способ диагностики онкологического заболевания

область применения

изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики онкологических заболеваний, в частности, для диагностики ранней стадии онкологических заболеваний, например, при проведении плановой диспансеризации.

предшествующий уровень техники

известен способ диагностики онкологического заболевания [1], включающий забор пробы крови у пациента и ее спектральный анализ с последующей идентификацией заболевания путем сравнения спектров крови пациента и здорового человека, отличающийся тем, что спектральный анализ крови осуществляют в условиях многократного нарушенного полного внутреннего отражения в инфракрасной области спектра, а заболевание идентифицируют по появлению в спектре полос поглощения в диапазоне частот 1500 - 3000 см ^"1 , при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1625 см ^"1 идентифицируют рак крови, при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1735 см ^"1 идентифицируют рак молочной железы, при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 1580 см ^"1 идентифицируют рак печени, при появлении в спектре полосы поглощения на частоте 2864 см ^"1 идентифицируют лимфогрануломатоз. недостаток способа заключается в его трудоемкости и сложности.

известен также способ отбора лиц для выявления злокачественных новообразований [2], который используется в медицине, а именно при плановом диспансерном профилактичеком обследовании людей с целью оперативного обнаружения онкологических больных на ранних стадиях развития опухолей. способ включает взятие у обследуемых проб биологического материала, выделение из него культур эшерихиа и стрептококка с последующей инкубацией в присутствии клеток опухоли L929, приготовление мазка и его окрашивание, а также микроскопическое исследование с расчетом диагностического индекса индекса целых клеток /ицк/. при ицк 50 - 60% больных отбирают в группу риска, а при ицк равном 49% и ниже в группу больных

заменяющий лист (правило 26)

злокачественными новообразованиями. недостаток способа также заключается в его трудоемкости и сложности, что отражается на точности показателей.

известен способ дифференциальной диагностики облигатных форм предрака и злокачественных новообразований [3], который основан на определении в плазме человека наличия частиц с гидродинамическим радиусами 5-30 нм в соотношении 35-55% у обследуемого диагностируют облигатную форму предрака. при определении 55% и выше этих частиц диагностируют злокачественные новообразования. при определении других соотношений этих же частиц делают вывод об отсутствии данных заболеваний. способ позволяет выявить и оценить изменения в системе гомеостаза.

недостатками способа [3] является низкая информативность, которая связана с тем, что биологические макромолекулы сыворотки крови: липопротеины, липиды, белки в сыворотке крови нестабильны и сами по себе могут образовывать комплексы во время получения и приготовления образца, использование физиологического раствора без стабилизации его кислотности при проведении измерений. особенности забора образца, время, затраченное на получение сыворотки или плазмы крови, температура в помещении во время проведения исследования - все это оказывает влияние на формирование и диссоциацию образцов и приводит к тому, что указанный способ дает много ложноположительных результатов. а отсутствие стабилизации кислотности физиологического раствора только усиливает нестабильность исследуемого образца.

однако, способ [3] можно принять за наиболее близкий аналог к заявляемому изобретению.

техническим результатом, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, является обеспечение достоверной диагностики онкологического заболевания, в том числе на ранней стадии заболевания путем получения сравнительной количественной характеристики интенсивности излучения при проведении лазерной корреляционной спектроскопии нативной плазмы или сыворотки крови в условиях контроля концентрации солей и кислотности раствора и снятия спектров интенсивности светорассеивания при трех измерениях с контролем изменения температуры образцов и контролем изменения размеров частиц, кроме того, техническим результатом является доступность, простота, экономичность способа, а также высокая информативность, точность и наглядность полученных

заменяющий лист (правило 26)

результатов, что гарантировало бы достоверность и очевидность наличия или отсутствия онкологического заболевания, а также возможного риска его возникновения.

раскрытие изобретения

технический результат достигается тем, что предложен способ диагностики онкологического заболевания, включающий проведение лазерной корреляционной спектроскопии нативной сыворотки или плазмы крови со сравнительным определением интенсивности спектров излучения, отличающийся тем, что получают исходный спектр излучения образца нативной сыворотки или плазмы крови при 10- 39 ⁰ C, с которым сравнивают повышение интенсивности спектра излучения указанного образца в буферном растворе при его нагревании до 70-90° с, по сравнению с исходным, затем образец нативной сыворотки или плазмы крови охлаждают до 20- 40 ⁰ C и сравнивают показатели интенсивности спектра, полученные при охлаждении образца до 20-40 ⁰ C, с исходным спектром излучения, при наличии в полученном спектре излучения частиц с размером 150 - 1000 нм, и доли рассеянного излучения от них менее 2% диагностируют возможный риск обнаружения онкологического заболевания, при наличии указанных частиц с размером 150 - 1000 нм и доли рассеянного излучения от них более 2% диагностируют наличие онкологического заболевания.

для диагностики онкологического заболевания по предлагаемому способу из образца крови получают сыворотку или плазму, которую анализируют по интенсивности излучения при проведении лазерной корреляционной спектроскопии. в исследуемом образце могут быть обнаружены частицы с размером 150-1000 нм. необходимо определить момент образования обнаруженных в образце частиц: до забора крови или при получении сыворотки или плазмы. для этого первоначально получают спектр излучения образца при 10-39 ⁰ C, затем нагревают образец сыворотки или плазмы крови до 70-90 ⁰ C. затем указанный образец охлаждают до 20-40 ⁰ C и сравнивают показатели интенсивности спектра, полученные при охлаждении образца до 20-40 ⁰ C, с исходным спектром излучения. при наличии в полученном спектре излучения частиц с размером 150 - 1000 нм, и доли рассеянного излучения от них менее 2% диагностируют возможный риск обнаружения онкологического заболевания, при наличии указанных частиц с

заменяющий лист (правило 26)

размером 150 - 1000 нм и доли рассеянного излучения от них более 2% диагностируют наличие онкологического заболевания.

биологические макромолекулы стабилизируются в буферном растворе pH7.0 - pH7.6, который состоит из раствора солей натрия хлорида и солей фосфорной кислоты с ионной силой, равной ионной силе физиологического раствора , при этом фиксируют температуру, при которой ведутся измерения, контролируют температуру в процессе измерений, и изменяют с высокой точностью, порядка 0,3 с, температуру образца. различия в биологических макромолекулах сыворотки или плазмы крови, появление которых возможно при заборе, приготовлении и хранении образца устраняют последующим прогревом образца до интервала температур 70-90 с и его постепенным охлаждением до 20-40 ⁰ C, что обеспечивает истинную картину распределения частиц в сыворотке или плазме крови с последующим сравнением интенсивности рассеянного излучения при проведении лазерной корреляционной спектроскопии нативной плазмы или сыворотки крови при вышеуказанных интервалах температур. далее проводят анализ частиц с характерным диаметром от 150 до 1000 нм по спектру излучения, полученному при интервале температур 20-40 ⁰ C после охлаждения последующим сравнением интенсивности излучений при проведении лазерной корреляционной спектроскопии нативной сыворотки или плазмы крови всего спектра излучения, а не отдельных частиц.

при нагревании образца происходит диссоциация комплексов биологических макромолекул и интенсивность излучения при проведении лазерной корреляционной спектроскопии изменяется - получают первый спектр сравнения, в случае, если интенсивность полученного спектра уменьшается по отношению к исходному спектру, делают вывод, что полученный спектр характеризует наличие риска онкологического заболевания. для подтверждения и контроля корректности проведенного измерения и отсутствия признаков тепловой и необратимой денатурации биологических макромолекул образца, его охлаждают до 20-40 ⁰ C и получают второй спектр сравнения. полученный в процессе измерения спектр исследуют для получения функции распределения наночастиц по размерам от 1 до 2 000 нм. в предлагаемом способе диагностики онкологического заболевания осуществляют сравнительную характеристику интенсивностей всего спектра при двух фиксированных интервалах температур T ₀ = 20-40 с и Ti = 70-90 с, где в качестве контроля сравнения используют один и тот же образец нативной сыворотки

заменяющий лист (правило 26)

или плазмы крови пациента, что позволяет проводить измерения именно изменений в макромолекулах сыворотки или плазмы крови и нивелировать особенности предварительной подготовки образца. обрабатывают спектр излучения образца с измерением распределения частиц по размерам, охлажденный до интервала температур 20-40 ⁰ C после его предварительного нагрева до 70-90 ⁰ C и по наличию частиц с характерным размером 150 - 1000 нм, в зависимости от доли рассеянного излучения, делают заключение о предрасположенности к онкологическим заболеваниям. при наличии указанных частиц с размером 150 - 1000 нм и доли рассеянного излучения от них менее 2% - делают заключение о возможном риске обнаружения онкологического заболевания, при наличии указанных частиц с размером 150 - 1000 нм и доли рассеянного излучения от них более 2% - делают заключение о наличии онкологического заболевания. заявляемый способ позволяет выявить изменения в состоянии биологических макромолекул, обеспечивая при этом высокую точность и информативность измерений. исследования выполняют с минимальным объемом сыворотки или плазмы крови - до 0.2 мл, препаративная подготовка которой позволяет провести сравнительный анализ взаимодействия биологических макромолекул с лазерным излучением при изменении температуры образца.

на фиг. 1 представлена таблица примеров изучения интенсивности светорассеивания образцов методом лазерной корреляционной спектроскопии нативной плазмы, или сыворотки крови. в таблице 1 приведены диагностические данные, полученные при анализе сравнительной характеристики интенсивностей всего спектра, где в качестве контроля сравнения был использован один и тот же образец, взятый у пациента, что позволяло измерять именно изменения в макромолекулах сыворотки или плазмы крови пациента и нивелировать особенности предварительной подготовки образца. точность диагностических данных, приведенных в таблице 1, была подтверждена многочисленными примерами спектров излучений, полученных как от пациентов, которые оказались здоровыми, так и от пациентов, у которых диагноз онкологического заболевания, обнаруженного указанным способом, подтвердился. заявляемый способ осуществляют следующим образом. из вены обследуемого человека берут натощак кровь. затем из крови получают сыворотку или плазму любым из общепринятых способов. для этого пробирку с кровью выдерживают до образования сгустка, а затем отделяют образовавшийся

заменяющий лист (правило 26)

тромб от стен пробирки круговым движением. пробирку центрифугируют при 300 - 300Og в течение 10 - 30 минут и супернатант переносят в чистую пробирку, которую или замораживают или передают оператору прибора для выполнения анализа. если образец крови был собран в пробирку с антикоагулянтом, то после его замораживания из образца необходимо удалить фибриновый сгусток с помощью центрифугирования или пипеткой. аликвоту со 100 мкл сыворотки или плазмы крови помещают в кювету, содержащую гипоизотонический: от 10 до 100% от изотоничности физиологического раствора или от 0.09 до 0.9 г соли хлорида натрия и фосфоронй кислоты на 100 г воды, фосфатный водный буфер рн 7.0 - рн 7.8 при температуре 10-39 ⁰ C. общий объем образца в кювете составляет 1.0 мл. проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 2-10 минут проводят накопление спектра. затем данный образец нагревают до 70-90 ⁰ C, и проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 2-10 минут проводят накопление спектра - тем самым получают первый спектр сравнения. затем образец охлаждают до возвращения температуры образца до 20-40 ⁰ C. и снова проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 2-10 минут проводят накопление спектра - тем самым получают второй спектр сравнения. сравнивая интенсивность сигналов исходного и первого сравнения, делают заключение о наличии риска онкологического заболевания, или о наличии онкологического заболевания или об отсутствии онкологического заболевания. так, если интенсивность первого спектра сравнения ниже чем интенсивность исходного спектра, то делают заключение о наличии риска онкологического заболевания или онкологического заболевания, если интесивность первого спектра сравнения выше, чем интенсивность исходного спектра, то делают заключение об отсутствии онкологического заболевания. второй спектр сравнения анализируют на наличие частиц 150 - 1000 нм и их доли в рассеянном излучении. при их наличии и доли рассеянного излучения от них более 2 % делают заключение о наличии онкологического заболевания, при их наличии, но доли рассеянного излучения менее 2% делают заключение о риске онкологического заболевания. второй спектр сравнения используют как эталон качества проведенной процедуры, так как второй спектр образца после его остывания должен совпадать с исходным спектром.

заменяющий лист (правило 26)

примеры:

пример 1.

больной 41 год. диагноз: рак толстой кишки, IY стадия, метастазы в региональные лимфоузлы, одиночный метастаз в печень.

для проведения иммунотерапии с целью выполнения лечебного процесса из локтевой вены было взято 20 мл крови с 0.2% цитратом натрия. мононуклеарные клетки собрали после 30 минутной инкубации крови в термостате. а плазма крови была взята на исследование методом лазерной корреляционной спектроскопии, так как для выполнения лечебных процедур она не используется. плазму центрифугировали при 3000 g в течение 30 минут и супернатант аккуратно собирают и разливают на аликвоты по 1 мл в пласмасовую коническую пробирку типа «эппeндopф» с целью изучения влияния различных параметров (время хранения, замораживание, повторное центрифугирование) на интенсивность спектра. данные исследования необходимы, так как известно, что после замораживания плазмы в пробе образуется фибриновый сгусток, который будет мешать проведению анализа. аликвоту сыворотки помещают в кювету содержащую изотонический фосфатный буфер рн 7.0 - рн 7.8 при температуре 10-39 с. проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 3 минут проводят накопление спектра - получают исходный спектр. затем данный образец нагревают до 70-90 ⁰ C. и опять проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 8 минут проводят накопление спектра, получают первый спектр сравнения. затем образец охлаждают до возвращения температуры образца до 20-40° с. и опять проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 5 минут проводят накопление спектра - получают второй спектр сравнения. изучая интенсивность сигналов исходного и первого и второго спектров сравнения, делают вывод о наличии онкологического заболевания или группы риска по данной нозологии. так, в данном случае интенсивность первого спектра сравнения ниже чем исходного, следовательно делают вывод о наличии онкологического заболевания. при анализе светорассеивания образца второго спектра сравнения установлено, что доля частиц 150 - 1000 нм в общем светорассеивании больше 4% из чего следует, что обследуемый является онкологическим больным.

заменяющий лист (правило 26)

пример 2.

аналогичные манипуляции выполняют после оттаивания образца, хранившегося в течение 30 дней при температуре -20° с. образец повторно центрифугировали при 3000 g в течение 30 минут и супернатант аккуратно собрали и перенесли в новую пластмассовую пробирку. из этой пробирки брали аликвоту сыворотки на анализ. аликвоту сыворотки помещают в кювету содержащую изотонический фосфатный буфер рн 7.0 - рн 7.8 при температуре 10-39 с. проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 3 минут проводят накопление спектра-получают исходный спектр. затем данный образец нагревают до 70-90 ⁰ C. и опять проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 3 минут проводят накопление спектра-получают первый спектр сравнения. затем образец охлаждают до возвращения температуры образца до 20-40° с. и опять проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 5 минут проводят накопление спектра — получают второй спектр сравнения. изучая интенсивность сигналов исходного и первого и второго спектров сравнения, делают вывод о наличии онкологического заболевания, так как интенсивность первого спектра сравнения ниже, чем чем исходного. при анализе светорассеивания образца второго спектра сравнения установлено, что доля частиц 150 - 1000 нм в общем светорассеивании больше 4% из чего следует, что обследуемый является онкологическим больным. пример 3.

больная в., 37 лет. диагноз рак молочной железы, одиночный узел в верхнем дистальном квадранте правой груди. I - II стадия. перед госпитализацией больная проходит медицинское обследование. для этого больной берут кровь натощак из локтевой вены для получения сыворотки общепринятым методом: отстаивают до формирования сгустка, затем сформировавшийся сгусток отрывают круговым движением. кровь центрифугировали при 3000 g в течение 30 минут и супернатант аккуратно собирают для анализа. аликвоту (100 мкл) из этой сыворотки использовали для исследования методом лазерной корреляционной спектроскопии. аликвоту сыворотки помещают в кювету содержащую изотонический фосфатный буфер рн 7.0 - рн 7.8 при температуре 10-39 с. общий объем образца 1.0 мл. проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 3 минут проводят накопление спектра - получают исходный спектр. затем

заменяющий лист (правило 26)

данный образец нагревают до 70-90 ° с. и опять проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 3 минут проводят накопление спектра - получают первый спектр сравнения. затем образец охлаждают до возвращения температуры образца до 20-40° с. и опять проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 5 минут проводят накопление спектра - получают второй спектр сравнения. изучая интенсивность сигналов исходного и первого и второго спектров сравнения, делают вывод о наличии онкологического заболевания или риска его развития, так как интенсивность первого спектра сравнения ниже, чем исходного. при анализе светорассеивания образца второго спектра сравнения установлено, что доля частиц 150 - 1000 нм в общем светорассеивании больше 2% из чего следует, что обследуемая является онкологическим больным. пример 4.

донор M., 34 лет. во время медицинского обследования предшествующего сдаче крови в донорском пункте никаких патологий или заболеваний не выявлено. в исследовании использована кровь отобранная у донора для проведения обычных анализов обязательных для всех добровольных доноров.

кровь натощак из локтевой вены для получения сыворотки общепринятым методом: отстаивают до формирования сгустка, затем сформировавшийся сгусток отрывают круговым движением. кровь центрифугировали при 3000 g в течение 30 минут и супернатант аккуратно собирают для анализа. аликвоту из этой сыворотки (100 мкл) использовали для исследования методом лазерной корреляционной спектроскопии. аликвоту сыворотки помещают в кювету содержащую изотонический фосфатный буфер рн 7.0 - рн 7.8 при температуре 10-39 ⁰ C. общий объем образца 1.0 мл. проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 3 минут проводят накопление спектра - получают исходный спектр. затем данный образец нагревают до 70-90 ⁰ C. и опять проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 3 минут проводят накопление спектра - получают первый спектр сравнения. затем образец охлаждают до возвращения температуры образца до 20-40° с. и опять проводят лазерную корреляционную спектроскопию приготовленного образца. в течение 5 минут проводят накопление спектра, получают второй спектр сравнения. изучая интенсивность сигналов исходного и первого и второго спектров сравнения,

заменяющий лист (правило 26)

делают вывод об отсутствии онкологического заболевания, так как интенсивность первого спектра сравнения выше, чем у исходного. таким образом, заявляемый способ диагностики онкологического заболевания позволяет выявить изменения в состоянии биологических макромолекул, обеспечивая при этом высокую точность и информативность. исследования выполняют с минимальным объемом сыворотки крови - до 0.2 мл, препаративная подготовка которой позволяет провести сравнительный анализ взаимодействия биологических макромолекул с лазерным излучением при изменении температуры образца. диагностическое значение сравнительной характеристики интенсивностей всего спектра, где в качестве контроля сравнения используют тот же образец того же пациента, что позволяет измерять именно изменения в макромолекулах сыворотки крови и нивелировать особенности подготовки образца, было подтверждено длительными анализом спектров как полученных от здоровых обследуемых, так и от онкологических больных

таким образом, достигнут желаемый технический результат, на достижение которого направлено данное изобретение, а именно, предложен способ диагностики онкологического заболевания, который обеспечивает достоверную диагностику онкологического заболевания, в том числе на ранней стадии заболевания путем получения сравнительной количественной характеристики интенсивности излучения при проведении лазерной корреляционной спектроскопии нативной плазмы, или сыворотки в условиях контроля концентрации солей и кислотности раствора и снятия спектров интенсивности светорассеивания при трех измерениях с контролем изменения температуры образцов и контролем изменения размеров частиц, кроме того, отличительной чертой способа является его доступность, простота, экономичность способа, а также высокая информативность, точность и наглядность полученных результатов, что гарантирует достоверность и очевидность наличия или отсутствия онкологического заболевания, а также возможного риска его возникновения. заявляемый способ диагностики онкологического заболевания имеет также еще одно принципиальные отличие от известных способов диагностики, в которых проводят абсолютное измерение каких-либо параметров образца, например процент частиц определенного размера, в то время, как в заявляемом способе получают сравнительные количественные характеристики интенсивности излучения при проведении лазерной корреляционной спектроскопии нативной плазмы, или сыворотки в условиях контроля концентрации солей и кислотности раствора и

заменяющий лист (правило 26)

снятия спектров интенсивности светорассеивания при трех измерениях с контролем изменения температуры образцов и контролем изменения размеров частиц

промышленная применимость

изобретение относится к медицине, а именно к онкологии, и может быть использовано для диагностики онкологических заболеваний, в частности, для диагностики ранней стадии онкологических заболеваний, например, при проведении плановой диспансеризации. способ диагностики онкологического заболевания, включающий проведение лазерной корреляционной спектроскопии нативной сыворотки или плазмы крови со сравнительным определением интенсивности спектров излучения, отличается от известных аналогов тем, что для его осуществления получают исходный спектр излучения образца нативной сыворотки или плазмы крови при 10-39 ⁰ C, с которым сравнивают повышение интенсивности спектра излучения указанного образца в буферном растворе при его нагревании до 70- 90° с, по сравнению с исходным, затем образец нативной сыворотки или плазмы крови охлаждают до 20-40 ⁰ C и сравнивают показатели интенсивности спектра, полученные при его охлаждении до 20-40 ⁰ C с исходным спектром излучения, при наличии в полученном спектре излучения частиц с размером 150 - 1000 нм, и доли рассеянного излучения от них менее 2% диагностируют возможный риск обнаружения онкологического заболевания, при наличии указанных частиц с размером 150 - 1000 нм и доли рассеянного излучения от них более 2% диагностируют наличие онкологического заболевания. предлагаемый способ может быть применен в условиях массовых медицинских осмотров населения в центрах, адаптированных к условиям работы с сывороткой крови, что подтверждает его промышленную применимость. способ достаточно прост, доступен, экономичен, так как не требует больших временных и финансовых затрат. с помощью данного способа можно выделить группу людей нуждающихся в углубленном инструментальном исследовании с целью обнаружения опухолевого очага.

источники информации:

1. патент рф λb 2108577, кл. G01Nзз/49 ,G01Nзз/52, публ. 2003.12.20

2. патент рф ш 2042133 кл. G 01 N 33/48, публ. 1995.08.20

3. патент рф JN° 2105306 кл. G Ol N 33/48, публ. 1998.02.20

заменяющий лист (правило 26)

таблица 1.

*Oнкoлoгичecкий диагноз верифицирован при дальнейших исследованиях

фиг.l

заменяющий лист (правило 26)