RNA-Sonde (300 pg/gl) ausgetauscht.

Die Hybridisierung erfolgte über Nach bei 46 °C.

Waschschritte Nach erfolgter Hybridisierungsreaktion folgten mehrere Waschschritte, in denen ungebundene und unspezifisch gebundene Sonden entfernt wurden. Alle Waschschritte fanden unter sanftem Schütteln in einer Riesenküvette statt.

-lx PBS mit 0,02 % (v/v) Triton X-100 RT 5 min.

-2x SSC RT 10 min.

-1x SSC mit 0,1 % (w/v) SDS 50 °C 2x10 min.

-0,5x SSC mit 0,1 % (w/v) SDS RT 10 min.

-0,2x SSC RT 10 min.

-0,1x SSC RT 10 min.

-lx PBS RT 5 min.

-Puffer 1 RT 5 min.

(lOOmM Tris-HCl, 159 mM NaCl, pH 7,5) Detektion der Hybride Um unspezifische Bindungen des anti-Dig-Fab-AG-Konjugats zu verhindern, wurden die Schnitte mit 100 pl Abdeckpuffer (Puffer 1,0,2 % (w/v) BSA, 0,3 % (v/v) Triton X-100) bei RT 30 min. inkubiert. Die folgende Inkubation mit 100 gel Anti-Dig-Fab-AG-Konjugatlösung fand 2 h bei RT statt. Der Anti-Dig- Antikörper, der mit einer alkalischen Phosphatase konjungiert ist, (Boehringer Mannheim) wurde in Dilutionspuffer (Puffer 1,0,01 % (w/v) BSA, 0,02 % (v/v) Triton X-100) 1000fach verdünnt. Durch zweimaliges Waschen in Puffer 1 für je 10 min. wurde ungebundenes Anti-Dig-Fab-AG-Konjugat entfernt. Mit Puffer 3 (100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 50 mM MgCl2, pH 9,5), der für 5 min. bei RT einwirkte, wurde ein alkalisches Milieu erzeugt, in dem die alkalische Phosphatase aktiviert wird. Die Farbreaktion wurde durch Gabe von 100 ul Farbstofflösung j e Kammer initiiert. Die Farbstofflösung bestand aus 22,5 Rl NBT und 17,5 p1 CIP in 5 ml Puffer 3. Die Reaktion wurde im Dunkeln durchgeführt, mikroskopisch kontrolliert und dauerte zwischen 30 min. und 16 h. Nach

entsprechender Färbung wurde die Reaktion durch TE-Puffer gestoppt. Die Präparate wurden eingebettet und die in situHybridisierung fotografisch dokumentiert.

Subklonierung der Hurpin kodierenden Sequenz Mit Hilfe der PCR unter Verwendung spezifischer Primer, die benachbart zur codierenden Sequenz für Hurpin liegen, wurde ein 1192 bp langes Fragment aus dem Klon 1.1 generiert.

Um die Fehlerrate in den generierten PCR-Produkten möglichst gering zu halten, wurde für die Amplifizierung das Expand High Fidelity PCR System von Boehringer Mannheim eingesetzt.

Jeweils 0,4 ng Plasmid wurden mit 2,6 U Enzym, in einem nach Herstellerangaben zusammengesetzten 100 ! PCR-Ansatz mit 2,0 mM MgCl2 und je 30 pmol Primer HPPE1 und HPPE2 amplifiziert.

Verwendete Primer : HPPE1 (5') CAGAATTCATGGATTCACTTGGCGCCGTCAGC HPPE2 (3') ACGAATTCTTAAGGAGAAGAAAATCTGCCG AAGAAGAG GATGCT Die Hurpin-spezifische Sequenz der Primer wurde am 5'-Ende durch eine Restriktionsschnittstelle für EcoRl sowie um 2 irrelevante Nukleotide ("clamp") verlängert.

PCR-Bedingungen : 1. Zyklus 5 min. Denaturierung bei 95 °C 1 min. Primer-Bindung bei 68 °C 2 min. Polymerisation bei 72 °C

2.-30. Zyklus 55 sec. Denaturierung bei 95 °C 1 min. Primer-Bindung bei 68 °C 2 min. Polymerisation bei 72 °C mit Zeit-Inkrement von 2 sec/Zyklus Abschließend 5 min. Inkubation bei 72 °C.

Das amplifizierte Fragment wurde über ein Agarosegel gereinigt und über TA- Klonierung in einen geeigneten pGEM-Vektor (Promega) kloniert.

Durch Sequenzanalyse wurde die Fehlerfreiheit der Hurpin-Sequenz und die Orientierung des cDNA-Fragmentes bezüglich des T7-Promotors des Vektors überprüft.

Ein rekombinanter pGEM-Vektor, der das 5'-Ende der Hurpin-codierenden Sequenz benachbart zum T7-Promotor des Vektors enthielt, wurde für die gekoppelte in vitro Transkription/Translation ausgewählt.

Gekoppelte in vitro Transkription/Translation <BR> <BR> <BR> Für die gekoppelte in vitro Transkription/Translation wurde ein Retikulozyten- Lysat-System und eine T7 RNA Polymerase der Firma Promega eingesetzt. Nach Herstellerangaben wurden in einem 50 il Ansatz 1-2 Rg Plasmid-DANN als Matrize eingesetzt. Die Markierung des in vitrotranslatierten Proteins erfolgte durch den Einbau von [35S]-Methionin. Zur Expression des Hurpin codierenden cDNA-Inserts wurde der Ansatz für 90 min. bei 30 °C inkubiert.

Die Lagerung des so hergestellten [35S]-Hurpins erfolgte bei-80°C.

Hurpin-Proteinase Interaktionen Gereinigte humane neutrophilen Elastase (HNE), Cathepsine (cat) B, D, G, L.

Chymotrypsin (CT), Trypsin, Plasmin, Proteinase 3 (PR3) wurden über Athens Research & Technology, Inc. (Athens, GA) bezogen. Humanes Thrombin wurde

von Sigma bezogen. PBS Reaktionspuffer (0,01 M phosphate buffer, 27 mM KC1, 137 mM NaCl, pH 7,4) wurde für catG, Plasmin, Thrombin und HNE verwendet.

Cathepsin-Reaktionspuffer (50 mM sodium acetate, pH 5,5,4 mM Dithiothreitol, 1 mM EDTA) wurde für catL, catB und catD eingesetzt. CT und Trypsin wurden in 0,2 M Tris-HCl, pH 7,8,20 mM CaCl2 und PR3 in 200 mM NaCl, 50 mM Tris- HCI, pH 6,7 eingesetzt.

100 pu der in vitro Translationsreaktion wurden mit Tris-HCl (50 mM, pH 7,4) auf ein Volumen von 500 p1 gebracht. Das in vitrotranslatierte [35S]-Hurpin wurde anschließend durch aufeinanderfolgende Ultrafiltration über Microcon 100 und Microcon 30 Einheiten von Amicon (Millipore, Eschborn, Germany) größenfraktioniert. Das [35S]-Hurpin enthaltende Retentat wurde mit Tris-HCl (50 <BR> <BR> <BR> <BR> mM, pH 7,4) auf ein Volumen von 148 jil aufgefüllt. Die Quantifizierung des in vitrotranlatieren [35S]-Hurpin über die Menge des eingebauten [35S]-Methionins ergab eine Hurpinkonzentration von 47,75 nglw. 191 ng dieses [35S]-Hurpin (Endkonzentration 0,542 p. M) wurden in dem geeigneten (s. o.) Puffer mit verschiedenen Proteasen (Endkonzentration 0,025 RM und 0,5 jjM) für 15 min. bei 25 °C und 15 min. bei 37 °C in einem Gesamtvolumen von 8 pl inkubiert.

SDS-PAGE Analyse Proteine wurden mit 2x Ladepuffer (125 mM Tris-HCl, pH 6,8,20 % Glycerol, 4 % SDS, 5 % ß-Mercaptoethanol, 0,01 % Bromphenol-Blau) versetzt und auf 100 °C für 4 min. erhitzt. Die Größenfraktionierung wurde in einem 10 % ProSieve 50 Gel (FMC, USA, ME) entsprechend den Herstellerangaben unter Verwendung eines Tris/Tricine Elektroden Puffersystems durchgeführt. Das [35S]-Hurpin wurde durch Autoradiographie mit Hyperfilm (Amersham, Braunschweig, Germany) nachgewiesen.

Die Erfindung wird durch nachfolgende Beispiele und Abbildungen im Detail erläutert :

Beispiele Beispiel 1 1. Differential Display (DD-PCR) Analysen HaCaT-Zellen wurden mit einer subletalen UVB-Dosis (100 J/m2) bestrahlt und 0.5, lh, 2h, 4h, 6h, 8h und 24 h später geerntet. Für die DD-PCR Analysen wurde die RNA aus Zellen 8 h und 24 h nach UVB-Bestrahlung und aus unbestrahlten Zellen zu Beginn des Experiments sowie nach 24 h in Kultur verwendet. Die parallele Analyse dieser 4 Zellpopulationen macht es möglich, Banden auszuschließen, die zufällig zwischen den verschiedenen Spuren des Displays variieren und reduziert somit die Wahrscheinlichkeit falsch positiver Banden für die folgenden Analysen auszuwählen. Weiterhin kann durch diese parallele Analyse das Potential der DD-PCR zur Erfassung von quantitativen Unterschieden als zusätzliches Kriterium bei der Identifizierung von UVB- abhängig regulierten Sequenzen eingesetzt werden.

In Abb. 1 ist ein Teil einer solchen"differential display" (DD Analyse dargestellt.

Unabhängige DD-PCR-Analysen zeigten, daß mit dem erarbeiteten Protokoll für eine bestimmte Primer-Kombination ein bestimmtes Bandenmuster reproduzierbar hergestellt werden konnte. Das komplexe Bandenmuster zeigt, daß die UVB-Bestrahlung sowohl zu einer Induktion als auch einer Repression verschiedener Gene innerhalb von 24 h nach Bestrahlung fiihrt.

Für hurpin konnte bei dieser Analyse eine differentiell nach UVB-Bestrahlung regulierte cDNA-Bande von 412 bp dargestellt werden. Da die UVB-Bestrahlung einen reprimierenden Effekt auf die Transkriptmenge des korrespondierenden Gens hatte, wurde als Bezeichnung für diese cDNA HUR 7, für HaCaT UV reprssed, gewählt.

Beispiel 2 2. Isolation von hurpin cDNA-Klonen voller Länge Mit Hilfe der HUR 7 cDNA wurden im folgenden hurpin cDNA-Klone voller Länge aus einer HaCaT cDNA-Bank isoliert. Nach Hybridisieren der radioaktiv markierten HUR 7 cDNA gegen 105 k-cDNA-Klone zeigten 67 Klone ein positives Signal. Von diesen wurden 20 für eine zweite Hybridisierung ausgewählt. Von den 15 positiven Klonen aus diesem zweiten Screening wurden 12 für die in vivo Excision des Insert tragenden pBlueScript SK Phagemid aus dem Phagengenom ausgewählt. Eine Restriktionsanalyse der erhaltenen Phagemide zeigte, daß 3 Klone nicht mit HUR 7 und den übrigen Phagemiden korrespondierten. Die 9 verbleibenden Klone konnten aufgrund ihrer Größe und ihres Restriktionsmusters in 3 Gruppen eingeteilt werden.

Beispiel 3 3. Sequenzanalyse der hurpin cDNA-Klone Jeweils ein repräsentativer Klon der 3 Phagemidgruppen wurde vollständig sequenziert. Eine Zusammenfassung der Eigenschaften dieser Klone ist in Abb. 2 dargestellt. Der Klon 1.1 mit einem 3130 bp großem cDNA-Insert repräsentiert das 3.4 kb Transkript, während Klon 12.2 mit einem 2637 bp großem cDNA- Insert das kleinere 3.0 kb Transkript repräsentiert. Der Klone 16.1 korrespondiert ebenfalls mit dem 3.0 kb Transkript, enthält aber eine 188 bp große Insertion, die in den übrigen Klonen fehlt. Da diese Insertion den offenen Leserahmen unterbricht, handelt es sich nicht um eine alternativ gespleißte RNA-Variante.

Obwohl keine perfekte Splice-Konsensus-Sequenz gefunden werden konnte, repräsentiert die Insertion damit vermutlich ein ungespleißtes Intron.

Die vergleichende Analyse der Sequenz der verschiedenen Klone zeigte, daß die in Northern-Blot beobachteten distinkten zwei Transkripte auf die Verwendung von unterschiedlichen Polyadenylierungssignalen zurückzuführen ist.

Das 3.0 kb große Transkript wird durch die Verwendung eines Konsenssuspolyadenylierungssignals AAUAAA 13 nt oberhalb des poly (A)-

Schwanzes generiert. In der 3'untranslatierten Region (3'UTR) des 3.4 kb Transkriptes finden sich zwei funktionelle Varianten des Konsensussignals mit der Sequenz AAUAAU und AAUAUA, die sich 56 nt bzw. 22 nt oberhalb des poly (A)-Schwanzes befinden.

Alle cDNA-Klone enthalten einen einzelnen offenen Leserahmen (ORF) mit einer Länge von 1178 bp beginnend von Position 103 der Sequenz des Klons 1.1 mit einem ATG in einer Kozak Konsensussequenz. Klon 1.1 enthält mit 102 bp den längsten 5'untranslatierten Bereich (5'UTR).

Das putative Protein besteht aus 391 Aminosäuren und hat eine berechnete molekulare Masse von etwa 44 kDa und einen pl von 5.47.

Datenbanksuche gegen die EMBL-Sequenz-Datenbank zeigte, daß das durch die cDNA-Klone kodierte Protein neu ist, aber deutliche Homologien zu Mitgliedern des Ovalbumin-Zweiges der Serpin-Superfamilie von Proteaseinhibitoren hat (Tabelle 1). Die größte Übereinstimmung in der Aminosäuresequenz fand sich zwischen hurpin und den"squamous cell carcinoma antigen" (SCCA) 1 (59,1 %), SCCA 2 (58,5 %) und bomapin/PI10 (43,5 %). Eine Analyse der Aminosäuresequenz ergab, daß hurpin ein typisches Serpin darstellt, bei dem 46 der für Serpine als characteristisch beschriebenen 51 Aminosäuren (5) konserviert sind (Abb. 3).

Zusätzlich zu den Übereinstimmungen auf Aminosäureebene besitzt hurpin alle strukturellen Merkmale, die die Ovalbumin-Serpine von den übrigen Mitgliedern der Serpin-Superfamilie trennen : # hurpin besitzt keine N-terminale Verlängerung und der ORF beginnt mit der Aminosäure 23 von a-1-Antitrypsin (a-l-PD hurpin besitzt keine c-terminale Verlängerung und endet mit Pro391 korrespondierend zu Pro391 in a-l-PI. die vorletzte Aminosäure ist Ser und nicht Asp, wie bei den übrigen Mitgliedern der Superfamilie

* hurpin besitzt eine variable Aminosäure anstelle von Valin in Position 388 bezüglich a-l-PI # hurpin besitzt kein typisches N-terminales hydrophobes Signalpeptid.

Durch Vergleich mit anderen Ovalbumin-Serpinen konnten die Spezifität bestimmenden Positionen P1-P1. des potentiellen reaktiven Zentrums als Thr356- Ser 357 identifiziert werden. Die große Identität der"hinge"-Region von hurpin mit der postulierten Konsensussequenz der inhibitorischen Serpine (18,19), läßt eine Protease inhibierende Aktivität für hurpin vermuten (Abb. 3).

Beispiel 4 4. Northern-Blot Analysen Bei Verwendung der cDNA-Inserts der volle Lange cDNA-Klone für HUR 7 als radioaktive Sonde im Northern-Blot mit HaCaT-Zellen Gesamt-RNA konnte das gleiche Hybridisierungsmuster wie mit dem ursprünglichen"differential display" Klon (HUR 7) generiert werden. Die detektierten zwei Transkripte von ca. 3.0 und 3.4 kb zeigten die gleiche Abnahme der steady-state mRNA-Menge nach UVB- Bestrahlung mit 100 J/m2 wie nach Hybridisierung mit dem ursprünglichen HUR 7 Fragment. Ebenso wie mit dem ursprünglichen HUR 7 cDNA-Klon konnte auch mit den cDNA-Klonen voller Lange in anderen humanen Geweben (MTN- Northern-Blots : Herz, Hirn, Plazenta, Lunge, Leber, Sklettmuskel, Pankreas) kein Signal detektiert werden.

Beispiel 5 5. RT-PCR Analyse Bei RT-PCR Analysen mit spezifischen Primern für hurpin konnte eine Expression nicht nur in HaCaT-Zellen, sondern auch in kultivierten primären Keratinozyten und in Biopsiematerial aus gesunder Haut nachgewiesen werden.

Kultivierte menschliche retinale Pigmentepithelzellen sowie Iris-Epithelzellen zeigten dagegen keine hurpin Expression. Die geringere Expression von hurpin in

normaler Haut im Vergleich mit der Expression in HaCaT-Zellen oder kultivierten primären Kerationzyten ließ eine Assoziation von hurpin mit dem Proliferationszustand von Keratinozyten vermuten. Ein charakteristisches Merkmal der psoriatischen Haut ist die Hyperproliferation der Keratinozyten. Um die Assoziation von hurpin mit der Proliferation von Keratinozyten zu überprüfen, wurde die Expression von hurpin in befallener und unbefallener Haut von 2 psoriatischen Patienten mittels RT-PCR untersucht. Die befallene haut zeigte dabei eine bis zu 10-14 fach stärkere Expression von hurpin im Vergleich mit der unbefallenen Haut desselben Patienten.

Zur Untersuchung der möglichen Interaktion des neuen Inhibitors mit bekannten Proteasen, wurde das Hurpin-Protein durch eine gekoppelte in vitro Transkription/Translation hergestellt. Das mit [35S]-markierte Protein wurde dann mit verschiedenen Serin-und Cystein-Proteasen und einer Aspartase inkubiert.

Beispiel 6 1. In situHybridisierung Die in situHybridisierung von Gefrierschnitten psoriatischer und normaler Haut bestätigte die bereits in den RT-PCR Analysen gemachten Beobachtung einer deutlichen Überexpression von Hurpin in psoriatischer Haut im Vergleich zur Expression in normaler Haut (Abb. 10).

Über diese Bestätigung der Psoriasis-assoziierten Expression hinaus, konnte durch die in situHybridisierung zudem die Verteilung der Hurpin exprimierenden Zellen in der mehrschichtigen Epidermis demonstriert werden. Mit Ausnahme weniger Zellschichten direkt unterhalb der Hornschicht, zeigen alle Schichten der psoriatischen Epidermis Keratinozyten mit einer starken Hurpin-Expression. In der normalen Haut ist die Expression von Hurpin nicht nur generell schwächer, sondern beschränkt sich nahezu ausschließlich auf die basalen und subprabasalen Keratinozyten.

Da sich die psoriatische Epidermis durch eine erhöhte mitotische Aktivität auszeichnet, während in der normalen Haut die Proliferation auf die basalen Zellschichten beschränkt ist, unterstützt die gefundene Verteilung der Hurpin- Expression die Vermutung einer Prliferations-assoziierten Funktion von Hurpin.

Die normale Differenzierung der Keratinozyten von der Basalschicht bis zum Stratum Corneum wird auch als spezielle Form der Apoptose diskutiert. Das klinische Bild der Psoriasis kann demnach neben einer gesteigerten Proliferation der Keratinozyten auch durch eine Blockierung der Differenzierungs-assoziierten Apoptose erklärt werden. Die Verteilung der Hurpin-Expression ist daher ebenfalls mit einer anti-apoptotischen Funktion dieses neuen Inhibitors in Einklang zu bringen.

Beispiel 7 Analyse der Interaktion des in vitrotranslatierten Hurpin-Proteins Die Aminosäuresequenz des reaktiven Zentrums von Hurpin läßt eine inhibitorische Kapazität dieses neuen Inhibitors vermuten. Die Aminosäuren in der die Spezifität maßgeblich bestimmenden Pl-PITosition Thr-Ser finden sich jedoch in keinem anderen bekannten inhibitorischen Serpin. Damit läßt sich für Hurpin keine potentielle Zielprotease von der Spezifität bekannter Inhibitoren ableiten.

Charakteristisch für die Inhibition von Proteasen durch Serpine ist die Formierung eines SDS-stabilen Komplexes aus der Protease und dem im reaktiven Zentrum geschnittenen Serpin. Neben diesem Inhibitionsmechanismus kann die Interaktion eines Serpins mit einer Zielprotease auch über einen reinen Substratmechanismus ablaufen. Hierbei bildet sich ebenfalls ein Komplex aus Protease und Serpin. Eine Inhibition findet jedoch nicht statt, da dieser Komplex sehr schnell in die freie Protease und das im reaktiven Zentrum geschnittene und damit inaktive Serpin zerfällt.

Um die Reaktion von Hurpin mit bekannten Proteasen zu untersuchen, wurde das in vitrotranslatierte und damit [35S]-markierte Hurpin mit verschiedenen Serin-

(Trypsin, CT, HNE, Plasmin, PR3, catG, Thrombin) und Cystein-Proteasen (catB, catL) sowie einer Aspartase (catD) jeweils in einem Inhibitor/Proteaseverhältnis von 21.6 : 1,4.32 : 1,1.08 : 1 inkubiert. Die Analyse erfolgte dann durch eine SDS- Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) mit anschließender Autoradiographie zur Detektion des radioaktiv markierten Inhibitors.

Die Auswertung der Autoradiographie zeigte für das Haupttranslationsprodukt die erwartete Größe von ca. 44 kDa. Nach Inkubation mit den verschiedenen Proteasen konnte in keinem Fall ein Serpin-typischer Komplex aus Protease und diesem 44 kDa Hurpin-Protein nachgewiesen werden (Abb. 11).

Während Hurpin unter den verwendeten Reaktionsbedingungen keine Interaktion mit catD, catG und Thrombin (mit und ohne Heparin) zeigte, wurde der Inhibitor unterschiedlich stark durch die übrigen Proteasen abgebaut. Inkubation mit PR3 führte zu einer sehr schnellen und vollständigen Degradation des Hurpin-Proteins zu nicht mehr darstellbaren niedermolekularen Fragmenten (Abb. 11, Spuren 12- 14). Plasmin und Trypsin zeigten eine konzentrationsabhängige Degradation mit einem hochmolekularen Zwsichenprodukt (Abb. 11, Spuren 3-5 und 18-20).

Inkubation mit CT, HNE, catB und catL führten zu einem freien, gespaltenen Inhibitor (Abb. 11, Spuren 7,10,27,30). Während steigende Konzentrationen von CT und HNE zu einer weiteren Degradation dieses Polypeptidfragmentes führten (Abb. 11, Spuren 6-11), zeigte es sich resistent gegen weitere Proteolyse durch catB und catL (Abb. 11, Spuren 26-31).

Die limitierte Degradation von Hurpin durch die Cysteinproteasen catB und catL ist vergleichbar mit der Modifikation des viral codierten Serpins"cytokine response modifiers A" (crmA) bei der klassenübergreifenden Inhibition von apoptotisch relevanten Caspasen. Diese Analogie läßt für Hurpin eine mögliche Inhibition von Cystein-Proteasen vermuten.

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Die Figuren zeigen : Abb. 1 zeigt das Autoradiogramm der Differential Display Analyse zur Identifizierung des ersten partiellen hurpin cDNA Klons (HUR 7) als UV-reprimierte Sequenz. Die entsprechende Bande ist durch einen Pfeil gekennzeichnet.

Abb. 2 zeigt die schematische Darstellung der Organisation der hurpin cDNA-Klone voller Länge entsprechend der zugrundeliegenden Sequenzanalyse.

Abb. 3 stellt die Ergebnisse des Homologievergleiches der Aminosäuresequenz von hurpiin mit verschiedenen bekannten Mitglieder des Ovalbumin-Zweiges der Familie der Serpine zusammen.

Abb. 4 zeigt den Homologievergleich der Aminosäuresequenz von hurpin und dem"squamous cell carcinoma antigen" (SCCA) 1 und SCCA 2.

Identische Aminosäuren an gleicher Position sind entsprechend hervorgehoben. Die Position der in Serpinen konservierten Aminosäuren sind durch Balken oberhalb der Aminosäuren markiert.

Schwarze Balken zeigen dabei in hurpin konservierte Aminosäuren an, während ungefüllte Balken eine Abweichung von der konservierten Aminosäure markieren. Schraffierte Balken zeigen Aminosäuren, die typischerweise bei Ovalbumin-Serpinen von der konservierten Aminosäure abweichen. Die bei inhibitorischen Serpinen konservierten Aminosäuren des reaktiven Zentrums in Position P17-P8 sind umrahmt und die Kosensussequenz für inhibitorische Serpine ist durch eine gestrichelte Linie unterhalb der hurpin-Sequenz markiert. Die Aminosäuren des reaktiven Zentrums in P-P-Position sind ebenfalls markiert.

Abb. 5 zeigt das Autoradiogramm einer Hybridisierung des radioaktiv markierten cDNA-Inserts des hurpin Klones 1.1 gegen Gesamt-RNA aus bestrahlten und unbestrahlten HaCaT-Zellen.

Abb. 6 RT-PCR Analyse zum Nachweis hurpin spezifischer Transkripte in humanen, kultivierten retinalen Pigmentepithelzellen (RPE), Iris- Epithelzellen (IPE), normaler Haut, primären, kultivierten Keratinozyten (NHK), der epidermalen Zellinie HaCaT, sowie befallener (a) und unbefallener (u) Haut von drei Patienten mit Psoriasis.

Abb. 7-9 Restriktionskarten der Plasmidvektoren. Bei den Plasmidvektoren handelt es sich um pBlueScript SK in die über Eco RI und Xho I die hurpin/PIl 3 cDNAs voller Länge kloniert sind.

Abb. 10 zeigt mikroskopische Aufnahmen der Gefrierschnitte von psoriatischer und normaler Haut nach in situHybridisierung mit einer Hurpin- spezifischen, Digoxiginin-markierten anti-sense RNA-Sonde. <BR> <P>Abb. 11 zeigt die Untersuchung der Interaktion des in vitro translierten, [35S]- markierten Hurpin-Proteins mit verschiedenen Proteasen.