PCR-Verfahren zur Superamplifikation Beschreibung

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Hintergrund der Erfindung

PCR-Verfahren sind aus dem Stand der Technik bekannt. Die Patentschrift US 4 683 202 B1 offenbart ein Verfahren, mit dem mindestens eine spezifische Nukleinsäuresequenz aus einer Nukleinsäure oder aus einem Gemisch von Nukleinsäuren vervielfältigt werden kann, wobei jede Nukleinsäure aus zwei getrennten, komplementären Strängen, von gleicher oder ungleicher Länge, besteht. Das Verfahren umfasst: (a) Das Behandeln der Stränge mit zwei Primern für jede unterschiedliche spezifische Sequenz, die vervielfältigt wird, unter derartigen Bedingungen, dass für jede unterschiedliche Sequenz, die vervielfältigt wird, ein Extensionsprodukt für jeden Primer synthetisiert wird, das komplementär zu dem jeweiligen Nukleinsäurestrang ist; dabei werden besagte Primer so ausgewählt, dass sie im

Wesentlichen komplementär zu unterschiedlichen Strängen jeder spezifischen Sequenz sind, so dass das Extensionsprodukt, das aus einem Primer synthetisiert wird, wenn es von seinem Komplement getrennt ist, als eine Vorlage für die Synthese des Extensionsprodukts des anderen Primers dienen kann; (b) das Trennen der Primer-Extensionsprodukte von den Vorlagen, an denen sie synthetisiert wurden, so dass einzelsträngige Moleküle entstehen; (c) das Behandeln der einzelsträngigen Moleküle aus dem Schritt (b) mit den Primern aus Schritt (a) unter derartigen Bedingungen, dass ein Primer-Extensionsprodukt synthetisiert wird, wobei jeder der Einzelstränge aus Schritt (b) als Vorlage verwendet wird. Die Schritte können nacheinander oder gleichzeitig ausgeführt werden. Zudem können die Schritte (b) und (c) wiederholt werden bis das erwünschte Ausmaß der Sequenz-Vervielfältigung erreicht ist.

In der Internationalen Offenlegungsschrift WO 2007/143034 A1 werden Verfahren offenbart, die zur Durchführung eines PCR-Verfahrens geeignet sein sollen. Die Verfahren können die Benutzung einer optischen Strahlenquelle zur Erhitzung in einem PCR-Verfahren umfassen. Die Verfahren können auch die Verwendung der Oberflächenplasmonenresonanz oder des Fluoreszenz-Resonanzenergietransfers zur Überwachung eines PCR-Verfahrens in Echtzeit einschließen. Die Verfahren können weiterhin die Immobilisierung eines Templates, Primers oder einer Polymerase auf einer Oberfläche wie Gold oder einer anderen Oberfläche, die in Bezug auf die Oberflächenplasmonenresonanz aktiv ist, umfassen.

Die Patentanmeldung US 2002/0061588 A1 offenbart Verfahren, um Nukleinsäuren lokal und direkt auf ein externes Signal ansprechbar zu machen. Das Signal wirkt nur auf eine oder mehrere spezifische lokalisierte Anteile der Nukleinsäure. Gemäß der Erfindung kann das Signal die Eigenschaften einer spezifischen Nukleinsäure und dadurch auch ihre Funktion verändern. Dementsprechend stellt die Erfindung Verfahren bereit, die die Struktur und Funktion einer Nukleinsäure in einer biologischen Probe regeln, ohne andere

Bestandteile der Probe zu beeinflussen. In einer Ausführungsform transferiert ein Modulator Hitze auf eine Nukleinsäure oder einen Teil einer Nukleinsäure, was z.B. darin resultiert, dass inter- oder intramolekulare Bindungen destabilisiert werden und sich die Struktur und Stabilität der Nukleinsäure ändert. Bevorzugte Modulatoren schließen Metallnanopartikel, halbleitende Nanopartikel, magnetische Nanopartikel, Oxidnanopartikel und Chromophore ein. Es wird auch angeregt, diese Verfahren in Zusammenhang mit einem PCR-Verfahren zu verwenden. Insbesondere wird vorgeschlagen, eine PCR-Reaktion mit einem Modulator zu steuern.

Die Patentanmeldung DE 10 2012 201 475 A1 betrifft ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren. In diesem Verfahren übertragen elektromagnetisch angeregte Nanopartikel in einem Reaktionsvolumen durch Anregung Wärme an ihre Umgebung. Sofern der Wärme- Eintrag eine kritische Dauer, die von dem mittleren Partikelabstand in der Lösung und somit der Konzentration der Nanopartikel abhängt, unterschreitet kann eine sehr schnelle

Denaturierung erreicht werden, wobei die Dauer der Anregung der Nanopartikel sehr viel Kürzer ist, als die Zyklendauer.

Das Patent DE 10 2013 215 166 B3 (Veröffentlichungstag der Patenterteilung 30.10.2014) der Erfinder dieser Patentanmeldung beinhaltet ein Verfahren zur Superamplifikation, bei dem die Verkürzung der Zyklendauer zu einem geringen Zugewinn je Zyklus führt, was aber durch die Möglichkeit mehr Zyklen pro Zeiteinheit durchführen zu können, mehr als kompensiert wird.

Die Patentanmeldung US 2003/0143604 A1 betrifft die Verwendung von Nanopartikel- Detektions-Sonden zur Überwachung von Vervielfältigungsreaktionen, insbesondere PCR. Vornehmlich beschäftigt sich die Patentanmeldung mit der Verwendung von Nanopartikel- Oligonukleotid-Konjugaten, die mit einem Schutzreagens, wie bovines Serumalbumin, behandelt sind, um ein Target-Polynukleotid quantitativ und qualitativ zu detektieren. Die Patentanmeldung offenbart eine Nukleinsäure-Vervielfältigung und -Detektion unter Verwendung von Gold-Nanopartikel-Primern. In einem ersten Schritt wird dabei das Nukleinsäure-Target denaturiert in Anwesenheit der Gold-Nanopartikel, an denen Primer angebracht sind. In einem zweiten Schritt hybridisieren die Gold-Nanopartikel mit den daran angebrachten Primern an das Nukleinsäure-Target und eine Kopie der komplementären DNA-Sequenz wird erzeugt ausgehend von den Nukleinsäure-Primern, die an die

Nanopartikel angebracht sind. Die Schritte eins und zwei werden wiederholt und das optische Signal, das durch das Binden von komplementären Nanopartikel-Sonden, die amplifiziert wurden, entsteht, wird gemessen.

Aus der Patentschrift EP 1 842 924 B1 ist ein Verfahren zur Bestimmung einer anfänglichen Nukleinsäurekonzentration anhand von Echtzeit-Nukleinsäure-Verstärkungsdaten bekannt, bei der eine gemessene Fluoreszenz aufgrund der Vervielfältigung einer von der Zahl des durchlaufenen Zyklus abhängige Funktion durchläuft.

Der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein verbessertes Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bereitzustellen.

Insbesondere besteht die Aufgabe darin, eine schnellere und/oder höhere Vervielfältigung von Nukleinsäuren mittels einer PCR zu ermöglichen.

Erfindungsgemäße Lösung..

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren mittels einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR), bei der ein Zyklus bestehend aus den Schritten Denaturierung, Annealing und Elongation, wiederholt durchlaufen wird.

Die Lösung der gestellten Aufgabe gelingt erfindungsgemäß ferner durch ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren mittels einer PCR, bei der ein Zyklus bestehend aus den Schritten Denaturierung, Annealing und Elongation, wiederholt durchlaufen wird, wobei der Zugewinn (g) an Exemplaren einer zu vervielfältigenden Nukleinsäure am Ende wenigstens eines der Durchläufe des Zyklus weniger als 80 Prozent der zu Beginn dieses Durchlaufs vorhandenen Exemplaren der Nukleinsäure beträgt und bei wenigstens einem der

Durchläufe des Zyklus eine Einwirkdauer (t _A ) kürzer als eine Sekunde ist.

Die Lösung der Aufgabe gelingt weiterhin durch ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren mittels einer PCR, bei der ein Zyklus bestehend aus den Schritten

Denaturierung, Annealing und Elongation, wiederholt durchlaufen wird, wobei die Anzahl (k) der Durchläufe des Zyklus der Polymerase-Kettenreaktion größer als 45 ist.

Bei einer PCR wird ein Zyklus, der vorzugsweise je einmal die Schritte Denaturierung, Annealing (auch als Hybridisierung bezeichnet) und Elongation umfasst, wiederholt durchlaufen, und zwar vorzugsweise in dieser Reihenfolge. Zudem ist vorzugsweise derselbe Schritt in allen Durchläufen gleich lang. Dies ist aber keineswegs notwendig; so kann einer der Schritte oder können mehrere der Schritte durchaus in einem Durchlauf eine kürzere Dauer als in einem anderen Durchlauf haben. Die Dauer t _c eines Durchlaufs des Zyklus wird im Folgenden als Zyklusdauer bezeichnet. Die erfindungsgemäße Aufgabe wird durch ein Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren mittels PCR gelöst, bei dem bei wenigstens einem Durchlauf des Zyklus die Zyklusdauer t _c kleiner als 20 Sekunden ist.

Die Lösung der Aufgabe gelingt auch durch ein Verfahren zum Vervielfältigen von

Nukleinsäuren mittels einer Polymerase-Kettenreaktion, bei der ein Zyklus bestehend aus den Schritten Denaturierung, Annealing und Elongation, wiederholt durchlaufen wird, wobei die Zyklendauer t _c gegenüber der Zyklendauer einer ansonsten identisch durchgeführten Referenz-Polymerase-Kettenreaktion um den Faktor x reduziert ist, so dass der Zugewinn (g) an Exemplaren einer zu vervielfältigen Nukleinsäure am Ende wenigstens eines der Durchläufe des Zyklus gegenüber dem Zugewinn einer ansonsten identisch durchgeführten Referenz-PCR um den Faktor y verringert ist, wobei gilt, dass x > 0,9y und g < 80%

Im Folgenden wird eine zu vervielfältigende Nukleinsäure als Original bezeichnet; eine andere geläufiger Bezeichnung ist Amplikon. Das Original ist ein Einzelstrang und kann in dem Reaktionsvolumen zusammen mit seinem komplementären Strang, der als Komplement bezeichnet wird, einen Doppelstrang bilden. Dabei ist nach jedem Durchlauf eine

entstandene Kopie des Originals ein Original für den nächsten Durchlauf und eine entstandene Kopie des Komplements ist ein Komplement für den nächsten Durchlauf.

Bei einem Durchlauf des Zyklus kann die Anzahl der Exemplare des Originals und

Komplements erhöht werden. Das Verhältnis von in einem Durchlauf neu entstandenen Exemplaren des Originals zu unmittelbar vor dem Zyklus vorhandenen Exemplaren des Originals wird als Zugewinn g eines Durchlaufs bezeichnet. Theoretisch kann bei einer PCR pro Durchlauf eine Verdopplung der Anzahl von Originalen, also ein Zugewinn g von 100% erreicht werden. Tatsächlich ist der Zugewinn in der Regel jedoch kleiner als 100%.

Der Zyklus kann so oft durchlaufen werden, bis das gewünschte Ausmaß der Vervielfältigung erreicht ist. Wenn zu Beginn der PCR N ₀ Original-DNA-Moleküle im Reaktionsvolumen enthalten sind und wenn g über die Dauer T der gesamten PCR, nachfolgend als

Prozessdauer bezeichnet, konstant bleibt, so sind nach k Durchläufen N _k DNA-Moleküle mit der Sequenz des Originals im Reaktionsvolumen vorhanden:

N _k = N ₀ ^* (1 + g) ^k . (1)

Aus der Bestimmung des Vervielfältigungsfaktors N _k /N ₀ kann der Zugewinn g wie folgt berechnet werden: g = (N _k /N ₀ ) ^1/k - 1. (2)

Hier wird vereinfachend angenommen, dass der Zugewinn g je Zyklus während der PCR konstant bleibt. Im Allgemeinen dürfte diese Annahme jedenfalls so lange zutreffen, wie keine Sättigungseffekte, etwa durch den Verbrauch von Reaktionspartnern, eintreten.

Die Prozessdauer T der PCR, die erforderlich ist, um ein gewünschtes Ausmaß der

Vervielfältigung zu erreichen, hängt von der Dauer jedes Durchlaufs, im Folgenden

Zyklusdauer t _c genannt, und vom Zugewinn ab: Eine lange Zyklusdauer erhöht auch die Prozessdauer; aber auch ein geringer Zugewinn erhöht die Prozessdauer, weil er mehr Durchläufe erforderlich macht.

Die Erfindung nutzt einerseits aus, dass der in einem Durchlauf des Zyklus erreichbare Zugewinn allgemeinen von Zyklusdauer, zu der die Einwirkdauer t _A wesentlich beiträgt, abhängt. So setzt der theoretische erreichbare Wert von 100% Zugewinn pro Zyklus voraus, dass alle Originale erfolgreich sämtliche Schritte Denaturierung, Annealing und Elongation durchlaufen; mit zunehmender Verkürzung des Durchlaufs kann dies nicht mehr

sichergestellt werden, z.B. kann es vermehr zu nur teilweisem Annealing oder nur teilweiser Elongation oder nur teilweiser Denaturierung kommen. Die Erfindung nutzt weiterhin aus, dass nach Erkenntnis der Erfinder der Vorteil einer Verkürzung der Dauer eines Durchlaufs den Nachteil eines geringeren Zugewinns überwiegen kann, sodass trotz des geringeren Zugewinns pro Durchlauf die für ein gewünschtes Ausmaß der Vervielfältigung erforderliche Prozessdauer verkürzt werden kann. Das erfindungsgemäße Verfahren läuft in einem Raum, der nachfolgend als

Reaktionsvolumen bezeichnet wird, ab. Das Reaktionsvolumen kann von einem

Reaktionsgefäß umgeben sein. Das Reaktionsvolumen enthält eine Probe, in der für gewöhnlich die zu vervielfältigende(n) Nukleinsäure(n) vorliegen. Die Probe kann eine Flüssigkeit umfassen, vorzugsweise Wasser. Die Zyklen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden zumindest in einem Teil der Probe durchlaufen. Die Flüssigkeit kann

vorteilhafterweise als Suspensionsmedium und/oder Lösungsmittel, für die Originale und Komplemente und/oder andere Bestandteile der Probe dienen.

Der Denaturierungsschritt dient dazu, einen Nukleinsäure-Doppelstrang zu denaturieren, d.h. in ihre beiden Einzelstränge aufzutrennen. So kann in dem Denaturierungsschritt z.B. das Original von dem Komplement getrennt werden. Denaturieren wird auch als Schmelzen bezeichnet. Das Denaturieren des Nukleinsäure-Doppelstrangs wird gewöhnlich thermisch induziert, d.h. zumindest ein Teil des Nukleinsäure-Doppelstrangs oder der ganze

Doppelstrang wird einer Temperatur, als Denaturierungstemperatur bezeichnet, ausgesetzt, die ein Trennen der Nukleinsäure-Doppelstränge hervorruft oder zumindest begünstigt. Die Denaturierungstemperatur muss keine feste Temperatur sein, sondern kann auch ein Temperaturintervall sein, innerhalb dessen die Temperatur im Denaturierungsschritt variiert. Die bevorzugte Denaturierungstemperatur ist einerseits so hoch gewählt, dass Nukleinsäure- Doppelstränge aufgetrennt werden können. Andererseits ist die bevorzugte

Denaturierungstemperatur so niedrig gewählt, dass eine DNA-Polymerase, die sich möglicherweise ebenfalls in der Probe befindet, nicht wesentlich geschädigt wird. Ein typischer Wert für die Denaturierungstemperatur ist 95°C.

Das Reaktionsvolumen enthält ferner vorzugsweise mindestens zwei Oligonukleotide, die als Primer bezeichnet werden. Einer dieser Primer wird als Vorwärtsprimer und ein anderer als Rückwärtsprimer bezeichnet. Der Vorwärtsprimer ist komplementär zum 3'-Ende des

Originals. Der Rückwärtsprimer ist komplementär zum 3'-Ende des Komplements. Unter einem Annealing versteht man das Hybridisieren der Vorwärtsprimer mit dem Original und der Rückwärtsprimer mit dem Komplement. Der Annealingschritt dient dem Hybridisieren der Vorwärts- und Rückwärtsprimer an deren komplementäre Sequenzen im Original bzw.

Komplement. Auch das Annealing wird gewöhnlich thermisch induziert, d.h. zumindest ein Teil des Originals bzw. des Komplements oder das ganze Original bzw. Komplement wird einer Temperatur, als Annealingtemperatur bezeichnet, ausgesetzt, die ein Hybridisieren der Vorwärts- und Rückwärtsprimer an deren komplementäre Sequenzen im Original bzw.

Komplement hervorruft oder zumindest begünstigt. Wie die Denaturierungstemperatur kann auch die Annealingtemperatur ein Temperaturbereich sein, innerhalb dessen die Temperatur im Annealingschritt variiert. Der Annealingschritt findet typischerweise bei Temperaturen von 50°C bis 65 °C statt. Die Annealingtemperatur wird dabei so gewählt, dass ein möglichst spezifisches Hybridisieren der Primer erfolgen kann.

Hybridisieren bedeutet im Sinne der vorliegenden Erfindung das Ausbilden eines

Doppelstrangs aus zwei Einzelsträngen, die jeweils aus einer Nukleinsäure und/oder einem Oligonukleotid bestehen können. In geeigneten Reaktionsbedingungen führt das

Hybridisieren in der Regel zu dem geringstmöglichen Energiezustand, der durch die

Verbindung der beiden Einzelstränge erreicht werden kann. Mit anderen Worten binden unter geeigneten Bedingungen die beiden Einzelstränge vorzugsweise so aneinander, dass in Bezug auf die Sequenzen der beiden Einzelstränge die größtmögliche Komplementarität (d.h. Spezifität) hergestellt ist.

Wenn eine Nukleinsäure A teilweise komplementär zu einer Nukleinsäure B ist, bedeutet dies, dass die Nukleinsäure A in einem Teil zu einem Teil der Nukleinsäure B komplementär ist.

Die Bezeichnungen Nukleinsäure und Oligonukleotid umfassen im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung nicht nur (Desoxy)-Ribonukleinsäuren bzw. (Desoxy)-Oligo- Ribonukleotide, sondern auch Nukleinsäuren und Oligonukleotide, die ein oder mehrere Nukleotid-Analoga mit Modifikationen an ihrem Backbone (z.B. Methylphosphonate,

Phosphothioate oder Peptide Nucleic Acids [PNA], insbesondere an einem Zucker des Backbone (z.B. 2'-0-Alkylderivate, 3'- und/oder 5'-Aminoribosen, Locked Nucleic Acids

[LNA], Hexitol Nucleic Acids, Morpholinos, Glycol Nucleic Acid (GNA), Threose Nucleic Acid (TNA) oder Tricyclo-DNA, vergleiche hierzu den Aufsatz von D. Renneberg und C.J.

Leumann, "Watson-Crick base-pairing properties of Tricyclo-DNA", J. Am. Chem. Soc, 2002, Bd. 124, Seiten 5993-6002, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der

vorliegenden Offenbarung ist) enthalten oder die Basen-Analoga enthalten, z.B. 7- Deazapurine oder Universalbasen wie Nitroindol oder modifizierte natürliche Basen wie N4- Ethyl-Cytosin. In einer Ausführung der Erfindung sind die Nukleinsäuren oder

Oligonukleotide Konjugate oder Chimären mit nicht-nukleosidischen Analoga, z.B. PNA. Die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide enthalten in einer Ausführung der Erfindung, an einer oder mehreren Positionen nicht-nukleosidische Einheiten wie Spacer, z.B. Hexaethylenglycol oder Cn-Spacer mit n zwischen 3 und 6. Soweit die Nukleinsäuren oder Oligonukleotide Modifikationen enthalten, sind diese so gewählt, dass auch mit der Modifikation eine

Hybridisierung mit natürlichen DNA/RNA-Analyten möglich ist. Bevorzugte Modifikationen beeinflussen das Schmelzverhalten, vorzugsweise die Schmelztemperatur, insbesondere um Hybride mit unterschiedlichen Graden der Komplementarität ihrer Basen unterscheiden zu können (Mismatch-Diskriminierung). Bevorzugte Modifikationen umfassen LNA, 8-Aza-7- Deaza-Purine, 5-Propinyl-Uracil und -Cytosin und/oder abasische Unterbrechungen oder Modifikationen in der Nukleinsäure oder in dem Oligonukleotid. Weitere Modifikationen im Sinne der Erfindung sind z.B. Modifikationen mit Biotin, Thiol und Fluoreszenzdonor- und Fluoreszenzakzeptormolekülen.

Eine abasische Modifikation im Sinne der vorliegenden Erfindung ist ein Abschnitt des Oligonukleotids, in welchem die Abfolge von Nukleotiden durch die Einführung von einem oder mehreren Molekülen, welche keine Nukleotide darstellen, unterbrochen ist; dergestalt, dass eine Polymerase die Synthese eines ansonsten vollständig oder teilweise

hybridisierten, komplementären Oligonukleotids auf Höhe dieses Abschnitts vollständig oder teilweise abbricht, da an diesem Abschnitt keine hinreichende Basenkomplementarität gegeben ist. Eine abasische Modifikation ist vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die umfasst: 1', 2'- Dideoxyribose (dSpacer), Hexa-Ethylenglycol (Spacer18) und Tri- Ethylenglycol (Spacer9).

Das Reaktionsvolumen enthält ferner eine DNA-Polymerase. Die DNA-Polymerase kann in einem Elongationsschritt ausgehend von dem Vorwärtsprimer eine Kopie des Komplements synthetisieren. Ausgehend von dem Rückwärtsprimer kann die DNA-Polymerase eine Kopie des Originals synthetisieren. Durch die Synthese ist die Kopie des Komplements mit dem Original hybridisiert und die Kopie des Originals ist mit dem Komplement hybridisiert. Zum Zweck der Elongation wird die DNA-Polymerase einer Temperatur, die als

Elongationstemperatur bezeichnet wird, ausgesetzt, die eine Elongation ermöglicht oder zumindest begünstigt. Auch bei der Elongationstemperatur kann es sich um einen

Temperaturbereich handeln, innerhalb dessen die Temperatur im Elongationsschritt variiert. Bei der Verwendung einer Polymerase von Thermus aquaticus (Taq) wird typischerweise eine Elongationstemperatur von 72 °C verwendet. In manchen Ausführungsformen der PCR sind die Annealing- und die Elongationstemperaturen identisch, das heißt, beide Schritte finden bei der gleichen Temperatur statt.

In einer bevorzugten Ausführungsform werden wenigstens zwei Schritte der PCR bei unterschiedlichen Temperaturen ausgeführt, so dass es notwendig sein kann, in dem Zyklus einen oder mehrere Heizschritte und/oder Kühlschritte vorzusehen, in denen das

Reaktionsvolumen oder Teile des Reaktionsvolumens erhitzt beziehungsweise gekühlt werden. Ein Heiz- oder Kühlsehritt kann vor oder nach einem der Schritte Denaturierung, Annealing und Elongation stattfinden. Dabei überlappt sich typischerweise ein Heiz- oder Kühlschritt mit dem vorangehenden und/oder dem nachfolgenden Denaturierungs-,

Annealing- oder Elongationsschritt.

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Einwirkdauer t _A eines Durchlaufs des Zyklus die Gesamtdauer, in der eine Energiequelle während des Durchlaufs des Zyklus mit einer zum Denaturieren geeigneten Leistung auf einen Punkt in der Probe einwirkt, um eine Erwärmung in der Probe hervorzurufen.

Die Energiequelle überträgt während der gesamten Zeit t _A eine Leistung, die zur

Denaturierung geeignet ist, auf den besagten Punkt. Eine Energiequelle in Form eines Lasers könnte zum Beispiel bei einer höheren Leistung zur Denaturierung und zu einer anschließenden Extinktionsmessung bei geringerer Leistung verwendet werden. In diesem Fall ist t _A lediglich die Zeit, in die der Laser die höhere, zur Denaturierung geeignete Leistung auf den Punkt überträgt.

Falls mehrere Energiequellen zur Denaturierung verwendet werden, so bezieht sich t _A vorzugsweise auf die Zeit, in der alle Energiequellen zur Denaturierung zugleich auf den Punkt einwirken. Bei der Aktivierung mehrerer Energiequellen kann häufig erst das zeitgleiche Einwirken zur Denaturierung führen.

Der besagte Punkt ist dabei innerhalb des Teils der Probe, in der das Verfahren durchgeführt wird, so bestimmt, dass t _A den größten möglichen Wert annimmt. Wenn die Erwärmung also beispielsweise von einem feststehenden Peltier-Element hervorgerufen wird, ist t _A die Gesamtdauer, in der Wärme vom Peltier-Element in diesem Zyklus zu diesem Punkt fließt und dort eine zur Denaturierung geeignete Temperaturerhöhung bewirkt (typischerweise etwa die Einschaltdauer während des Heizschritts; in jedem Fall kürzer als die Zyklendauer). Wenn die Erwärmung durch einen Lichtstrahl mit dem Durchmesser d hervorgerufen wird, der mit einer Geschwindigkeit v durch das Probenvolumen geführt („gescannt") wird, ist t _A die

Zeitdauer - V während der der Lichtstrahl hierbei auf einen Punkt in der Probe mit einer zur

Denaturierung geeigneten Leistung einwirkt. Wenn die Erwärmung durch eine gepulste Lichtquelle hervorgerufen wird, deren Lichtstrahl während der Pulsdauer nicht relativ zur Probe bewegt wird, ist die Pulsdauer die Einwirkdauer. Wenn die Erwärmung durch eine gepulste Lichtquelle, die durch die Probe gescannt wird, hervorgerufen wird, ist die kürzere der beiden Dauern (Pulsdauer und Zeitdauer ^ ) die Einwirkdauer. Durch die erfindungsgemäße Auswahl von besonders kleinen Werten von Einwirkdauer t _A und Zyklusdauer t _c kann ein besonders schnelles PCR-Verfahren verwirklicht werden. Bei einer kurzen Einwirkdauer können in geringer Zeit zahlreiche Zyklen durchlaufen werden, so dass auch ein geringer Zugewinn in Kauf genommen werden kann. Durch die

erfindungsgemäße, hohe Anzahl an Zyklen kann vorteilhafterweise eine höhere

Vervielfältigung des Amplikons erreicht werden.

Bevorzugte Ausgestaltungen der Erfindung

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung findet ein Heizschritt vor dem

Denaturierungsschritt statt, vorzugsweise überlappt er mit dem Denaturierungsschritt. Bei dem Heizschritt wird vorzugsweise zumindest lokal, das heißt in bestimmten Bereichen des Reaktionsvolumens, die Temperatur im Denaturierungsschritt gegenüber der Temperatur in Elongationsschritt erhöht, um eine zu Denaturierung zu ermöglichen. Vorzugsweise wird durch das Einwirken der Energiequelle zumindest in diesen Bereichen eine Temperatur von mindestens 90 °C, besonders vorzugsweise von mindestens 95 °C erreicht.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung findet ein Kühlschritt vor dem

Annealingschritt, besonders vorzugsweise mit diesem überlappend, statt, um die zum Annealing benötigte Temperatur zu erreichen. Soweit die Temperatur im vorangegangenen Denaturierungsschritt nur lokal erhöht war, erfolgt die Kühlung vorzugsweise durch

Wärmediffusion im Reaktionsvolumen.

Der Teil der Probe, in dem die Zyklen des erfindungsgemäßen Verfahrens durchlaufen werden, beinhaltet vorzugsweise mindestens 1%, besonders vorzugsweise mindestens 2%, besonders vorzugsweise mindestens 5%, besonders vorzugsweise mindestens 10% und ganz besonders vorzugsweise mindestens 20% des gesamten Probenvolumens. Zugleich beinhaltet der besagte Teil vorzugsweise höchstens 100%, besonders vorzugsweise höchstens 80%, besonders vorzugsweise höchstens 60% und ganz besonders vorzugsweise höchstens 40% des gesamten Probenvolumens. Eine Beschleunigung des Verfahrens kann dadurch erreicht werden, dass die Zyklen nur in einem Teil der Probe durchlaufen werden.

Vorzugsweise beträgt der Zugewinn g an Exemplaren einer zu vervielfältigen Nukleinsäure am Ende wenigstens eines der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung am Ende jedes von 10, besonders vorzugsweise jedes von 20, besonders vorzugsweise jedes von 40, besonders vorzugsweise jedes von 80, besonders jedes von 160 Durchläufen des Zyklus - weniger als 70%, besonders vorzugsweise weniger als 60%, besonders vorzugsweise weniger als 50%, besonders vorzugsweise weniger als 40%, besonders vorzugsweise weniger als 30%, besonders vorzugsweise weniger als 20%, besonders vorzugsweise weniger als 10%, besonders vorzugsweise weniger als 5%, besonders vorzugsweise weniger als 2%, besonders vorzugsweise weniger als 1%, besonders vorzugsweise weniger als 0,5% der zu Beginn dieses Durchlaufs vorhandenen Exemplare der Nukleinsäure. Diese Ausführungsweise der Erfindung nutzt aus, dass sich insbesondere bei besonders geringen Zugewinnen dennoch bei entsprechender Wahl der Dauer eines Zyklus eine besonders vorteilhaft kurze Prozessdauer erreichen lässt.

Vorzugsweise ist die Einwirkdauer t _A bei wenigstens einem der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bei wenigstens 10, besonders vorzugsweise bei wenigstens 20, besonders vorzugsweise bei wenigstens 40, besonders vorzugsweise bei wenigstens 80, besonders vorzugsweise bei wenigstens 160 Durchläufen des Zyklus - kürzer als 10 s, besonders vorzugsweise kürzer als 5 s, besonders vorzugsweise kürzer als 3 s, besonders vorzugsweise kürzer als 1 s, besonders vorzugsweise kürzer als 500 ms (Millisekunden), besonders vorzugsweise kürzer als 250 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 100 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 50 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 25 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 10 ms und ganz besonders vorzugsweise kürzer als 8 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 3 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 1 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 500 με, besonders vorzugsweise kürzer als 300 με, besonders vorzugsweise kürzer als 100 μβ, besonders vorzugsweise kürzer als 50 μβ, besonders vorzugsweise kürzer als 30 μβ, besonders vorzugsweise kürzer als 10 μβ. Diese Ausführungsweise der Erfindung nutzt aus, dass sich insbesondere durch eine besonders kurze Einwirkdauer t _A eine besonders vorteilhaft kurze Prozessdauer erreichen lässt.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung beträgt der Zugewinn g an Exemplaren einer zu vervielfältigen Nukleinsäure am Ende wenigstens eines der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung am Ende jedes von 10, besonders

vorzugsweise jedes von 20, besonders vorzugsweise jedes von 40, besonders vorzugsweise jedes von 80, besonders jedes von 160 Durchläufen des Zyklus - weniger als 80%, weniger als 70%, weniger als 60%, weniger als 50%, weniger als 40%, weniger als 30%, besonders vorzugsweise weniger als 20% bzw. 10%, besonders vorzugsweise weniger als 5%, besonders vorzugsweise weniger als 1 % der zu Beginn dieses Durchlaufs vorhandenen Exemplare der Nukleinsäure, und gleichzeitig ist bei diesem Durchlauf oder diesen

Durchläufen des Zyklus die Einwirkdauer t _A kürzer als 5 Sekunden, besonders vorzugsweise kürzer als 3s, besonders vorzugsweise kürzer als 1s, besonders vorzugsweise kürzer als 250 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 50 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 10 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 3 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 1 ms, besonders vorzugsweise kürzer als 300 μβ, besonders vorzugsweise kürzer als 100 με, besonders vorzugsweise kürzer als 30 μβ, besonders vorzugsweise kürzer als 10 μβ. Diese Ausführungsweise der Erfindung nutzt aus, dass sich besonders vorteilhaft kurze

Prozessdauer insbesondere dann erreichen lassen, wenn ein besonders geringer Zugewinn mit einer besonders kurzen Einwirkdauer einhergeht.

Vorzugsweise beträgt der Zugewinn g an Exemplaren einer zu vervielfältigen Nukleinsäure am Ende wenigstens eines der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung am Ende jedes von 10, besonders vorzugsweise jedes von 20, besonders vorzugsweise jedes von 40, besonders vorzugsweise jedes von 80, besonders vorzugsweise jedes von 160 Durchläufen des Zyklus - mehr als 0,1%, besonders vorzugsweise mehr als 1%, besonders vorzugsweise mehr als 10% der zu Beginn dieses Durchlaufs vorhandenen Exemplare der Nukleinsäure. Diese Ausführungsweise der Erfindung nutzt aus, dass ein nicht zu geringer Zugewinn pro Durchlauf die Wahrscheinlichkeit von Fehlern bei der Vervielfältigung senken und damit ein zuverlässigeres Vervielfältigungsergebnis sicherstellen kann.

Vorzugsweise ist die Einwirkdauer t _A bei wenigstens einem der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bei wenigstens 10, besonders vorzugsweise bei wenigstens 20, besonders vorzugsweise bei wenigstens 40, besonders vorzugsweise bei wenigstens 80, besonders vorzugsweise bei wenigstens 160 Durchläufen des Zyklus - länger als 1 ps, besonders vorzugsweise länger als 30 ps, besonders vorzugsweise länger als 100 ps, besonders vorzugsweise länger als 300 ps, besonders vorzugsweise länger als 1 ns, besonders vorzugsweise länger als 10 ns, besonders vorzugsweise länger als 100 ns, besonders vorzugsweise länger als 300 ns, besonders vorzugsweise länger als 1 με, besonders vorzugsweise länger als 3 με, besonders vorzugsweise länger als 10 β.

Durch eine angemessene Einwirkdauer kann vorteilhafterweise eine zuverlässigere

Denaturierung erreicht werden, ins besondere da die Entwindung eines DNA- Doppelstranges und eine ausreichende Vergrößerung des Abstandes der beiden Stränge durch Diffusion (zur Vermeidung einer Rehybridisierung), die Aufrechterhaltung einer ausreichend hohen Temperatur für eine gewisse Zeitdauer erfordern können.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung beträgt der Zugewinn g an Exemplaren einer zu vervielfältigen Nukleinsäure am Ende wenigstens eines der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung am Ende jedes von 10, besonders vorzugsweise jedes von 20, besonders vorzugsweise jedes von 40, besonders vorzugsweise jedes von 80, besonders jedes von 160 Durchläufen des Zyklus - mehr als 0,1%, besonders vorzugsweise mehr als 1%, besonders vorzugsweise mehr als 10% der zu Beginn dieses Durchlaufs vorhandenen Exemplare der Nukleinsäure, und gleichzeitig ist bei diesem Durchlauf oder diesen Durchläufen des Zyklus die Einwirkdauer t _A länger als 1 ps, besonders vorzugsweise länger als 30 ps, besonders vorzugsweise länger als 300 ps, besonders vorzugsweise länger als 1ns, besonders vorzugsweise länger als 10 ns, besonders vorzugsweise länger als 100 ns, besonders vorzugsweise länger als 300 ns, besonders vorzugsweise länger als 1 μβ, besonders vorzugsweise länger als 3 με, besonders vorzugsweise länger als 10 με, besonders vorzugsweise länger als 30 με, besonders vorzugsweise länger als 100 μβ, besonders vorzugsweise länger als 300 με, besonders vorzugsweise länger als 1 ms, besonders vorzugsweise länger als 3 ms und ganz besonders vorzugsweise länger als 5 ms. Diese Ausführungsweise der Erfindung nutzt aus, dass ein besonders zuverlässigeres Vervielfältigungsergebnis dann erreicht werden kann, wenn ein nicht zu geringer Zugewinn mit einer ausreichend langen Einwirkdauer einhergeht.

Das Produkt g ^■ t _c aus dem Zugewinn g und der Zyklendauer t _c bezeichnen wir als charakteristische Superamplfikations-Zeitkonstante. Diese charakteristische

Superamplfikations-Zeitkonstante beträgt Vorzugsweise am Ende wenigstens eines der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung am Ende jedes von 10, besonders vorzugsweise jedes von 20, besonders vorzugsweise jedes von 40, besonders vorzugsweise jedes von 80, besonders vorzugsweise jedes von 160 Durchläufen des Zyklus - weniger als 20s, besonders vorzugsweise weniger als 15s, besonders vorzugsweise weniger als 12s, besonders vorzugsweise weniger als 10s, besonders vorzugsweise weniger als 8s, besonders vorzugsweise weniger als 6s, besonders vorzugsweise weniger als 4s, besonders vorzugsweise weniger als 2s. Es ist ein

erreichbarer Vorteil solcher Ausführungsformen der Erfindung, dass das PCR Protokoll verkürzt wird. Der Erfindung liegt insofern die Idee zu Grunde, dass kürzere Zyklendauern zwar zu einem geringeren Zuwachs je Zyklus führen, dies jedoch bei verkürzter Dauer des Gesamtprotokolls durch Hinzufügen von zusätzlichen Zyklen überkompensiert werden kann.

Erfindungsgemäß wird eine Zyklendauer t _c - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung jedes von 10, besonders vorzugsweise jedes von 20, besonders vorzugsweise jedes von 40, besonders vorzugsweise jedes von 80, besonders vorzugsweise jedes von 160 Durchläufen des Zyklus - gewählt, die um den Zyklenverkürzungsfaktor x gegenüber der Zyklendauer t _{C h} einer ansonsten identisch durchgeführten Referenz-PCR verkürzt ist (— = t _c ). Dabei ist die Referenz-PCR-Reaktion insbesondere identisch in Bezug auf die bio-chemische

Zusammensetzung, der Einhaltung der identischen Annealing-, Elongations- und

Denatunerungstemperatur und vor allem bezüglich der zu amplifizierenden Ziel-Nukleinsäure und speziell ihrer Sequenz, Konzentration und Vorbehandlung; allein ist bei der Referenz- PCR die Zyklendauer länger und die Zyklenzahl kann gegebenenfalls höher sein. Dies führt erfindungsgemäß zu einem Zugewinns je Zyklus g, der im Vergleich zum Zugewinn je Zyklus der ansonsten identisch durchgeführten Referenz-PCR g _h um den Effizienzverlust- Faktor y reduziert ist ( = g). In einer Ausführungsform gilt x>0,9y, besonders

vorzugsweise x=y, besonders vorzugsweise x>y, besonders vorzugsweise x>1 ,1y, besonders vorzugsweise x>1 ,2y, besonders vorzugsweise x>1 ,3y, besonders vorzugsweise x>1 ,5y, besonders vorzugsweise x>2y, besonders vorzugsweise x>2,5y, besonders vorzugsweise x>3 y, besonders vorzugsweise x>5y,wobei zugleich vorzugsweise gilt x >1 ,2, besonders vorzugsweise x>1 ,5, besonders vorzugsweise x>2, besonders vorzugsweise x>2,5, besonders vorzugsweise x>3, besonders vorzugsweise x>4, besonders vorzugsweise x>5, besonders vorzugsweise x>10.

Hierdurch lässt sich erreichen, dass der„Zinseszinseffekt" der durch x mal mehr Zyklen pro Zeiteinheit ermöglicht wird, den Effizienzverlust (d.h. den um den Faktor y reduzierten Zugewinn je Zyklus) in der erfindungsgemäßen PCR mehr als kompensiert, d.h. dass erfindungsgemäß mehr Amplikon während einer gleichlangen oder sogar kürzeren PCR entstehen kann.

Dabei werden in der erfindungsgemäßen PCR vorzugsweise mehr Zyklen durchlaufen als bei der Referenz-PCR, wobei die erfindungsgemäße PCR vorzugsweise x mal mehr Zyklen durchläuft (x ist der Zyklenverkürzungsfaktor), besonders vorzugsweise 0,9x mal mehr, besonders vorzugsweise 0,8x mal mehr, besonders vorzugsweise 0,6x mal mehr, besonders vorzugsweise 0,4x mal mehr, besonders vorzugsweise 0,2x mal mehr Zyklen, und ganz besonders vorzugsweise 0,1x mal mehr Zyklen. Hierdurch lässt sich erreichen, dass die Dauer des Protokolls kürzer wird als bei der Referenz-PCR, da die Zyklendauer um den Zyklenverkürzungsfaktor x verkürzt ist, aber die Zahl der erforderlichen Zyklen und somit die Dauer des Gesamtprotokolls nicht im gleichen Maße zunimmt.

In einer Ausführungsform beträgt der Zyklenverkürzungsfaktor der erfindungsgemäßen PCR gegenüber der Referenz-PCR vorzugsweise mindestens x>1 ,2, besonders vorzugsweise mindestens x>1 ,5, besonders vorzugsweise mindestens x>2, besonders vorzugsweise mindestens x>3, besonders vorzugsweise mindestens x>4, besonders vorzugsweise mindestens x>5, und ganz besonders vorzugsweise mindestens x>10. Hierdurch kann erreicht werden, dass ein starker„Zinseszins-Effekt" oder Superamplifikations-Effekt auftritt.

Die Erfindungsgemäße Lösung setzt voraus, dass die PCR noch keinen Sättigungszustand erreicht hat, wie er z.B. durch den Verbrauch der begrenzenden Reaktanten (z.B. der Primer oder dNTPs) auftreten kann, da solche Sättigungseffekte zu einer Abnahme des Zugewinns je Zyklus im Verlauf der PCR führen können. Daher sieht eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung vor, dass die Konzentration des begrenzenden Reaktanten seit Beginn der PCR um weniger als 80% abgenommen hat, besonders vorzugsweise um weniger als 50%, besonders vorzugsweise um weniger als 25%, besonders vorzugsweise um weniger als 10%, besonders vorzugsweise um weniger als 5%, besonders vorzugsweise um weniger als 1%, besonders vorzugsweise um weniger als 0.1%.

Die Vermeidung von Sättigungseffekten kann auch dadurch sichergestellt werden, dass der Zugewinn je Zyklus vorzugsweise weitgehend konstant über den Verlauf der PCR ist - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung am Ende jedes von 10, besonders

vorzugsweise jedes von 20, besonders vorzugsweise jedes von 40, besonders vorzugsweise jedes von 80, besonders vorzugsweise jedes von 160 Durchläufen des Zyklus, vorzugsweise mindestens noch 95%, besonders vorzugsweise 90%, besonders vorzugsweise 80%, besonders vorzugsweise 70%, besonders vorzugsweise 50%, besonders vorzugsweise 20%, besonders vorzugsweise 10%, des Zugewinns desjenigen Zyklus beträgt, der den höchsten Zugewinn während der PCR hatte (typischerweise der 1. Zyklus).

Solche Sättigungseffekte können auch vermieden werden, indem die Erfindungsgemäße Lösung auf die vorzugsweise ersten 80%, besonders vorzugsweise ersten 50%, besonders vorzugsweise ersten 25%, besonders vorzugsweise ersten 10% aller in einer PCR durchzuführenden Durchläufe des Zyklus beschränkt wird.

Es ist bevorzugt, dass die Anzahl k der Durchläufe des Zyklus größer als 45, besonders vorzugsweise größer als 50, besonders vorzugsweise größer als 60 , besonders

vorzugsweise größer als 70, besonders vorzugsweise größer als 80, besonders

vorzugsweise größer als 90, besonders vorzugsweise größer als 100, besonders

vorzugsweise größer als 120, besonders vorzugsweise größer als 160 und ganz besonders vorzugsweise größer als 200 ist. Dabei wird ausgenutzt, dass der positive Effekt einer Verkürzung der Dauer der einzelnen Durchläufe sich insbesondere dann bemerkbar macht, wenn die Anzahl der Durchläufe groß ist. Vorzugsweise ist die Anzahl k der Durchläufe des Zyklus kleiner als 1000, besonders vorzugsweise kleiner als 750 und ganz besonders vorzugsweise kleiner als 500. Hierbei wird ausgenutzt, dass sich eine nicht zu hohe Zahl von Durchläufen positiv aus die

Zuverlässigkeit des Vervielfältigungsergebnisses auswirken kann.

Die Abkürzungen„M",„mM", ,,μΜ",„n ",„pM" und„fM" stehen im Folgenden für die

Einheiten mol/l, mmol/l, μηηοΙ/Ι, nmol/l, pmol/l bzw. fmol/l.

Die Konzentration des Amplikons, das vervielfältigt werden soll, ist zu Beginn des Verfahrens vorzugsweise größer als Null, vorzugsweise größer als 10 ^"23 M (mol/l), besonders

vorzugsweise größer als 10 ^"21 M, besonders vorzugsweise größer als 10 ^"20 M, besonders vorzugsweise größer als 10 ^"19 M. Durch diese Ausführung der Erfindung kann vorteilhaft erreicht werden, dass die Vervielfältigung ausreichend sensitiv ist, um eine zum Nachweis geeignete Menge von Vervielfältigungsprodukten herzustellen.

Die Konzentration des Amplikons, das in der PCR vervielfältigt werden soll, ist vorzugsweise kleiner als 1 nM, besonders vorzugsweise kleiner als 30pM, besonders vorzugsweise kleiner 1pM, besonders vorzugsweise kleiner als 0,1 pM, besonders vorzugsweise kleiner als 10fM, besonders vorzugsweise kleiner 1fM, besonders vorzugsweise kleiner 0,1fM. Durch diese Ausführung des Verfahrens kann vorteilhaft verhindert werden, dass die Vervielfältigung bereits vor ihrem Ende eine Sättigung erreicht.

Vorzugsweise ist die Anzahl der Amplikons , die in dem Verfahren vervielfältigt werden sollen, zu des Beginn des Verfahrens kleiner als 500 000, besonders vorzugsweise kleiner als 200 000, besonders vorzugsweise kleiner als 100 000, besonders vorzugsweise kleiner als 10 000. Durch diese Ausführung der Erfindung kann vorteilhaft verhindert werden, dass die Vervielfältigung bereits vor Ihrem Ende eine Sättigung erreicht.

Ein wichtiger Parameter der Erfindung kann die Gesamtdauer t ₀ eines Durchlaufs des Zyklus sein, also die Zyklusdauer. Insbesondere kann es gelingen trotz einer langen Einwirkdauer t _A durch Zeiteinsparungen an anderer Stelle, z.B. eine kurze Annealingdauer aufgrund einer hohen Primerkonzentration in der Probe oder eine kurze Elongationszeit mithilfe einer schnellen DNA-Polymerase zu einer vorteilhaft kurzen Zyklusdauer zu gelangen.

Vorzugsweise ist die Zyklusdauer t _c bei wenigstens einem der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bei wenigstens 10, besonders vorzugsweise bei wenigstens 20, besonders vorzugsweise bei wenigstens 40, besonders vorzugsweise bei wenigstens 80, besonders vorzugsweise bei wenigstens 160 Durchläufen des Zyklus - kürzer als 40 s, besonders vorzugsweise kürzer als 30 s, besonders vorzugsweise kürzer als 20 s, besonders vorzugsweise kürzer als 15 s, besonders vorzugsweise kürzer als 12,5 s, besonders vorzugsweise kürzer als 10 s, besonders vorzugsweise kürzer als 7,5 s, besonders kürzer als 5 s, besonders vorzugsweise kürzer als 4 s, besonders vorzugsweise kürzer als 3 s, besonders vorzugsweise kürzer als 2 s und ganz besonders vorzugsweise kürzer als 1 s.

Andererseits kann ein zu schneller Durchlauf des Zyklus zu Lasten der Zuverlässigkeit des Vervielfältigungsergebnisses gehen. Deshalb ist in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung vorzugsweise die Zyklusdauer t _c bei wenigstens einem der Durchläufe des Zyklus

- in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bei wenigstens 10, besonders

vorzugsweise bei wenigstens 20, besonders vorzugsweise bei wenigstens 40, besonders vorzugsweise bei wenigstens 80, besonders vorzugsweise bei wenigstens 160 Durchläufen des Zyklus - länger als 0,5 s, besonders vorzugsweise länger als 1 s, besonders

vorzugsweise länger als 2 s, besonders vorzugsweise länger als 3 s, besonders

vorzugsweise länger als 4 s, besonders vorzugsweise länger als 5 s.

Das erfindungsgemäße Verfahren lässt sich insbesondere bei größeren Probenvolumina vorteilhaft einsetzen, unter anderem, weil dort aus Gründen der Statistik mit größerer Zuverlässigkeit auch bei kurzen Zykluszeiten noch eine ausreichende Anzahl korrekter Duplikate entstehen. Vorzugsweise beträgt bei wenigstens einem der Durchläufe des Zyklus

- in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bei wenigstens 10, besonders

vorzugsweise bei wenigstens 20, besonders vorzugsweise bei wenigstens 40, besonders vorzugsweise bei wenigstens 80, besonders vorzugsweise bei wenigstens 160 Durchläufen des Zyklus - der Quotient ^ aus der Einwirkdauer t _A und dem von der Energiequelle bestrahlten Reaktionsvolumens V _r weniger als 1 s/μΙ (Sekunden pro Mikroliter), d.h. < 1 s/μΙ, besonders vorzugsweise weniger als 0,1 s/μΙ, besonders vorzugsweise weniger als 0,01 s/μΙ und ganz besonders vorzugsweise weniger als 0,001 s/μΙ.

Andererseits kann es unter anderem für die Handhabbarkeit des Verfahrens vorteilhaft sein, wenn bei wenigstens einem der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bei wenigstens 10, besonders vorzugsweise bei wenigstens 20, besonders vorzugsweise bei wenigstens 40, besonders vorzugsweise bei wenigstens 80, besonders vorzugsweise bei wenigstens 160 Durchläufen des Zyklus - der Quotient t _A /V _r aus der Einwirkdauer t _A und dem von der Energiequelle bestrahlten Reaktionsvolumens V _r größer als 1 ps/μΙ, besonders vorzugsweise größer als 10 ps/μΙ, besonders vorzugsweise größer als 100 ps/μΙ, besonders vorzugsweise größer als 1 ns/μΙ, besonders vorzugsweise größer als 10 ns/μΙ und ganz besonders vorzugsweise größer als 100 ns/μΙ ist.

Die Energiequelle, die vorzugsweise eine globale und besonders vorzugsweise eine lokale Erwärmung im Reaktionsvolumen hervorruft, ist bei einem bevorzugten Verfahren eine elektromagnetische Strahlenquelle, besonders vorzugsweise eine Lichtquelle. Eine bevorzugte Lichtquelle gibt Licht zum Erwärmen des Reaktionsvolumens vorzugsweise im Spektralbereich 200-2000nm ab, besonders bevorzugt im Bereich 300-1600nm, besonders bevorzugt im Bereich 300-1100nm und ganz besonders bevorzugt im Bereich 400-800nm ab.. Ganz besonders vorzugsweise ist die Energiequelle ein Laser, z.B. ein kontinuierlicher oder quasikontinuierlicher Dioden- oder Festkörperlaser oder ein Nanosekundenlaser.

Die Erfindung ist besonders gut geeignet für die Vervielfältigung von Nukleinsäuren , die kürzer sind als 2000 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 1000 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 300 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 200 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 150 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 100 Basen, besonders vorzugsweise kürzer als 80 Basen, und ganz besonders vorzugsweise kürzer als 60 Basen. Das zu vervielfältigende Amplikon ist bevorzugt länger als 10 Basen, besonders bevorzugt länger als 30 Basen und ganz besonders bevorzugt länger als 50 Basen. Das erfindungsgemäße Verfahren kann DNA in den genannten Längen besonders effektiv vervielfältigen.

Vorteilhaft kurze Zyklusdauern lassen sich unter anderem durch eine schnelle Elongation erzielen. Vorzugsweise wird eine DNA- Polymerase gewählt und werden die

Reaktionsbedingungen der PCR so eingestellt, dass die DNA-Polymerase eine

Schreibgeschwindigkeit von mindestens 1 Base/s, besonders vorzugsweise von mindestens 5 Basen/s, besonders vorzugsweise mindestens 10 Basen/s, besonders vorzugsweise mindestens 50 Basen/s, besonders vorzugsweise mindestens 100 Basen/s, besonders vorzugsweise mindestens 500 Basen/s und ganz besonders vorzugsweise mindestens 1000 Basen/s aufweist.

In einer bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung übertragen Nanopartikel in einem

Reaktionsvolumen durch Anregung Wärme an ihre Umgebung. Die Nanopartikel sind bevorzugt Partikel, die aufgrund ihrer Größe besondere optische Eigenschaften aufweisen, z.B. charakteristische Absorptions- oder Streuspektren, die so im Volumenmaterial nicht oder nicht so deutlich hervortreten. Die Nanopartikel haben vorzugsweise einen Durchmesser zwischen 2 und 500 nm (Nanometer), besonders vorzugsweise zwischen 3 und 300 nm und ganz besonders vorzugsweise zwischen 5 und 200 nm. Bevorzugte Nanopartikel haben einen Durchmesser zwischen 7 und 150 nm. Die Nanopartikel können sphärisch sein, es kommen aber insbesondere auch nicht-globuläre Formen in Frage, z.B. elongierte

Nanopartikel (Nanorods). In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung umfasst der Nanopartikel mindestens einen Halbleiter oder ein Metall, vorzugsweise ein Edelmetall, z.B. Gold oder Silber. In einer Ausführung besteht der Nanopartikel vollständig aus dem Metall, in einer anderen bildet das Metall nur einen Teil des Nanopartikels, z.B. seine Hülle. Ein bevorzugter Nanopartikel kann ein Schale-Kern-Nanopartikel sein. Ein bevorzugter

Nanopartikel kann an seiner Oberfläche Poren besitzen, die von Atomen oder Molekülen mit einer durch die Eigenschaften der Poren bestimmten Größe und Ladung besetzt werden können, besonders vorzugsweise lagern sich diese Atome oder Moleküle erst dann an den Nanopartikel an, wenn dieser sich in einer Lösung befindet. Der Nanopartikel umfasst auch die an seiner Oberfläche angelagerten Atome und Moleküle. Bevorzugte Nanopartikel eignen sich aufgrund ihrer Materialabsorption oder Plasmonenresonanz dazu, optische Energie zu absorbieren.

Die Aufheizzeit ist die Zeit, die vergeht nachdem die Anregungsintensität l(t) der Lichtquelle im jeweils angeregten Volumen ihren Maximalwert erreicht hat, bis sich an jedem Punkt im angeregten Volumen eine Temperatur einstellt, die sich auch bei Verdoppelung der

Einwirkdauer um maximal 3°C ändert.

Die Abkühlzeit ist die Zeitdauer nach dem Abschaltzeitpunkt der anregenden Lichtquelle, die vergeht bis sich an jedem Punkt im betrachteten Volumen eine Temperatur einstellt, die um maximal 3°C von der Temperatur vor der Einwirkung abweicht.

Der Abschaltzeitpunkt t _off der anregenden Lichtquelle wird definiert als der Zeitpunkt, an dem die Anregungsintensität / im betrachteten Volumen auf weniger als 5% der maximalen Anregungsintensität zurückgegangen ist (z.B. nach dem Puls eines Lasers).

Bestimmung der Aufheiz- und Abkühlzeit: Die zeitliche Temperaturentwicklung im Abstand r vom Zentrum eines Nanopartikels mit Radius rNP erhält man durch numerisches Lösen der Wärmeleitungsgleichung in einer genügend großen Wasserkugel mit Radius rMax um das Nanopartikel, wobei das Nanopartikel selbst aus dem Simulationsbereich heraus genommen wird. Durch Ausnutzen der Kugelsymmetrie ergibt sich eine eindimensionale radiale

Wärmeleitungsgleichung im Bereich rNP bis rMax, t > 0:

± d _r (r ^2■ d _r T r, f ) = d _t T(r, t), wobei T(r,t) die Temperatur an der Stelle r zur Zeit t ist und a die thermische Diffusivität des Wassers bezeichnet (a = 1,43 · 10 ^-7 m ² /s ).

Als Startbedingung setzt man die Temperatur des umgebenden Mediums vor der optischen Anregung auf T ₀ : T(r, 0) = T ₀ .

Die Randbedingungen an den Stellen rNP und rMax werden wie folgt gesetzt: An der Stelle r = rNP erhält man die Steigung des Temperaturverlaufs zum Zeitpunkt t aus der absorbierten Leistung des Nanopartikels zum Zeitpunkt t (Neumann Randbedingung):

d _r T rNP, t) = P(t) / (4 · π · rNP ² · k), wobei P(t) die durch das Nanopartikel aufgenommene Leistung und / die thermische Leitfähigkeit von Wasser (k = 0.6W/(m · ) ) ist. Die absorbierte Leistung berechnet sich aus P(t) = I(t) · σ , mit l(t) der zeitabhängigen

Anregungsintensität der Lichtquelle und dem Absorptionsquerschnitt des Partikels σ. (D.h. I(t) wäre beispielsweise - so lange die Fokusgröße nicht verändert wird - für einen CW-Laser eine Konstante, und für einen gepulsten Laser würde l(t) die zeitabhängige Pulsform wiedergeben).

An der Stelle rMax wird die Temperatur konstant gehalten (T(rMax, t) = T ₀ , Dirichlet Randbedingung). Für rNP < 100nm wählt man zum Beispiel rMax > 10000nm.

Die thermische Diffusivität und thermische Leitfähigkeit des Wasser wird als konstant angenommen. Allgemein gilt a = k/(C ^■ p), mit C der spezifischen Wärmekapazität und p der Dichte von Wasser.

Mittels geeigneter Programme zum numerischen Lösen solcher partieller

Differentialgleichungen (z.B. mit dem Befehl NSolve in Mathematica, etc.) kann dann obige Wämeleitungsgleichung gelöst werden und man erhält Werte für die Temperatur als Funktion des Ortes und der Zeit, T r, t).

Beispielsweise erhält man für ein sphärisches Gold-Nanopartikel mit rNP = 30nm, das mit einer konstanten Intensität von 1 kW/mm ² bei 532nm Wellenlänge für eine Dauer von 100ns angeregt wird für einen Starttemperatur von T ₀ = 30°C folgende Werte: T(r=30nm,t=20ns) = 70°C, T(r=30nm,t=100ns) = 78°C, T(r=30nm,t=120ns) = 36°C,T(r=40nm,t=20ns) = 56°C, T(r=40nm,t=100ns) = 64°C, T(r=40nm,t=120ns) = 36°C.

Zur Ermittlung der erfindungsgemäßen Aufheizzeit wird T(r, t) für verschiedene Zeiten ausgewertet. Die Aufheizzeit ist dann die kürzeste Zeit t _auf für die gilt \T(r, t _auf ) - T r, 2 ^■ t _auf )| < 3°C mit r e [rNP; rMAX], d.h. der Betrag der Differenz der Temperaturverteilung für die Zeitpunkte t _auf und 2t _auf muss für alle Punkte außerhalb des Nanopartikels kleiner 3°C sein.

Die Abkühlzeit ergibt sich als Differenz t _x - t ₀ ff, wobei t _x die kürzeste Zeit ist, für die gilt \T r, t _x ) - T ₀ \ <3°C mit r e [rNP; rMAX] und t _x > t _off .

Bevorzugt ist die Aufheizzeit bei wenigstens einem der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bei wenigstens 10, besonders vorzugsweise bei wenigstens 20, besonders vorzugsweise bei wenigstens 40, besonders vorzugsweise bei wenigstens 80, besonders vorzugsweise bei wenigstens 160 Durchläufen des Zyklus - vorzugsweise mehr als 1 Nanosekunden, besonders vorzugsweise mehr als 5

Nanosekunden, besonders vorzugsweise mehr als 10 Nanosekunden und vorzugsweise weniger als 100 Millisekunden, besonders vorzugsweise weniger als 10 Millisekunden, besonders vorzugsweise weniger als 1 Millisekunde, besonders vorzugsweise weniger als 300 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 100 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 50 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 30 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 10 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 5 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 1 ,5 Mikrosekunden. Durch eine kurze Aufheizzeit kann eine kurze Gesamtdauer des Verfahrens erreicht werden.

Bevorzugt ist die Abkühlzeit bei wenigstens einem der Durchläufe des Zyklus - in einer bevorzugten Ausführung der Erfindung bei wenigstens 10, besonders vorzugsweise bei wenigstens 20, besonders vorzugsweise bei wenigstens 40, besonders vorzugsweise bei wenigstens 80, besonders vorzugsweise bei wenigstens 160 Durchläufen des Zyklus vorzugsweise mehr als 1 Nanosekunden, besonders vorzugsweise mehr als 5

Nanosekunden, besonders vorzugsweise mehr als 10 Nanosekunden und vorzugsweise weniger als 100 Millisekunden, besonders vorzugsweise weniger als 10 Millisekunden, besonders vorzugsweise weniger als 1 Millisekunde, besonders vorzugsweise weniger als 300 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 100 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 50 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 30 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 10 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 5 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 3 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 1 ,5 Mikrosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 1 Mikrosekunde , besonders vorzugsweise weniger als 300 Nanosekunden, besonders vorzugsweise weniger als 100 Nanosekunden. Eine kurze Abkühlzeit kann zu einer beschleunigten PCR beitragen.

Wenn durch Anregung eines Nanopartikels Wärme an seine Umgebung übertragen wird, bedeutet das, dass Energie auf den Nanopartikel übertragen wird, wobei der Nanopartikel durch die Übertragung der Energie seine Umgebung erhitzt. Dabei wird vorzugsweise durch die Anregung der Nanopartikel die unmittelbare Umgebung der Nanopartikel stärker erhitzt als die weitere Umgebung der Nanopartikel. Gewöhnlich werden die Nanopartikel zunächst durch Anregung erhitzt und übertragen dann Wärme an ihre Umgebung. Bevorzugt ist die Umgebung der Nanopartikel ein sphärisches Volumen, das den 100fachen Durchmesser des Nanopartikels hat, der sich in seinem Mittelpunkt befindet, besonders vorzugsweise hat es den ^" lOfachen Durchmesser, ganz besonders vorzugsweise den 4fachen Durchmesser und vorzugsweise weniger als den 2fachen Durchmesser.

Bevorzugt wird durch die Anregung der Nanopartikel die Umgebung der Nanopartikel lokal erhitzt. Besonders schnelle Temperaturänderungen sind möglich, wenn das erhitzte

Volumen nur einen kleinen Bruchteil des Gesamtvolumens ausmacht. Zum einen kann dann schon mit einem kleinen Energie-Eintrag durch Bestrahlung eine hohe Temperaturdifferenz erzeugt werden. Zum anderen ist eine sehr schnelle Abkühlung des erwärmten Volumens möglich, wenn ein ausreichend großes kaltes Temperatur-Reservoir im bestrahlten Volumen vorhanden ist, um nach der Bestrahlung die Nanopartikel und ihre Umgebung wieder abzukühlen. Dies kann dadurch erreicht werden, dass die Nanopartikel hinreichend stark (um den gewünschten Temperaturhub zu erreichen) und hinreichend kurz (damit die Wärme lokalisiert bleibt) bestrahlt werden. Durch eine lokale Erhitzung ist es möglich, die

Polymerasen einer geringeren Hitze auszusetzen, so dass auch PCR-Verfahren mit einer Zyklenzahl über 80 realisiert werden können.

Eine lokale Erhitzung im Sinne der vorliegenden Erfindung liegt dann vor, wenn die Dauer der Anregung im jeweils bestrahlten Volumen (z.B. im Laserfokus) t kürzer oder gleich einer kritischen Anregungsdauer t1 gewählt wird. Hierbei ist vorzugsweise die Anregungsdauer t1 gleich der Einwirkdauer t _a . Hierbei ist t1 durch eine Zeit bestimmt, die die Wärme benötigt, um bei mittlerem Nanopartikelabstand von einem Nanopartikel zum nächsten zu

diffundieren, multipliziert mit einem Skalierungsfaktor s1 , und zwar ist bei einem mittleren Nanopartikelabstand |x| und einer Temperaturleitfähigkeit D des Mediums zwischen den Nanopartikeln t1 geben durch tl = (sl ^■ |x|) ² /D, wobei die Temperaturleitfähigkeit D typischerweise in wässriger Lösung einen Wert von D=10 ^"7 m ² /s hat. Der Skalierungsfaktor s1 ist ein Maß dafür, wie weit sich die Wärmefront eines Partikels während der Anregungsdauer ausbreitet. Die Temperaturerhöhung durch einen angeregten Nanopartikel im Abstand von einigen Nanopartikeldurchmessern ist nur ein sehr kleiner Bruchteil der maximalen Temperaturerhöhung auf der Partikeloberfläche. In einer

Ausführung der Erfindung wird ein Überlapp der Wärmefronten von einigen Nanopartikeln zugelassen in dem Sinne, dass zur Definition der kritischen Anregungsdauer t1 anhand der oben angegebenen Formel ein Skalierungsfaktor s1 größer als 1 verwendet wird. In einer anderen Ausführung der Erfindung wird kein Überlapp der Wärmefronten während der Anregungsdauer zugelassen (entspricht einer stark lokalisierten Erwärmung) in dem Sinne, dass zur Definition der kritischen Anregungsdauer t1 anhand der oben angegebenen Formel ein Skalierungsfaktor s1 kleiner oder gleich 1 verwendet wird. Für die Definition der lokalen Erhitzung ist vorzugsweise s1=100, vorzugsweise s1=30 vorzugsweise s1=10, vorzugsweise s1=7, vorzugsweise s1=3 und ganz besonders vorzugsweise s1=1 , vorzugsweise s1=0,7, vorzugsweise s1=0,3.

Werte für s1>1 können u.a. beispielsweise in solchen Fällen vorteilhaft sein, in denen das bestrahlte Volumen ein hohes Seitenverhältnis aufweist (etwa im Fokus eines moderat fokussierten Laserstrahls), so dass sich vergleichsweise viele Nanopartikel an der

Oberfläche des bestrahlten Volumens befinden und sich daher weniger beheizte

Nanopartikel in ihrer Umgebung befinden, und ein starker Wärmeabfluss aus dem

bestrahlten Volumen heraus stattfindet, so dass der Erwärmungsbeitrag der weiter entfernten Nachbarn länger vernachlässigbar bleibt.

Das heißt, dass beispielsweise, bei einer Nanopartikelkonzentration von 1 nM, die einen mittleren Nanopartikelabstand von |x|=1 ,2 Mikrometern ergibt, ein lokales Erhitzen vorliegt, sofern die Anregungsdauer weniger als t1=14 Mikrosekunden beträgt (der Skalierungsfaktor ist hier s1 =1 gewählt, D=10 ^"7 m ² /s). Es ist davon auszugehen, dass wenn t > t1 gewählt wird, die Wärme, die von den Nanopartikeln abgegeben wird, durch Diffusion während der Bestrahlung also eine Strecke zurücklegen kann, die größer ist als der mittlere

Nanopartikelabstand, dies im Ergebnis zu einer Überlagerung der Wärmefronten vieler Nanopartikel führt, so dass im gesamten Volumen zwischen den Nanopartikeln eine

Temperaturerhöhung stattfindet; die Temperaturerhöhung dürfte im bestrahlten Volumen räumlich umso homogener werden je länger geheizt wird, da nicht nur die Beiträge der nächsten Nanopartikel sondern auch weiter entfernter Nachbarn in die Temperaturverteilung um ein Nanopartikel herum eingeht. Wenn das Reaktionsvolumen mit einer von den

Nanopartikeln absorbierten Strahlung länger als t1 bestrahlt wird, wird die Erhitzung als global bezeichnet. Ein globales Erhitzen kann z.B. auch dadurch stattfinden, dass das Reaktionsvolumen von außen mit einem Peltier-Element oder einer Widerstandsheizung geheizt wird. Das globale Erhitzen kann auch dadurch erfolgen, dass z.B. das Reaktionsvolumen mit einer Strahlung bestrahlt wird, die von dem Wasser in der Probe stärker als oder ähnlich stark wie von den Nanopartikeln absorbiert wird. Temperaturerhöhung bedeutet hierbei die Differenz zwischen der Temperatur an einem Ort zum Beobachtungszeitpunkt unmittelbar nach der Anregung und der Temperatur am gleichen Ort zum Zeitpunkt unmittelbar vor der Anregung. Globales Erhitzen und lokales Erhitzen kann auch gleichzeitig durchgeführt werden.

Durch die Anregung von Nanopartikeln ist es erreichbar, dass in dem PCR-Verfahren von Nukleinsäuren nicht das ganze Reaktionsvolumen erhitzt werden muss. Es ist hingegen möglich, nur spezifische Teile des Reaktionsvolumens durch Anregung von Nanopartikeln zu erhitzen. So ist es vorteilhafterweise möglich, nur die Teile des Reaktionsvolumens zu erhitzen, die zur Vervielfältigung der Nukleinsäuren erhitzt werden müssen. Auf diese Weise können hitzeempfindliche Bestandteile der Probe geschont werden, so dass eine höhere Zyklenzahl ermöglicht wird. Das lokale Erhitzen kann schneller sein als das globale Erhitzen des ganzen Reaktionsvolumens, wenn weniger Energie übertragen werden muss. Somit ist es durch die Erfindung mit Vorteil möglich, ein PCR-Verfahren bereitzustellen, das schneller ist und weniger Energie benötigt.

Die Anregung der Nanopartikel geschieht vorzugsweise durch ein Wechselfeld, besonders vorzugsweise durch ein elektromagnetisches Wechselfeld, ganz besonders vorzugsweise optisch. Vorzugsweise geschieht die Anregung mit Licht im Bereich vom fernen Infrarot bis zum fernen Ultraviolett (in einem Bereich von 100 nm bis 30 μιη Wellenlänge), besonders vorzugsweise im Bereich vom nahen Infrarot bis zum nahen Ultraviolett (in einem Bereich von 200 nm bis 3 μηη Wellenlänge), ganz besonders bevorzugt durch sichtbares Licht (in einem Bereich von 400 nm bis 800 nm Wellenlänge). Dies kann gegenüber dem

herkömmlichen globalen Erhitzen des Reaktionsgefäßes von außen den Vorteil bieten, dass nicht die thermisch isolierende Wand des Reaktionsgefäßes überwunden werden muss, da die Energie direkt auf die Nanopartikel übertragen wird. So kann eine schnellere Heizung des gewünschten Anteils der Probe erreicht werden.

Besonders vorzugsweise hat das Licht eine Frequenz, die die

Oberflächenplasmonenresonanz der Nanopartikel anregt. Die Lichtquelle kann das Licht gepulst oder kontinuierlich zur Verfügung stellen. Die Lichtquelle kann z.B. ein Gaslaser, ein Diodenlaser oder ein diodengepumpter Festkörperlaser sein. Die Anregungsdauer, während der die Nanopartikel im jeweils bestrahlten Volumen je Zyklus optisch angeregt werden, beträgt vorzugsweise mehr als 1 Picosekunde, besonders vorzugsweise mehr als 30 Picosekunden bzw. 100 Picosekunden, ganz besonders bevorzugt länger als 1 Nanosekunde bzw. 10 Nanosekunden. Gleichzeitig beträgt die Einwirkdauer vorzugsweise weniger als 100 ms, besonders vorzugsweise weniger als 10 ms, besonders vorzugsweise weniger alsl ms, besonders vorzugsweise weniger als 500 μβ, besonders vorzugsweise weniger als100 μβ, besonders vorzugsweise weniger als 50 μβ und ganz besonders vorzugsweise weniger als10 με.βοίβΓη die Anregung der Denaturierung dient, entspricht die Anregungsdauer vorzugsweise der Einwirkdauer t _A .

Bevorzugt ist die Anregungsdauer kürzer als es im Mittel dauert, bis die Wärme, die in der Umgebung der Nanopartikeln entsteht, den mittleren Teilchenabstand diffundiert, so dass im Mittel kein signifikanter Überlapp der Wärmefronten benachbarter Teilchen stattfindet.

Besonders vorzugsweise ist das Zeitintervall der Anregung so gewählt, dass die durch die Bestrahlung hervorgerufene Temperaturerhöhung um jeden bestrahlten Nanopartikel herum im Mittel in einer Entfernung von 20 Nanopartikeldurchmessern, besonders vorzugsweise 2 Nanopartikeldurchmessern, ganz besonders vorzugsweise 1 Nanopartikeldurchmesser, auf weniger als die Hälfte seines Maximums abfällt. In einer Ausführung ist eine möglichst kurze Bestrahlungsdauer pro Volumen bevorzugt, so dass ein dehybridisierter DNA-Einzelstrang während des Denaturierens nur weniger als 100 nm, besonders vorzugsweise weniger als 20 nm, besonders vorzugsweise weniger als 10 nm, besonders vorzugsweise weniger als 5 nm, vom Nanopartikel weg diffundieren kann. Dadurch ist die Wahrscheinlichkeit hoch, dass der dehybridisierte DNA-Einzelstrang an ein Oligonukleotid auf demselben Nanopartikel bindet. Dies kann ein beschleunigtes erfindungsgemäßes Verfahren ermöglichen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Konzentration der mit Primern konjugierten

Nanopartikel kleiner als 10 nM, dabei beträgt das Zeitintervall der Anregung vorzugsweise zwischen 1 ns und 10 μβ, besonders vorzugsweise zwischen 10 ns und 1 με und ganz besonders vorzugsweise zwischen 15 ns und 300 ns. Das Zeitintervall der Anregung wird vorzugsweise nicht wesentlich kleiner als 1 ns gewählt, da sonst die Zeit der Erwärmung des DNA-Doppelstranges nicht dazu ausreicht, dass die beiden enthaltenen Einzelstränge sich durch Diffusion ausreichend voneinander trennen können, so dass sie nicht sofort wieder miteinander hybridisieren. Sofern das Zeitintervall der Anregung der Denaturierung dient, entspricht es vorzugsweise t _A .

Der Tastgrad ist das Verhältnis von Einwirkdauer zur Dauer eines PCR-Zyklus t _c . Der Tastgrad wird vorzugsweise so groß gewählt, dass die Anregung zu einem ausreichenden Denaturieren der DNA-Doppelstränge durch lokales Erhitzen führt. Zugleich wird der Tastgrad vorzugsweise so gewählt, dass die mittlere Temperaturerhöhung der gesamten Probe ausreichend klein gehalten wird, so dass keine störenden Einflüsse auf

Hybridisierung, Elongation und Denaturieren auftreten. Vorzugsweise beträgt der Tastgrad für das bestrahlte Volumen weniger als 50%, besonders vorzugsweise weniger als 20% und ganz besonders vorzugsweise weniger als 1%. Der Tastgrad beträgt im bestrahlten Volumen geeigneterweise mehr als 10 ^"12 , vorzugsweise mehr als 10 ^"10 , besonders vorzugsweise mehr als 10 ^"9 und ganz besonders vorzugsweise mehr als 10 ^"8 .

Im Sinne der vorliegenden Erfindung ist die Leistungsdichte die optische Leistung pro Fläche des in die Probe einfallenden Lichts; sofern es sich um eine gepulste Lichtquelle handelt, ist die Spitzenleistung maßgeblich. Die Leistungsdichte, mit der die Nanopartikel angeregt werden beträgt vorzugsweise bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40

Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus mehr als 10 W/mm ² ', besonders vorzugsweise mehr als 50 W/mm ² , besonders vorzugsweise mehr als 100 W/mm ² , besonders vorzugsweise mehr als 200 W/mm ² , besonders vorzugsweise mehr als 300 W/mm ² und ganz besonders vorzugsweise mehr als 400 W/mm ² . Mit dieser Ausführung der Erfindung ist vorteilhafterweise erreichbar, dass die Nanopartikel durch die Anregung ausreichend erwärmt werden.

Die Leistungsdichte, mit der die Nanopartikel angeregt werden, beträgt vorzugsweise bei mindestens einem Durchlauf des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 10 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 20 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 40 Durchläufen des Zyklus, besonders vorzugsweise bei mindestens 80 Durchläufen des Zyklus und ganz besonders vorzugsweise bei mindestens 160 Durchläufen des Zyklus weniger als 20.000 kW/mm ² , vorzugsweise weniger als 10.000 kW/mm ² ', besonders vorzugsweise weniger als 5.000 kW/mm ² , besonders vorzugsweise weniger als 3.000 kW/mm ² , besonders vorzugsweise weniger als 1.OOOW/mm ² , besonders vorzugsweise weniger als 500kW/mm ² , besonders vorzugsweise weniger als 300kW/mm ² , besonders vorzugsweise weniger als 150kW/mm ² und ganz besonders vorzugsweise weniger als 80kW/mm ² . Mit dieser Ausführung der Erfindung kann vorteilhafterweise einer Beschädigung der Nanopartikel oder der daran gebundenen DNA entgegengewirkt oder diese verhindert werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Energie der anregenden Strahlung durch die Materialabsorption der Nanopartikel auf diese übertragen. Das Licht, das zur Anregung der Nanopartikel verwendet wird, kann auch z.B. von einem thermischen Strahler, z.B. einer Blitzlampe stammen. In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung, werden die Nanopartikel durch ein elektromagnetisches Wechselfeld oder elektromagnetische Wellen angeregt, die Wirbelströme in den Nanopartikeln erzeugen. Es ist bei geeigneter Gestaltung der Nanopartikel auch möglich, die Nanopartikel mit Ultraschall anzuregen.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Nanopartikel mit Oligonukleotiden konjugiert. Die Nanopartikel bilden in dieser Weise Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate. Damit kann mit Vorteil erreicht werden, dass Oligonukleotide, die Teile des

erfindungsgemäßen Verfahrens sind, durch Anregung der Nanopartikel spezifisch erhitzt werden, ohne dass das ganze Reaktionsvolumen erhitzt werden muss. In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die Nanopartikel mit Primern konjugiert. Ganz besonders vorzugsweise sind die Nanopartikel mit den Vorwärts- und Rückwärtsprimern des PCR- Verfahrens konjugiert. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind auf einer Sorte von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten Vorwärtsprimer, jedoch keine Rückwärtsprimer und auf einer anderen Sorte Rückwärtsprimer, jedoch keine Vorwärtsprimer angebracht.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist eine Sorte von Konjugaten aus Nanopartikeln und Oligonukleotiden sowohl mit Vorwärts- als auch Rückwärtsprimern konjugiert. In dieser Ausführung wird in dem PCR-Verfahren ausgehend von dem Vorwärtsprimer auf einem Nanopartikel ein zu dem Original komplementärer neuer DNA-Einzelstrang geschrieben. Dieser neue DNA-Einzelstrang ist mit dem Nanopartikel konjugiert, da der neue DNA- Einzelstrang den Vorwärtsprimer enthält. Unmittelbar nach dem Schreiben bildet der neue DNA-Einzelstrang mit dem Original einen Doppelstrang. In einem darauffolgenden

Denaturieren wird der neue DNA-Einzelstrang vom Original getrennt. Bei einer

Annealingtemperatur hybridisiert der neue DNA-Einzelstrang mit einem Rückwärtsprimer, der sich auf der Oberfläche des Nanopartikels befindet, so dass eine Schleife entsteht. Für das Hybridisieren mit dem Rückwärtsprimer desselben Nanopartikels muss nur ein kurzer Weg zurückgelegt werden. Für das Hybridisieren mit einem Rückwärtsprimer auf einem anderen Nanopartikel muss bei bevorzugten Konzentrationen von Nanopartikeln im Mittel ein längerer Weg zurückgelegt werden. Somit ist es in dieser Ausführungsform mit Vorteil erreichbar, dass das Annealing schneller stattfindet und das PCR-Verfahren schneller durchlaufen werden kann. In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind die Nanopartikel so mit den Oligonukleotiden verbunden, dass kovalente Bindungen mit mehr als einem Thiol zwischen Oligonukleotiden und Nanopartikeln vorhanden sind. PCR-Puffer enthalten in der Regel Dithiothreitol, das die Thiolbindung zwischen Gold-Nanopartikel und einem Oligonukleotid destabilisiert und das insbesondere bei thermischer Belastung, wie z.B. während des Denaturierens, dazu führen kann, dass sich Oligonukleotide von den Nanopartikeln lösen. Kovalente Bindungen mit mehr als einem Thiol zwischen Primern und Nanopartikeln können das Ablösend der Primer verringern und so die Effizienz des PCR-Verfahrens erhöhen.

In einer bevorzugten Ausführung werden Gegensequenzen eingesetzt, die sich mit solchen Oligonukleotiden verbinden können, die sich von den Nanopartikeln, mit denen sie zuvor verbunden waren, gelöst haben. Gegensequenzen sind Oligonukleotide. Es kann in dem Verfahren vorkommen, dass sich Oligonukleotide, die mit Nanopartikeln konjugiert sind, von diesen ablösen und damit frei werden. In dem Fall, dass diese freien Oligonukleotide die erfindungsgemäßen Primer sind, können diese freien Primer an das Original oder

Komplement binden. Da die freien Primer jedoch nicht an Nanopartikel gebunden sind, können die freien Primer nicht durch Anregung der Nanopartikel von dem Original beziehungsweise Komplement dehybridisiert werden. Dadurch sinkt die Effizienz und Sensitivität des Verfahrens. Die Gegensequenzen sind zumindest teilweise komplementär zu den freien Oligonukleotiden und binden an diese mit ausreichender Affinität, so dass die Funktion der freien Oligonukleotide beschränkt wird. Dadurch kann die Effizienz und

Sensitivität des Verfahrens gesteigert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführung des Verfahrens werden bereits vor der Zugabe des Originals zur Probe Gegensequenzen in einer ausreichenden Menge zur Probe gegeben, um die freien Primer zu blockieren.

Zugleich ist die Menge klein genug, dass sich auf den Nanopartikeln noch eine ausreichend große Zahl an nicht blockierten Primern befindet. Dies ist möglich, wenn die Zahl der Primer auf den Nanopartikeln die Zahl der freien Primer übersteigt.

In einer bevorzugten Ausführung sind auf den Nanopartikeln Füllmoleküle aufgebracht. Die Füllmoleküle verhindern die unerwünschte Aggregation der Nanopartikel in der Probe. Damit dienen die Füllmoleküle mit Vorteil der Stabilisierung der Nanopartikel. Durch die

Füllmoleküle kann die Ladung der Nanopartikel moduliert werden. Dadurch kann die

Salzkonzentration, die sich in der Umgebung der Nanopartikel befindet so angepasst werden, dass die DNA-Polymerase möglichst schnell synthetisieren kann und das Verfahren mit Vorteil schnell durchgeführt werden kann. Die Füllmoleküle können aus Oligonukleotiden bestehen, die jedoch keine Primer sind und bevorzugt kürzer als die Primer sind. Die Füllmoleküle können auch z.B. aus Polymeren, wie z.B. Polyethylenglykol bestehen. Die Füllmoleküle erlauben es in einer bevorzugten Ausführungsform, die Anzahl der Primer auf den Nanopartikeln zu verringern und stattdessen mehr Füllsequenzen zu verwenden, ohne dass wesentliche Einbußen an der Effizienz des Verfahrens verursacht werden.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung des Verfahrens weisen die Oligonukleotide auf den Nanopartikeln als Teilsequenz eine Spacersequenz auf. Die Spacersequenz liegt dabei auf der dem Nanopartikel zugewandten Seite des jeweiligen Oligonukleotids. So dient die Spacersequenz dem übrigen Teil des Oligonukleotids als Abstandhalter. In einer

bevorzugten Ausführungsform enthält ein Oligonukleotid sowohl eine Teilsequenz, die die Funktion eines Primers hat und als Primersequenz bezeichnet wird, als auch eine

Teilsequenz, die eine Spacersequenz ist. Dadurch, dass die Primersequenzen durch die Spacersequenzen von den Nanopartikeln weiter beabstandet sind, können vorteilhafterweise die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren und die DNA-Polymerasen einen besseren Zugang zu den Primersequenzen finden. In einer bevorzugten Ausführung bleiben nach ihrer Synthese die Kopien des Originals und des Komplements über die Spacersequenzen auf der Oberfläche der Nanopartikel befestigt. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die Spacersequenzen Erkennungssequenzen von Restriktionsendonukleasen auf, so dass die synthetisierten Kopien von den Nanopartikeln abgeschnitten werden können. Dies geschieht bevorzugt nach dem Ende des Verfahrens, kann aber auch während des

Verfahrens geschehen. So ist es mit dem Verfahren möglich, Kopien von Nukleinsäuren herzustellen, die frei in der Probe vorliegen. In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens sind die Spacersequenzen mindestens genauso lang wie die Füllmoleküle, so dass die Primersequenzen nicht durch die Füllmoleküle verdeckt werden.

In einer bevorzugten Ausführung ist die Wärme, die durch die Anregung der Nanopartikel auf deren Umgebung übertragen wird, ausreichend, um die Oligonukleotide auf der Oberfläche der Nanopartikel von mit den Oligonukleotiden hybridisierten Nukleinsäuren zu

dehybridisieren. In dieser Ausführung sind Nanopartikel mit Oligonukleotiden konjugiert und zumindest ein Teil dieser Oligonukleotide sind mit zumindest teilweise komplementären Nukleinsäuren hybridisiert. Durch die Anregung der Nanopartikel wird thermische Energie an das umliegende Wasser übertragen, so dass bevorzugt die Temperatur des Wassers um die Nanopartikel ausreicht, um die Oligonukleotide von den mit ihnen verbundenen

Nukleinsäuren zu denaturieren. In einer besonders bevorzugten Ausführung sind die

Nanopartikel mit Primern konjugiert. Beim Durchführen des PCR-Verfahrens entstehen so vorzugsweise doppelsträngige PCR-Produkte, wobei jeweils mindestens ein Einzelstrang der doppelsträngigen PCR-Produkte mit einem Nanopartikel konjugiert ist. Durch Anregung der Nanopartikel ist es in dieser Ausführungsform mit Vorteil erreichbar, die Denaturierungstemperatur um die Nanopartikel zu erzeugen und das Denaturieren der doppelsträngigen PCR-Produkte durchzuführen, ohne das gesamte Reaktionsvolumen zu erhitzen. Dadurch kann das Denaturieren beschleunigt werden und so das PCR-Verfahren schneller ablaufen. In einer weiteren bevorzugten Ausführung werden auch die

Annealingtemperatur und die Elongationstemperatur durch die Anregung der Nanopartikel erzeugt. So muss vorzugsweise im Vergleich zur Erhitzung der ganzen Probe auf die Annealing- und Elongationstemperatur nur eine geringe Energie übertragen werden.

Besonders bevorzugt findet Denaturieren, Annealing und Elongation des PCR- Verfahrens ohne ein globales Erhitzen, sondern ausschließlich über ein lokales Erhitzen durch Anregung der Nanopartikel statt. Dadurch kann das Verfahren ohne eine Einrichtung zum globalen Erhitzen durchgeführt werden, so dass ein geringerer apparativer Aufwand zur Durchführung des Verfahrens benötigt wird.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung umfasst das Verfahren einen globalen

Erhitzungsschritt. Dabei wird die Temperatur mindestens eines Verfahrensschritts zumindest teilweise durch globales Erhitzen erreicht. In einer besonders bevorzugten Ausführung wird die Annealingtemperatur durch globales Erhitzen des Reaktionsvolumens erreicht. Ganz besonders vorzugsweise wird das Reaktionsvolumen über das ganze Verfahren hinweg durch globales Erhitzen in einem vorbestimmten Temperaturbereich gehalten, in dem das Annealing stattfindet. Dabei werden die Elongationstemperatur und die

Denaturierungstemperatur durch Anregung der Nanopartikel erreicht. So kann mit Vorteil die Einrichtung, die das globale Erhitzen erzeugt, in ihrer Konstruktion sehr einfach gehalten werden, da sie nur eine vorbestimmte Temperatur halten muss.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Annealingtemperatur und die

Elongationstemperatur durch globales Erhitzen erreicht und ausschließlich das Denaturieren durch Anregung der Nanopartikel erzeugt. So kann mit Vorteil erreicht werden, dass die Einrichtung, die das globale Erhitzen hervorruft, einen Temperaturzyklus mit nur zwei unterschiedlichen Temperaturen erzeugen muss und damit konstruktiv einfach gehalten werden kann. Die Elongation und das Annealing finden gewöhnlich jeweils in einem engen Temperaturbereich statt. Dahingegen muss zum Denaturieren nur eine bestimmte

Temperatur übertroffen werden. Daher können Inhomogenitäten in der Anregung der Nanopartikel zur Erzeugung des Denaturierens ein geringeres Problem sein als beim Einstellen der Annealing- und Elongationstemperatur. Folglich kann eine bevorzugte

Ausführung, in der die Anregung der Nanopartikel ausschließlich zum Denaturieren dient, technisch einfacher realisiert werden. Insbesondere gilt dies für den besonders bevorzugten Fall, in dem die Annealingtemperatur und die Elongationstemperatur sehr nah beieinander liegen, z.B. bei einer Annealingtemperatur von 60°C und einer Elongationstemperatur von 72°C, so dass das globale Erhitzen nur eine geringe Temperaturerhöhung erzeugen muss.

In einer besonders bevorzugten Ausbildung ist die Annealingtemperatur gleich der

Elongationstemperatur. Wenn die Annealingtemperatur gleich der Elongationstemperatur ist, so ist gewöhnlich zur Durchführung des PCR-Verfahrens nur ein Temperaturzyklus mit zwei unterschiedlichen Temperaturen nötig, wodurch das Verfahren in einem einfachen Aufbau durchgeführt werden kann. Besonders vorzugsweise werden die Schmelztemperaturen der Primer und die verwendete DNA-Polymerase so gewählt, dass bei der Schmelztemperatur die verwendete DNA-Polymerase noch mit ausreichender Geschwindigkeit DNA

synthetisieren kann. In einer besonders bevorzugten Ausbildung wird die

Elongationstemperatur, die gleich der Annealingtemperatur ist, durch globales Erhitzen erreicht und das Denaturieren wird durch Anregung der Nanopartikel erreicht. Auf diese Weise kann die Einrichtung, die das globale Erhitzen hervorruft, konstruktiv einfach gestaltet werden, da sie nur eine Temperatur halten muss.

In einer bevorzugten Ausführung findet zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens die Anregung nur eines Anteils der Nanopartikel statt. Dazu können z.B. die Mittel, die der Anregung der Nanopartikel dienen, so gestaltet sein, dass sie nur in einem Teil des Reaktionsvolumens die dort vorliegenden Nanopartikel anregen. In einer besonders bevorzugten Ausführung werden die Nanopartikel durch optisch angeregt und die Optik, die das Licht der Lichtquelle in das Reaktionsvolumen leitet, ist so gestaltet, dass nur in einen Teil des Reaktionsvolumens Licht geleitet wird. Der Anteil der Nanopartikel, der angeregt wird, ändert sich bevorzugt im Laufe des Verfahrens. Mit anderen Worten ist eine erste Menge der Nanopartikel, die zu einem ersten Zeitpunkt angeregt werden, nicht identisch mit einer zweiten Menge der Nanopartikel, die zu einem zweiten Zeitpunkt angeregt werden. In diesem Fall können eine beliebige Zahl von Nanopartikeln in der ersten und eine beliebige Zahl von Nanopartikeln in der zweiten Menge vorhanden sein, solange erste und zweite Menge nicht identisch sind. Von den beiden genannten Mengen kann sich z.B. eine mit der anderen teilweise überschneiden, so dass die beiden Mengen eine Schnittmenge bilden. Die eine Menge kann z.B. eine

Teilmenge der anderen Menge sein, so dass die eine Menge weniger Nanopartikel enthält als die andere Menge. Die beiden Mengen können z.B. auch so gestaltet sein, dass sie keine Schnittmenge bilden und damit kein Nanopartikel zugleich in der ersten Menge als auch in der zweiten Menge vorhanden ist. Eine der beiden Mengen kann auch die leere Menge sein, so dass z.B. zu einem Zeitpunkt Nanopartikel angeregt werden und zu einem anderen Zeitpunkt keine Nanopartikel angeregt werden. In einer bevorzugten Ausführung enthalten die erste und die zweite Menge im Wesentlichen die gleiche Anzahl von Nanopartikeln. Besonders vorzugsweise regt ein Lichtquelle zu verschiedenen Zeiten verschiedene Anteile der Nanopartikel an. Dadurch kann in der Ausführung des Verfahrens eine Lichtquelle mit einer kleineren Leistung verwendet werden, die gerade dazu ausreicht, einen Anteil der Nanopartikel anzuregen. In einer besonders bevorzugten Ausführung werden zwei oder mehrere Lichtquellen dazu verwendet, verschiedene Anteile der

Nanopartikel anzuregen. Dadurch ist es mit Vorteil möglich, verschiedene Anteile der Nanopartikel anzuregen, ohne dass ein optisches Element benötigt wird, das die Lichtquelle auf verschiedene Teile des Reaktionsvolumens richtet.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung der Erfindung findet eine gerichtete Bewegung der Probe relativ zu einem anregenden Feld statt, so dass zu verschiedenen Zeiten Nanopartikel in verschiedenen Teilvolumina der Probe angeregt werden. Besonders bevorzugt ist das anregende Feld das Licht eines Lasers. In einer ganz besonders bevorzugten Ausführung wird das Licht der Lichtquelle durch ein optisches Element so gelenkt, dass zu

verschiedenen Zeiten Nanopartikel in verschiedenen Teilvolumina des Reaktionsvolumens mit dem Licht angeregt werden. Das optische Element kann dazu beweglich angeordnet sein, z.B. kann das optische Element einen beweglichen Spiegel, einen räumlichen

Modulator oder einen akustooptischen Modulator enthalten. Es kann auch die Lichtquelle selbst beweglich angeordnet sein. Die Bewegung der Probe kann auch so realisiert werden, dass das Reaktionsgefäß, das die Probe enthält, bewegt wird. In einer besonders

bevorzugten Ausführung wird sowohl der Lichtstrahl als auch das Reaktionsgefäß bewegt. In einer weiteren bevorzugten Ausführung wird die Probe im Reaktionsvolumen bewegt, so dass das Licht der Lichtquelle zu verschiedenen Zeiten verschiedene Teilvolumina der Probe erfasst. Dies kann z.B. dadurch erreicht werden, dass die Probe in dem Reaktionsvolumen gerührt wird, z.B. durch einen Magnetrührer. Das Reaktionsvolumen kann z.B. eine langgestreckte Form annehmen, z.B. ein Kanal oder einen Schlauch. Die Probe kann z.B. durch einen Kanal bewegt werden, wobei die Probe an einer oder mehreren Stellen einen Lichtstrahl durchläuft. Besonders vorzugsweise fließt eine Probe durch einen Kanal und passiert n Positionen, an denen jeweils ein Lichtstrahl auf die Probe in dem Kanal gerichtet ist, wobei durch den linearen Fluss der Probe durch die n Lichtstrahlen ein PCR-Verfahren mit n Zyklen durchlaufen wird, n ist dabei vorzugsweise größer als 80. So kann

vorteilhafterweise das Verfahren mit einer geringen Anzahl von beweglichen Teilen ausgeführt werden. Durch die Verwendung eines Kanals ist auch eine Miniaturisierung, z.B. im Sinne eines Lab-on-a-Chip möglich. Vorzugsweise wird durch den Lichtstrahl das

Denaturieren erzeugt, während Elongations- und Annealingtemperatur durch globales Erhitzen erzeugt werden. Besonders bevorzugt ist die Elongations- gleich der

Annealingtemperatur, so dass durch globales Erhitzen nur eine Temperatur gehalten werden muss. Auf diese Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise mit einem geringen Aufwand ausgeführt werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird in dem Verfahren eine DNA-Polymerase verwendet, die thermolabil ist. In dem Fall, dass die Anregung der Nanopartikel zum

Denaturieren verwendet wird, kann vermieden werden, dass das ganze Reaktionsvolumen hohen Temperaturen ausgesetzt wird. Es ist vielmehr möglich, nur die unmittelbare

Umgebung der Nanopartikel auf die Denaturierungstemperatur zu bringen. Die DNA- Polymerasen, die sich nicht in dieser unmittelbaren Umgebung befinden, werden so keinen hohen Temperaturen ausgesetzt. Dadurch ist es möglich, auch DNA-Polymerasen zu verwenden, die nicht hitzestabil, also thermolabil sind. Somit besteht durch den Einschluss der thermolabilen DNA-Polymerasen eine größere Auswahl an Polymerasen für das erfindungsgemäße Verfahren. Durch die größere Auswahl an DNA-Polymerasen können die Reaktionsbedingungen in einem größeren Ausmaß verändert werden und gleichzeitig eine ausreichende Funktion der jeweiligen DNA-Polymerase aufrechterhalten werden. Damit die zu vervielfältigenden Nukleinsäuren an die negativ geladenen Oligonukleotide auf den Nanopartikeln binden können, kann es notwendig sein, Stoffe - insbesondere Salze - in der Probe in einer Konzentration zu verwenden, die die Funktion einer thermostabilen DNA- Polymerase negativ beeinflussen, was die Effizienz des Verfahrens senkt. Die größere Auswahl an DNA-Polymerasen - insbesondere solchen, die eine hohe Toleranz für Salze haben - kann so dazu führen, dass eine Steigerung der Effizienz des Verfahrens erreicht wird. Teil der größeren Auswahl an DNA-Polymerasen sind kleine DNA-Polymerasen wie z.B. das Klenow-Fragment und Phi29. In der Nähe der Nanopartikel können große thermostabile DNA-Polymerasen durch die aufgebrachten und gegebenenfalls bereits elongierten Primer eine sterische Hinderung erfahren. Dadurch kann es sein, dass die DNA- Polymerase nicht an die zu kopierende Nukleinsäure gelangt oder die DNA-Polymerase abbricht, bevor sie eine vollständige Kopie des Originals oder Komplements synthetisiert hat, was eine Verringerung der Effizienz des Verfahrens bedeutet. Die größere Auswahl an DNA- Polymerasen ermöglicht so eine Erhöhung der Effizienz des Verfahrens. Durch die größere Auswahl an DNA-Polymerasen stehen mit Vorteil auch Enzyme mit niedrigeren

Herstellungskosten zur Verfügung. Die DNA-Polymerasen, die sich nicht in der unmittelbaren Umgebung der Nanopartikel befinden, erfahren eine geringere hitzebedingte Deaktivierung. Dadurch kann mit Vorteil eine geringere Menge an DNA-Polymerase in dem Verfahren eingesetzt werden.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung sind sowohl lösliche Primer als auch Primer auf Nanopartikeln in dem Reaktionsvolumen vorhanden. Die löslichen Primer sind nicht an Nanopartikel konjugiert, sondern liegen gelöst in der Probe vor. Die löslichen Primer haben vorzugsweise kleinere Ausmaße als die Nanopartikel-Primer-Konjugate und können in höherer Konzentration als die Nanopartikel-Primer-Konjugate vorliegen. Daher können die löslichen Primer einen besseren und schnelleren Zugang zu langen, doppelsträngigen Nukleinsäuren, wie z.B. genomischer DNA haben. In einer besonders bevorzugten

Ausführungsform werden in einem ersten Schritt des Verfahrens die langen,

doppelsträngigen Nukleinsäuren durch globales Erhitzen des gesamten Reaktionsvolumens denaturiert, woraufhin die gelösten Primer mit den Nukleinsäuren hybridisieren. Das PCR- Verfahren läuft dabei zunächst in einem oder mehreren Zyklen bei globalem Erhitzen ab, dabei synthetisiert die DNA-Polymerase die gewünschten, kurzen Kopien der langen, doppelsträngigen Nukleinsäuren. Danach wird das PCR-Verfahren fortgeführt, wobei auch lokales Erhitzen durch Anregung der Nanopartikel eingesetzt wird.

In einer bevorzugten Ausführung der Erfindung kann die Partikeldiffusion der Nanopartikel- Primer-Konjugate durch optische Felder verstärkt. Durch optische Wirbelfelder (nach Silvia Albaladejo et al., Nano Letters, 2009, Band 9, Ausgabe 10, Seiten 3527 bis 3531 , dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist) mit denen die Nanopartikel angeregt werden oder durch optische Kräfte (nach Arthur Ashkin et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 1997, Band 94, Ausgabe 10, Seiten 4853 bis 4860, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist), die auf die Nanopartikel ausgeübt werden, kann die Nanopartikeldiffusion erhöht werden. Dadurch kann mit Vorteil erreicht werden, dass bei einer gegebenen Nanopartikelkonzentration eine schnellere Hybridisierung der zu vervielfältigenden Nukleinsäuren mit den Primern auf den

Nanopartikeln stattfindet. Dies kann zur Beschleunigung des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzt werden.

In einer Ausführung der Erfindung wird die Konzentration der Produkte der

Vervielfältigungsreaktion durch Testsonden bestimmt. Testsonden sind Nanopartikel, die auf ihrer Oberfläche Oligonukleotide mit Testsequenzen aufweisen. In einer bevorzugten Ausführung des Verfahrens weisen die Oligonukleotide der Testsonden als Teilsequenz eine Spacersequenz auf. Die Spacersequenz liegt dabei auf der dem Nanopartikel zugewandten Seite des jeweiligen Oligonukleotids. So dient die Spacersequenz dem übrigen Teil des Oligonukleotids als Abstandhalter. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält ein Oligonukleotid der Testsonden sowohl eine Teilsequenz, die als Testsequenz bezeichnet wird, als auch eine Teilsequenz, die eine Spacersequenz ist. In einer bevorzugten

Ausführung sind auf den Testsonden Füllmoleküle aufgebracht. Die Testsequenzen können mit Produkten der Vervielfältigungsreaktion hybridisieren. Dabei sind die Testsequenzen vorzugsweise zumindest teilweise komplementär zu den Produkten der

Vervielfältigungsreaktion. In einer bevorzugten Ausführung sind erste Nanopartikel mit Vorwärtsprimern konjugiert. In Anwesenheit des Originals und einer DNA-Polymerase werden die Vorwärtsprimer verlängert, so dass Komplemente entstehen, die über die Vorwärtsprimer an die ersten Nanopartikel gebunden sind. Ein Komplement besteht dabei aus dem Vorwärtsprimer und einer Verlängerungssequenz, die durch das Verlängern des Vorwärtsprimers entsteht. Besonders vorzugsweise wird unter Verwendung von freien und/oder nanopartikelgebundenen Rückwärtsprimern ein PCR-Verfahren durchgeführt, so dass in einer exponentiellen Vervielfältigung vorzugsweise eine große Anzahl von Kopien des Originals und nanopartikelgebundenen Komplementen entstehen. Ganz besonders bevorzugt sind weisen die ersten Nanopartikel auf ihrer Oberfläche sowohl Vorwärtsprimer als auch Rückwärtsprimer auf. In einem optionalen Zwischenschritt werden die Originale und gegebenenfalls deren Kopien von den Komplementen durch lokales oder globales Erhitzen denaturiert. Die ersten Nanopartikel werden dann mit Testsonden zusammengeführt, wenn dies nicht schon zuvor geschehen ist. Die Testsequenzen der Testsonden sind

komplementär zu den Verlängerungssequenzen, so dass die Testsonden über

Testsequenzen an die verlängerten Vorwärtsprimer auf den ersten Nanopartikeln binden können. Bei geeigneten Reaktionsbedingungen kommt die Verbindung der ersten

Nanopartikel mit den Testsonden in dem Ausmaß zustande, in dem auch

nanopartikelgebundene Komplemente vorliegen. Das bedeutet, dass wenn keine

Verlängerungssequenzen entstehen, auch keine Verbindung von Testsonden und ersten Nanopartikeln entsteht. Besonders vorzugsweise werden die Reaktionsbedingungen der erfindungsgemäßen Vervielfältigung und des Nachweises durch Testsonden so gewählt, dass das Ausmaß der Verbindung von ersten Nanopartikeln mit Testsonden darüber Rückschlüsse zulässt, welche Konzentration des Originals vor der Vervielfältigung in der Probe vorlag. Durch die Verbindung der ersten Nanopartikel mit den Testsonden kann eine messbare Veränderung entstehen, z.B. eine Rotverschiebung oder Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum. In einer ganz besonders bevorzugten

Ausführung ist die messbare Veränderung, die durch die Verbindung von Testsonden und ersten Nanopartikeln entsteht, proportional zur Konzentration des Originals in der Probe vor der Vervielfältigung. So kann mit Vorteil mit einfachen Mitteln ein Konzentrationsnachweis erfolgen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung umfasst das Verfahren Vorwärtsprimer, die mit ersten Nanopartikeln konjugiert sind und freie und/oder nanopartikelgebundene

Rückwärtsprimer. Besonders bevorzugt ist es, dass die ersten Nanopartikel sowohl Vorwärtsprimer als auch Rückwärtsprimer auf ihrer Oberfläche aufweisen. In einem ersten Schritt werden die Vorwärtsprimer in Anwesenheit des Originals durch eine DNA-Polymerase zu nanopartikelgebundenen Komplementen verlängert. In einem zweiten Schritt werden ausgehend von den Rückwärtsprimern, die an das nanopartikelgebundene Komplement binden, Kopien des Originals synthetisiert. Danach werden die ersten Nanopartikel mit Testsonden zusammengeführt, wenn dies nicht schon zuvor geschehen ist. Die

Testsequenzen sind in dieser Ausführung komplementär zu den Vorwärtsprimern. Wenn die Vorwärtsprimer nicht verlängert wurden, dann können die Testsonden gut an die ersten Nanopartikel binden. Wenn die Vorwärtsprimer verlängert wurden, dann wird die Bindung von Testsequenzen an Vorwärtsprimern durch sterische Hinderung behindert. Wenn eine neu synthetisierte Kopie des Originals mit dem verlängerten Vorwärtsprimer hybridisiert ist, so wird die Bindung der Testsequenz an den verlängerten Vorwärtsprimer verhindert. In dieser Weise sinkt das Ausmaß der Verbindung zwischen ersten Nanopartikeln und

Testsonden in dem Ausmaß in dem Produkte der Vervielfältigungsreaktion, das heißt Komplemente und Kopien des Originals, synthetisiert wurden. Bei geeigneter Wahl der Reaktionsbedingungen kann so ein Konzentrationsnachweis des Originals in der Probe durchgeführt werden, so dass eine messbare Veränderung desto geringer ist, je mehr Original in der Probe vor der Vervielfältigung vorhanden war. Die messbare Veränderung kann dabei z.B. eine Rotverschiebung oder Verbreiterung der Plasmonenresonanz im Extinktionsspektrum sein. So kann mit Vorteil ein einfacher Test gestaltet werden, der die Bestimmungen von Konzentrationen spezifischer Nukleinsäuren zulässt.

Durch die Erfindung ist es möglich, ein verbessertes Verfahren zum Vervielfältigen von Nukleinsäuren bereitzustellen.

Kurzbeschreibung der Figuren

Es zeigen:

Figur 1 in einer schematischen Darstellung Nanopartikel, die mit Füllmolekülen,

Spacersequenzen, abasischen Modifikationen und Primersequenzen konjugiert sind;

Figur 2 in einer schematischen Darstellung einen Aufbau zur Durchführung des

erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem zweidimensionalen Spiegelscanner und einer Probe; Figur 3 in einer schematischen Darstellung einen weiteren Aufbau zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit einem Laser, einem

zweidimensionalen Spiegelscanner und Probenröhrchen in einem Wasserbad;

Figur 4 das idealisierte Temperaturprofil einer herkömmlichen PCR (gestrichelte

Linie);

Figur 5 den Vervielfältigungs-Faktor N _k /N ₀ als Funktion der Zeit für unterschiedliche

Parameter;

und

Figur 6 in vier Diagrammen die Ergebnisse von Vervielfältigungsreaktionen mit

unterschiedlichen Zyklenzeiten und Zyklenanzahl.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung anhand mehrerer Ausführungsbeispiele

Bei bekannten PCR-Verfahren für die Vervielfältigung einer kurzen Nukleinsäure (z.B. mit weniger als 300 Basenpaaren), die mit einer Temperierung mittels Thermocycler arbeiten, ist die Prozessdauer in der Regel durch die Temperierungszeit begrenzt, die einen Großteil der Zyklusdauer ausmacht. Um eine möglichst kurze Prozessdauer zu erreichen, wird in solchen Fällen angestrebt, bei dem Zugewinn g _h (der Index„h" weist auf diesen

herkömmlichen Fall hin) pro Durchlauf des Zyklus nahe an die theoretische Grenze von 100% zu gelangen, um mit möglichst wenigen Zyklen das gewünschte Ergebnis zu erzielen. Nach Erkenntnis der Erfinder ist jedoch bei Verfahren mit kürzeren Temperierungszeiten, z.B. bei Verfahren, die mit einer lokalen Erhitzung mittels Nanopartikeln arbeiten, eine Maximierung des Zugewinns g nicht mehr notwendigerweise die beste Strategie. Vielmehr kann hier unter Inkaufnahme eines verringerten Zugewinns eine Verkürzung der Zyklusdauer erreicht werden, die die Nachteile des geringeren Zugewinns überwiegt, sodass insgesamt trotz geringerem Zugewinn eine Verkürzung der Prozessdauer resultiert.

Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, sollen zunächst die charakteristischen Zeitenkonstanten betrachtet werden, die verschiedene Prozesse während der PCR benötigen und ein einfaches mathematisches Modell aufgestellt werden.

Zunächst wird von einem herkömmlichen PCR-Verfahren ausgegangen, das in einem handelsüblichen Thermocycler durchgeführt wird, z. B. mit einem Peltier-Element oder einem Luftstrom, um das Reaktionsvolumen (üblicherweise 5 bis 50 Mikroliter) von außen zu temperieren. Typischerweise erreichen solche handelsüblichen Thermocycler Heiz- und Kühlraten von etwa 5 K s, auch wenn die mittlere Temperierungsgeschwindigkeit deutlich niedriger liegen kann. Dies bedeutet, dass der Prozess des Aufheizens einer Probe von einer Annealingtemperatur von 60 °C auf 95 °C Denatunerungstemperatur und das neuerliche Abkühlen auf die Annealingtemperatur mindestens etwa 2 ^■ 35°C/(5y) = 14 s benötigen kann. Hinzu kommt bei bisherigen Verfahren, dass die Thermalisierung des Probenvolumens zusätzlich einige Sekunden in Anspruch nehmen kann, bis näherungsweise überall in der Probe die gleiche Temperatur herrscht, wie an den beheizten oder gekühlten Gefäßwänden. Folglich beträgt die gesamte Temperierungszeit t _t je Zyklus bei

konventionellen Protokollen typischerweise mehr als 14 s.

Für eine PCR sind auch die Annealing- und Elongationszeiten wichtig. Die Annealingzeit beträgt bei ausreichend hohen Primerkonzentrationen (z.B. mehr als 300 nM) unter geeigneten Bedingungen im Stand der Technik häufig wenige Sekunden, bis an einen Großteil (>90%) der Targets ein Primer hybridisiert ist. Beispielsweise ist auch eine

Annealingzeit von 1s realisierbar.

Die Zeit, die die Polymerase zur Elongation der Primer benötigt, hängt von der Länge des Amplikons und der Schreibgeschwindigkeit der eingesetzten Polymerase ab. Um z. B. 80 Basenpaare zu elongieren, dauert die Elongation unter geeigneten Bedingungen bei einer Polymerase mit effektiver Schreibgeschwindigkeit von 100 BP/s etwa 0,8 s.

Die Hybridisierungszeit und die Elongationszeit zusammen wird im Folgenden als die erforderliche produktive Zeit t _Ph bezeichnet. Im obigen Beispiel beträgt die erforderliche produktive Zeit für ein kurzes Amplikon zum Beispiel etwa t _Ph « 2 s, wenn man von etwa einer Sekunde Annealing und eine weiteren Sekunden Elongation ausgeht.

Die Dauer eines PCR-Zyklus t _Ch ist im oben genannten Beispiel die Summe aus der Temperierungszeit t _th und der erforderlichen produktiven Zeit t _Ph , d.h. tc _h ^{= t} t _h ^{+ t} Ph ' ( ³ )

Wenn man eine etwaige Haltezeit bei der Denatunerungstemperatur vernachlässigt, da sie sehr kurz gewählt werden kann, z.B. kürzer als eine Sekunde. Vergleicht man die Temperierungszeit von ca. 14 s mit der erforderlichen produktiven Zeit von ca. 2 s im obigen Beispiel, erkennt man, dass in einem herkömmlichen Thermocycler für kurze Nukleinsäuren typischerweise die Ungleichungen t _th » t _Ph und t _Ch « t _tft gelten. Dies bedeutet, dass die Temperierungszeit, d.h. die Aufheiz- und Abkühlzeiten, also die Zeit die benötigt wird die Probe von der Annealingtemperatur auf die Denaturierungstemperatur zu bringen und wieder gleichförmig auf die Annealingtemperatur abzukühlen, in der Regel die Dauer eines jeden Zyklus und somit auch die Gesamtdauer der PCR bestimmt.

Wenn mit der PCR die Zahl der Kopie N ₀ des Templates auf N _k Kopien gesteigert werden soll, kann dies, wie oben bereits erläutert, mit einer Anzahl k Temperaturzyklen erreicht werden, wobei k = log( _1+flh) (N _fe //V ₀ ) beträgt, wenn der mittlere Zugewinn in jedem Zyklus g _h beträgt. Dabei wird wieder vereinfachend angenommen, dass der Zugewinn je Zyklus während der PCR konstant bleibt. Wenn f _Cg Zyklen pro Zeit durchgeführt werden (mit f _Ch = l/t _Ch ), dann kann die Zahl der Kopien N _k nach einer Zeit t etwa gegeben sein durch mit g _h = 0 ... 100%. Die Prozessdauer T der gesamten PCR kann dann gegeben sein durch die Zyklusdauer t _Ch multipliziert mit der notwendigen Zahl Zyklen k: = t _Ch ^■ k = t _Cft · log _(1+ft0 ( ). (5)

Beispielsweise kann eine Vervielfältigung um den Faktor N _fc /N ₀ = 10 ¹² dann je nach Wert von g _h eine Zeit benötigen, die in Tabelle 1 dargestellt ist.

Tabelle 1 : Bevorzugte PCR-Dauer T in Einheiten der Zyklusdauer t _Cft zur 10 ¹² -fachen Amplifikation eines Targets. Daraus folgt, dass im Falle einer herkömmlichen PCR, bei der t _th » t _Vh und t _Ch « t _th gelten, eine kurze Prozessdauer dadurch erreichbar ist, dass der Zugewinn je Zyklus maximiert wird, g _h also nahe an 100% ist. In diesem Fall kann die Zahl der Kopien N _k mit der Zeit etwa gegeben sein durch d.h. je Zyklus kann zu der Zahl der bisherigen Kopien noch einmal die gleiche Zahl hinzukommen (d.h. es findet eine Verdoppelung je Zyklus statt). Die kürzest mögliche PCR- Dauer T _min für eine Amplifikation um den Vervielfältigungs-Faktor N _k /N ₀ kann dann gegeben sein durch

7min = k = t _c - log ₂ (^)- (7)

Ein anderes Bild kann sich ergeben, wenn die Temperierungszeiten nicht mehr die

Zyklusdauer bestimmen. Dieser Fall schließt insbesondere auch den Unterfall ein, dass Heiz- und Kühlschritte einschließlich der Thermalisierung vernachlässigbar kurz sind, d. h. wenn die Ungleichungen t _t « t _p und t _c « t _p gelten.

Beispiel 1

Im Folgenden soll der Einfluss einer Verkürzung der Zyklusdauer untersucht werden. Die Zyklusdauer wird in diesem Beispiel mit t _Ci bezeichnet (der optionale Index„i" wird im Folgenden zur Betonung der erfindungsgemäßen Lösung für die Parameter verwendet, die eine PCR mit verkürzten Zyklendauern beschreibt), wobei die beispielhafte Zyklusdauer t _Ci gegenüber der Zyklusdauer t _Ch in dem herkömmlichen Fall um einen Verkürzungs-Faktor x mit x e Π ¹ verkürzt ist, so dass gilt t _Ci = D.h. aus der Zyklen-Frequenz f _c des herkömmlichen Falls kann die neue Zyklen-Frequenz f _c . = x - f _Ch berechnet werden. Der Zugewinn in diesem Beispiel wird mit g _t bezeichnet. Der beispielhafte Zugewinn kann gleich dem Zugewinn im herkömmlichen Fall sei {g _t = g _h ), er kann aber auch kleiner als dieser sein (d _t < 9 _h )- Wenn es zu einer Verringerung des Zugewinns je Zyklus kommt, kann dies durch einen Effizienzverlust-Faktor y beschrieben werden, wobei g _t = . Es folgt, dass in diesem Beispiel Ni = N ₀ l + ^) ^fc h ^{x t} = N ₀ (l + Qd = N ₀ l + g _t Y***. (8)

Die Prozessdauer T _t der gesamten PCR in diesem Beispiel ist mithin wofür wieder ausgenutzt wurde, dass vorzugsweise f _c =— . Eine Verkürzung der

Prozessdauer kann im Vergleich zum herkömmlichen Fall sowohl erreicht werden, wenn 9i = 9 _h> ^a ' ^s auch, wenn g _t < g _h , solange nur der Nachteil des geringeren Zugewinns durch den Vorteil der Verkürzung der Zyklusdauer überwogen wird.

Wird beispielsweise eine Vervielfältigung um den Faktor Ni/N ₀ = 10 ¹² angenommen, können sich gemäß Gleichung 9 folgende Werte für die Prozessdauer in Einheiten von t _Ch in Abhängigkeit der Wahl der Werte für g _t und x ergeben.

Herkömmliche

X PCR Dauer T

bei x = 1 1,11 1,25 1,33 1,67 2,00 4,00 10,00

0,05 566 * 510 ^* 453 ^* 425* 340 ^* 283* 142 ^* 57 ^*

0,10 290 ^* 261 * 232 ^* 217 ^* 174* 145 ^* 72 ^* 29

0,15 198 ^* 178 ^* 158 * 148 ^* 119* 99 ^* 49* 20

0,20 152 ^* 136 ^* 121 * 114 ^* 91 * 76 ^* 38 + 15

0,25 124* 111 ^* 99 ^* 93* 74 ^* 62 * 31 12

0,30 105 * 95 ^* 84 * 79* 63 ^* 53* 26 11

0,35 92 ^* 83* 74 ^* 69 ^* 55* 46 ^* 23 9

0,40 82 * 74* 66 ^* 62 ^* 49* 41 * 21 8

0,45 74 ^* 67 ^* 59 * 56 ^* 45 * 37 + 19 7

- 0,50 68 ^* 61 ^* 55 * 51 ^* 41 * 34 17 7

⁰³ 0,55 63* 57* 50 ^* 47 ^* 38 + 32 16 6

0,60 59 * 53 ^* 47 ^* 44* 35 29 15 6

0,65 55 ^* 50 ^* 44* 41 ^* 33 28 14 6

0,70 52 ^* 47 ^* 42 * 39 + 31 26 13 5

0,75 49* 44* 39 + 37 30 25 12 5

0,80 47* 42 * 38 35 28 24 12 5

0,85 45 ^* 40 ^* 36 34 27 22 11 4

0,90 43 ^* 39 34 32 26 22 11 4

0,95 41 * 37 33 31 25 21 10 4

1,00 40* 36 32 30 24 20 10 4

Tabelle 2: PCR-Dauer T einer herkömmlichen PCR sowie bevorzugte PCR-Dauer T _;

in Einheiten der herkömmlichen Zyklusdauer t _Cfi zur 10 ¹² fachen Amplifikation eines Targets.

Die mit * markierten Werte illustrieren den Bereich in einer theoretischen Betrachtung für welche Kombinationen von g _t und x keine Beschleunigung gegenüber einer herkömmlichen PCR mit g _h * 100% eintritt.

Beispiel 2

Dieses Beispiel basiert auf Beispiel 1 und beinhaltet den Fall, dass die erfindungsgemäße Zyklusdauer t _Ci vorzugsweise zwar kürzer gewählt sein kann als die herkömmliche

Zyklusdauer t _Ch , aber weiterhin derart, dass der Zugewinn je Zyklus etwa gleich bleiben kann, wie bei der Wahl der bisherigen Zyklusdauer t _c , d. h. g _t ~ g _h (Dies kann z.B. erfordern, dass das Annealing und die Elongation weiterhin in jedem Zyklus mit etwa der gleichen Effizienz wie bei der Wahl der bisherigen Zyklusdauer t _Ch ablaufen). D.h. hier ist der Effizienzverlust-Faktor y = 1, da defintionsgemäß in diesem Beispiel kein Effizienzverlust auftritt.

In diesem Fall kann dann die Zahl der notwendigen Zyklen für eine gewünschte

Vervielfältigung gleichbleiben, und die Dauer eines jeden Zyklus kann sich um den Faktor x verkürzen und die erfindungsgemäße Prozessdauer kann sich entsprechend auf T _t = T/x verkürzen. Mit anderen Worten: Bei den Wertebeispielen der Tabelle 2 kann die PCR-Dauer einer hypothetischen konventionellen PCR T im Rahmen dieser theoretischen Betrachtung in der zweiten Spalte abgelesen werden. Die Prozessdauer für eine erfindungsgemäße PCR mit g ₀ . = g ₀ ist dann in der gleichen Zeile wie der konventionelle Vergleichswert abzulesen.

In einer beispielhaften Realisierung dieser Beispiels wird die Zyklusdauer so gewählt, dass sie weiterhin größer ist als die erforderliche produktive Zeit, t _Ci - t _ti » t _pv so dass z.B. näherungsweise gt = g _h ~ 100% erreicht wird.

Beispiel 3

Dieses Beispiel basiert ebenfalls auf Beispiel 1. Jedoch wird nun angenommen, dass die Verkürzung der beispielhaften Zyklusdauer t _Ci gegenüber der herkömmlichen Zyklusdauer t _Ch zu einer Verringerung des mittleren Zugewinns je Zyklus g _t gegenüber dem bisherigen Zugewinn g _h führen (d.h. der Effizienzverlust-Faktor y =— > 1 ). Wie weiter angenommen

9i

wird, kann dieser Rückgang des Zugewinns je Zyklus, der sich aus der Verkürzung der Zyklusdauer um den Faktor x ergeben kann, jedoch durch mehr Temperaturzyklen mehr als ausgeglichen werden (die ja um den Faktor x =— schneller ausgeführt werden können), d.h. der Zuwachs der Amplikon-Konzentration pro Zeiteinheit ist trotzdem höher (wobei die betrachtete Zeiteinheit vorzugsweise sehr viel länger als t _Cfi zu wählen ist).

Ein Rückgang des mittleren Zugewinns je Zyklus kann z.B. dadurch erfolgen, dass die Zyklusdauer sogar kürzer wird, als die erforderliche produktive Zeit, d.h. t _Cj < t _pi , wobei t _p . = t _Ph bleibt, so dass der Zugewinn je Zyklus g _h « 100% ist (z.B. weil nur wenige Kopien des Templates in der Zeit mit einem Primer hybridiseren können und/oder die Polymerase in der Zeit nicht alle Primer elongieren kann oder die Denaturierung nicht vollständig verläuft, da z.B. die Einwirkdauer so kurz ist, dass sich der DNA-Doppelstrang nicht ausreichend entwinden kann).

Beispiel 3a

In diesem Beispiel wird angenommen, dass für den Zugewinn folgender Zusammenhang gilt: g _h > 9i > ^. (10)

Mit anderen Worten, der mittlere Zugewinn je Zyklus nimmt in dieser Ausführungsform vorzugsweise maximal linear mit der Verkürzung x der Zyklusdauer ab, was z.B. eintreten kann, wenn die Zyklusdauer nicht mehr ausreicht, dass ein Großteil der Template-DNA mit einem Primer hybridisieren kann. (D.h. der Effizienzverlust-Faktor ist hier 1 < y < x) .

Dadurch kann der Rückgang des Zugewinns je Zyklus, der maximal den Faktor x beträgt, durch x mal mehr Zyklen pro Zeit mehr als ausgeglichen werden. In diesem Fall kann geschrieben werden:

N ₀ - cc ^fc h ^t . (1 1 )

In diesem Fall kann die Basis der Exponentialfunktion α größer sein als in einer

herkömmlichen PCR, wo die Basis der Exponentialfunktion gemäß Gleichung 4 (1 + g _h ) betragen kann und im besten Fall gleich zwei ist. Dies ist in folgender Tabelle

zusammengefasst, die Werte für (1 + g _h ) sowie für α enthält:

KonvenX

tionell

(1 + 9h) 1,11 1,25 1 ,33 1 ,67 2,00 4,00 10,00

0,40 1 ,40 1 ,41 1 ,41 1 ,42 1 ,43 1 ,44 1 ,46 1 ,48

0,60 1 ,60 1 ,62 1 ,63 1 ,64 1 ,67 1 ,69 1 ,75 1 ,79 gh

0,80 1 ,80 1 ,83 1 ,86 1 ,87 1 ,92 1 ,96 2,07 2,16

1,00 2,00 2,04 2,08 2,1 1 2,19 2,25 2,44 2,59

Tabelle 3: Werte für α im Vergleich zu einer hypothetischen bisherigen Basis der Exponentialfunktion (1 + g _h ).

Das bedeutet, dass die pro Zeit stattfindende Amplifikation größer sein kann als

konventionell, so lange wie g ₀ > 0 und Gleichung 10 erfüllt ist. Daher nennen die Erfinder den erfindungsgemäßen Prozess auch„Super-Amplification".

Die Zeit, in der eine erfindungsgemäße PCR in dieser Ausführungsform benötigt ergibt sich, wenn Gleichung 9 für die PCR-Dauer umgeschrieben wird zu

^ ^ ^• ) ©- (12)

Mit anderen Worten: Im Beispiel der Tabelle 2 kann die PCR-Dauer einer hypothetischen konventionellen PCR in der zweiten Spalte abgelesen werden. Im Vergleich zu einem konventionellen Vergleichswert kann die erfindungsgemäße Prozessdauer dann in einem Feld mit Werten ohne * oder + in der gleichen Zeile oder darüber abgelesen werden, je nachdem welche Werte-Kombination von g _t und x realisiert wird.

Eine besonders interessante Variante dieser Ausführungsform ergibt sich für herkömmliche

PCRs bei denen der Zugewinn je Zyklus g ₀ « 100% (unterste Zeile in Tabelle 3).

In diesem Fall kann a in Gleichung 1 1 näherungsweise umgeschrieben werden als a =

(l + . Es lässt sich vorzugsweise erreichen, dass x sehr groß wird, so dass näherungsweise die Grenzwertbildung lim^ _c (l + = e zulässig ist (e « 2,71828 ... ), so dass aus Gleichung 1 1 der Wert für N _t genähert werden kann als:

Ni ~ N ₀ - e ^c fc ^"e (13) Hier zeigt sich im Vergleich zu Gleichung 6, dass die zeitliche Amplifikation nicht mehr mit 2 sondern mit ablaufen kann, d.h. die Basis der Exponentialfunktion kann größer sein.

Aus Gleichung 13 kann die Prozessdauer für den Fall, dass x sehr groß wird,

näherungsweise abgeschätzt werden als wofür wieder ausgenutzt wurde, dass f _Ch = l/t _Cft - Das heißt, in diesem Fall kann die Prozessdauer mit dem natürlichen Logarithmus des Amplifikationsfaktors einhergehen.

Beispiel 3b

Dieses Beispiel basiert ebenfalls auf Beispiel 1 . Auch in dieser Ausführungsform können kürzere Temperaturzyklen genutzt werden. Jedoch kann in dieser Ausführungsform die erfindungsgemäße Verkürzung der Zyklusdauer t _Ci gegenüber der bisherigen Zyklusdauer t _Ch zu einer Verringerung des Zugewinn je Zyklus g _t gegenüber dem bisherigen Zugewinn g _h führen, so dass gelten kann

Das heißt, der Zugewinn je Zyklus kann in dieser Ausführungsform mehr als linear mit der Verkürzung x der Zyklusdauer abnehmen. (D.h. der Effizienzverlust-Faktor ist hier y > x). Auch in diesem Fall kann sich der Rückgang des Zugewinns je Zyklus durch mehr Zyklen, die ja um den Verkürzungsfaktor x schneller ausgeführt werden, als konventionell, unter geeigneten Umständen vorzugsweise überkompensieren lassen.

Im Beispiel der Tabelle 2 kann die hypothetische Prozessdauer einer konventionellen PCR im untersten Feld der zweiten Spalte für g _h « 100% abgelesen werden (in diesem Fall also der Wert 40). Die Prozessdauer in dieser Ausführungsform der Erfindung ist dann in den Feldern abzulesen, deren Werte mit einem + markiert sind, sofern sich diese Werte- Kombination von g _t und x realisieren lassen. Figur 1 zeigt ein Ausführungsbeispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Vervielfältigung von Nukleinsäuren 1 , das als PCR ausgeführt ist. In einem

Reaktionsvolumen 2 sind erste Nanopartikel 3 enthalten. Die ersten Nanopartikel 3 weisen an ihrer Oberfläche Oligonukleotide 4 auf, wie in Figur 1a gezeigt. Eine Sorte von

Oligonukleotiden 4 enthalten jeweils als Teilsequenz eine Primersequenz 5 mit der Sequenz A und als weitere, optionale Teilsequenz eine Spacersequenz 6 S und einer optionalen abasische Modifikation 7 zwischen Primersequenz 5 A und Spacersequenz 6 S. Die

Primersequenz 5 dient dabei als Vorwärtsprimer 8. Die Spacersequenz 6 S dient dazu, die Primersequenz 5 weit genug von der Oberfläche der Nanopartikel 9 wegzuhalten, so dass eine zu vervielfältigende Nukleinsäure 1 mit einer besseren Effizienz an die Primersequenz 5 binden kann und eine DNA-Polymerase 11 einen besseren Zugang zu der Primersequenz 5 finden kann. Die abasische Modifikation 7 verhindert das Überschreiben der Spacersequenz durch die Polymerase 11. Die Oligonukleotide 4 mit der Primersequenz 5 A sind z.B. mit einer Thiol-Bindung an der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 befestigt, so dass das 3'- Ende vom ersten Nanopartikel 3 abgewandt ist. Optional kann sich eine weitere Sorte von Oligonukleotiden 4 auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3 befinden, dies sind die Füllmoleküle 10 F. Mit den Füllmolekülen 10 kann die Ladung der Nanopartikel 9 moduliert werden, so dass es nicht zu unerwünschten Aggregationen der Nanopartikel 9 kommt.

Darüber hinaus können die Füllmoleküle 10 den Abstand der Primersequenzen 5 zueinander auf der Oberfläche der Nanopartikel 9 vergrößern, so dass die zu vervielfältigenden

Nukleinsäuren 1 und die DNA-Polymerase 11 einen besseren Zugang zu den

Primersequenzen 5 haben. Dies kann die Effizienz des Verfahrens erhöhen. Die

Spacersequenz 6 ist dabei bevorzugt mindestens so lang wie die Füllmoleküle 10, so dass mit Vorteil die Primersequenzen 5 aus den Füllmolekülen 10 hervorragen.

In dem Reaktionsvolumen 2 befindet sich eine flüssige Probe 12, die die ersten Nanopartikel 3 aus Figur 1a mit den Primersequenzen 5, Spacersequenzen 6, abasischer Modifikation 7 und Füllmolekülen 10 enthält und die darüber hinaus dNTPs und DNA-Polymerase 11 aufweist. Eine nachzuweisende Nukleinsäure 1 kann in der Probe 12 vorhanden sein. In diesem Ausführungsbeispiel ist die nachzuweisende Nukleinsäure 1 ein DNA-Einzelstrang, der auch als Original 13 oder Amplikon 13 bezeichnet wird und eine Teilsequenz A' sowie eine Teilsequenz B' aufweist. Das Original 13 kann auch noch weitere Teilsequenzen aufweisen, z.B. als Überhänge am 5'- oder 3'-Ende oder zwischen den beiden

Teilsequenzen A' und B'. In Figur 1 b bindet das Original 13 mit seiner Teilsequenz A' an die Primersequenz 5 A auf der Oberfläche der ersten Nanopartikel 3. In Figur 1c ist gezeigt, dass eine DNA-Polymerase 11 an das Original 13 und die mit dem Original 13 hybridisierte Primersequenz 5 A bindet. Daraufhin synthetisiert die DNA-Polymerase 11 in einem Elongationsschritt, der in Figur 1d gezeigt wird, ausgehend vom 3'-Ende der Primersequenz 5 A eine zum Original 13 komplementäre Nukleinsäure 1 , die als Komplement 14 bezeichnet wird und die mit der Spacersequenz 6 auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 verbunden ist. In Figur 1e wird das erste Nanopartikel 3 dann mit Licht bestrahlt, das von dem ersten Nanopartikel 3 aufgrund seiner plasmonischen oder materiellen Eigenschaften absorbiert wird und in Wärme umgewandelt wird. Die Wärme wird an die Umgebung des ersten Nanopartikels 3 abgegeben und ist im Bereich des Originals 13 und des mit ihm hybridisierten, neu synthetisierten Komplements 14 dazu ausreichend, dass das Original 13 von dem Komplement 14 denaturiert. Das Original 13 ist nunmehr erneut frei, wie in Figur 1f dargestellt, so dass es an eine weitere Primersequenz 5 binden kann und weitere

nanopartikelgebundene Komplemente 14 in weiteren Zyklen des Verfahrens synthetisiert werden können. Dabei entsteht ein linearer Anstieg der Konzentration der Komplemente 14 mit steigender Zyklenzahl.

In einer Ausführung des Verfahrens wird nach dem Verlängern der Primersequenz 5 auf der Oberfläche 4 der ersten Nanopartikel 3, bei der ein nanopartikelgebundenes Komplement 14 entsteht, ein freier Rückwärtsprimer 15 verwendet, der an das 3'-Ende des Komplements bindet. In Figur 1g ist gezeigt, dass das bereits synthetisierte Komplement 14 mit den Teilsequenzen A und B, das über eine Spacersequenz 6 und eine abasische Modifikation 7 auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 verbunden ist, mit einem zuvor frei in der Probe 12 vorhandenen Rückwärtsprimer 15 B' hybridisiert. Dabei hat der Primer 8 die Sequenz B' und ist mit der Teilsequenz B des Komplements 14 verbunden. Ausgehend vom Primer 8 mit der Sequenz B' synthetisiert die DNA-Polymerase eine Kopie des Originals 13. Die Synthese findet nur bis zur abasischen Modifikation 7 statt, da diese nicht von der Polymerase 11 überschrieben werden kann. In Figur 1g wird auch gezeigt, dass das Original 13 an eine weitere Primersequenz 5 A auf der Oberfläche des ersten Nanopartikels 3 gebunden hat und eine DNA-Polymerase 11 ausgehend von der Primersequenz 5 A ein weiteres Komplement 14 synthetisiert. Das Original 13, die Kopie des Originals 13 und die beiden mit dem ersten Nanopartikel verbundenen Komplemente 14 sind in Figur 1 h dargestellt. Eine nachfolgende Denaturierung durch Anregung der ersten Nanopartikel 3 führt dazu, dass das Original 13 und seine Kopie frei werden. Dabei können sowohl das Original 13 als auch seine Kopie in folgenden Schritten des Verfahrens als Vorlage zur Vervielfältigung dienen. Nach einer Wartedauer, die gegebenenfalls zur Hybridisierung von Original 13 und Kopien des Originals 13 mit Primersequenzen 5 A auf den ersten

Nanopartikeln 3 und von freien Primem B' mit auf den ersten Nanopartikeln 3 bereits elongierten Primersequenzen 5 nötig ist, kann mit einer weiteren Anregung der ersten Nanopartikel 3 der nächste Zyklus des Verfahrens durchgeführt werden. Vorzugsweise wird der Zyklus wiederholt, bis sich ausreichend viele verlängerte Primersequenzen 5 auf den ersten Nanopartikeln 3 befinden und/oder ausreichend viele Kopien des Originals 13 in der Probe 12 befinden, um einen Nachweis der erfolgten Vervielfältigung beziehungsweise des Vorhandenseins des Originals 13 in der Probe 12 durchführen zu können. Durch einen freien Primer 8 B' ist, wie in Figur 1g und 1 h gezeigt, eine exponentielle Vervielfältigung des Originals 13 möglich. In Figur 1a bis 1f ist ohne diesen freien Primer 8 jedoch nur eine lineare Vervielfältigung des nanopartikelgebundenen Komplements 14 zu erreichen.

In Figur 2 ist ein Aufbau dargestellt, der zur Durchführung des erfindungsgemäßen

Verfahrens geeignet ist. Der Aufbau enthält eine Lichtquelle, die in diesem Beispiel als Laser 16 ausgeführt ist und einen zweidimensionalen Spiegelscanner 17, der Licht von dem Laser 16 auf die Probe 12 lenken kann. Der zweidimensionale Spiegelscanner 17 kann dabei den Laserstrahl in zwei Dimensionen ablenken. Die Denaturierung in der Probe 12 geschieht in diesem Aufbau dadurch, dass ein Laserstrahl auf einen Teil der Probe 12 fokussiert wird. Im Laufe des Verfahrens wird der Laserstrahl so abgelenkt, dass er auf unterschiedliche Teile der Probe 12 trifft. In dem in Figur 2 gezeigten Beispiel wird der Laserstrahl durch den Spiegelscanner 17 so abgelenkt, dass der Laserstrahl das Reaktionsvolumen 2, in dem sich die Probe 12 befindet, zellenförmig abfährt. Der Weg, den der Laserstrahl zurücklegt wird in Figur 2 in der Probe 12 gestrichelt dargestellt. Dadurch, dass zu jedem Zeitpunkt des Verfahrens nur Teile der Probe 12 angeregt werden, können Laser 16 mit einer kleineren Leistung verwendet werden. Da Anregungen von unter einer ikrosekunde ausreichen, um DNA mit Hilfe von optothermisch geheizten Nanopartikeln 9 zu denaturieren, kann bei typischen Fokusdurchmessern eines Lasers 16 von etwa 10 bis 100 μπι ein Laserstrahl mit einer Geschwindigkeit von etwa 10 bis 100 m/s die Probe 12 abtasten und dabei an jedem Punkt, den der Laserstrahl überfährt, zu einer Denaturierung der DNA führen. Dies ermöglicht ein sehr schnelles Abtasten auch von großen Probenvolumina. Das komplette Abtasten einer Fläche von 1 cm ² dauert z.B. bei einem Fokusdurchmesser von 70 μπι und 128 Zeilen im Zeilenabstand von 78 μητι und einer Zeilenlänge von 1 cm bei einer

Geschwindigkeit des abtastenden Laserstrahls von 10 m/s nur 128 ms. Hat das Volumen z.B. eine Tiefe von 10 mm kann so ein Volumen von 1 ml prozessiert werden (hierzu muss natürlich u.a. sichergestellt werden, dass die Intensität der Anregung über die gesamte Tiefe ausreichend hoch ist). Dies ist vorteilhafterweise wesentlich kürzer als ein

Denaturierungsschritt durch globales Erhitzen in der Regel erfordern würde. Mit optischen Elementen wie z.B. einem in Figur 2 gezeigten Spiegelscanner 17 und sogenannten

F-Theta-Linsen können eine gute Homogenität der Fokusqualität und -große über die gesamte abgetastete Probe 12 erreicht werden. Alternativ zu einem kontinuierlich emittierenden Laser 16 kann auch ein gepulster Laser 16 oder ein thermischer Strahler eingesetzt werden.

In der Ausführung des Verfahrens, die in Figur 1 gezeigt ist, werden erste Nanopartikel 3 aus Gold mit einem Durchmesser von 60 nm mit Oligonukleotiden 4 ID1 funktionalisiert (nach J. Hurst et al., Anal. Chem., 78(24), 8313-8318, 2006, dessen diesbezüglicher Inhalt durch Verweis Teil der vorliegenden Offenbarung ist). Nach Funktionalisierung und 6

Waschschritten liegen die ersten Nanopartikel 3 in einer Konzentration von 200 pM in einem PBS Puffer (5 mM PBS, 10 mM NaCI, 0,01% Tween 20, pH 7,5) vor. Die

Vervielfältigungsreaktion wird in einem Gesamtvolumen von 10μΙ in 100 μΙ Probenröhrchen 18 durchgeführt (2 μΙ Apta Taq Mastermix 5x mit MgCI ₂ (bezogen von Roche), 1 μΙ NaCI 450 mM, 1 μΙ MgCI ₂ 90 mM, 1 μΙ Tween 20 1%ig, 2 μΙ Wasser, 1 μΙ der funktionalisierten ersten Nanopartikel 200 pM, 1 μΙ Oligonukleotid 4 ID2 5 μΜ als gelöster Rückwärtsprimer und 1 μΙ Oligonukleotid ID3 als zu vervielfältigendes Original 13). Dabei beträgt die zu bestimmende Konzentration des Originals 13 in dem Gesamtvolumen von 10 μΙ z.B. 0,1 fM des

Oligonukleotids ID3 gelöst in Wasser mit 100 nM Oligonukleotid 4 ID4 (Oligonukleotid 4 ID4 dient hierbei zur Absättigung von Oberflächen, z.B. während der Aufbewahrung des

Originals 13 vor der Reaktion). Wie in Figur 3 dargestellt, werden die Probenröhrchen 18 in einer Glasküvette 19 in einem Wasserbad 20 auf eine Temperatur von 64°C, was sowohl die Annealing- als auch die Elongationstemperatur darstellt, gebracht. Das Wasserbad 20 dient neben der Temperierung auch der besseren Einkopplung des Lasers 16 in die nicht-plane Oberfläche der Probenröhrchen 18. Das Wasser im Wasserbad 20 ermöglicht, dass der Brechungsindexunterschied zwischen dem Äußeren und dem mit PCR-Reaktionsmix gefüllten Inneren der Probenröhrchen 18 reduziert wird und somit eine Brechung des Laserstrahls und damit ein negativer Einfluss auf die Fokusqualität und -schärfe unterdrückt wird. Dadurch wird mit Vorteil das Einkoppeln des Lasers 16 verbessert. Der Laser 16, der zum Anregen der Nanopartikel dient, ist ein frequenzverdoppelter diodengepumpter Nd:YAg-Laser (CNI Lasers Inc.), der bei einer Ausgangsleistung von 2,5 W mit einer F- Theta-Linse (Jenoptik, Brennweite 100 mm) hinter einem Spiegelscanner 17 (Cambridge Technologies, Pro Series 1 ) in die Probenröhrchen 18 im Wasserbad 20 fokussiert wird (Fokusdurchmesser circa 20 μιη). Der Spiegelscanner 17 erlaubt, den Fokus zeilenweise durch die Probenröhrchen 18 zu bewegen, wie auch schon in Figur 3 gezeigt, und somit das gesamte PCR-Reaktionsvolumen an der optothermischen Vervielfältigung zu beteiligen. Pro Probenröhrchen 18 werden 680 Zeilen mit einem Abstand von circa 12 μιτι bei einer Zeilengeschwindigkeit in dem Probenröhrchen 18 von circa 10 m/s mit dem Fokus abgefahren. Dies entspricht einem Zyklus im ersten Probenröhrchen 18. Anschließend werden nacheinander alle anderen Probenröhrchen 18 abgefahren, so dass jedes Probenröhrchen 18 einen Zyklus erfahren hat. Nach einer Wartedauer, die in jedem

Probenröhrchen 18 anders gewählt werden kann wird der nächste Zyklus gestartet. Dies kann für jedes Probenröhrchen unterschiedlich oft wiederholt werden.

Figur 6 zeigt Daten für fünf verschiedene Probenröhrchen, die als Ausgangskonzentration des Originals ID3 jeweils 0,1 fM enthalten. Im ersten Probenröhrchen werden insgesamt 200 Zyklen mit einer Wartedauer von 3 s zwischen den einzelnen Zyklen durchgeführt, im zweiten Probenröhrchen 120 Zyklen ä 5 s, im dritten Probenröhrchen 90 Zyklen ä 6,6 s, im vierten Probenröhrchen 60 Zyklen ä 10 s und im fünften Probenröhrchen 45 Zyklen ä 13,3 s. Dies ist in Figur 6b dargestellt. Die Beschriftung unter den Diagrammen gibt jeweils die Wartezeit an. Die Gesamtdauer vom ersten bis zum letzten Zyklus ist in jedem der fünf Probenröhrchen 10 Minuten. Dies ist in Figur 6a dargestellt. Um die Gesamtvervielfältigung durch die optothermische Vervielfältigungsreaktion zu bestimmen, wird nach Ende der Vervielfältigungsreaktion aus jedem Probenröhrchen 1 μΙ der Probe entnommen und in 99 μΙ Wasser verdünnt. Aus dieser Verdünnung wird nun jeweils 1 μΙ in eine quantifizierende Vervielfältigungsreaktion (Real-Time-PCR) eingesetzt um dort die Konzentration der Kopien des Originals zu bestimmen, die in den verschiedenen Probenröhrchen durch die

optothermische Vervielfältigungsreaktion erzeugt wurden. Die Verdünnung dient dazu, gegebenenfalls inhibierende oder Störende Inhaltsstoffe aus der optothermischen

Vervielfältigungsreaktion stark zu verdünnen, so dass sie in der anschließenden

quantifizierenden Vervielfältigungsreaktion nicht mehr stören können. Die quantifizierende Vervielfältigungsreaktion wird in einem LightCycler II (Roche) durchgeführt. Hierbei besteht ein Zyklus aus 10 s Denaturierung bei 94°C, 10 s Annealing bei 62°C und 10 s Elongation bei 72°C. Am Ende des 72°C-Schittes wird auch die Messung der Fluoreszenz durchgeführt. Vor Beginn des ersten Zyklus erfolgt ein einmaliger Denaturierungsschritt bei 94°C für 30 s. Neben 1 μΙ der verdünnten Kopien des Originals aus der optothermischen

Vervielfältigungsreaktion enthält 10 μΙ Reaktionsvolumen für die quantifizierenden

Vervielfältigungsreaktion 2 μΙ Apta Taq Mastermix 5x mit MgCI ₂ (bezogen von Roche), 2,8 μΙ Wasser, 2 μΙ Oligonukleotid 4 ID5 1 μΜ als gelöster Vorwärtsprimer, 2 μΙ Oligonukleotid 4 ID6 1 μΜ als gelöster Rückwärtsprimer und 0,2 μΙ SYBRGreen 100x als interkalierender Farbstoff, um das PCR-Produkt während der Real-Time-PCR detektierbar zu machen. Eine Zusätzliche Standardkurve, die mit einer Verdünnungsreihe bekannter Konzentrationen von Oligonukleotid ID3 als Original für die quantifizierenden Vervielfältigungsreaktion bestimmt wird, erlaubt die anschließende Quantifizierung der eingesetzten Kopien in die

quantifizierende Vervielfältigungsreaktion. Hiermit wird die Gesamtvervielfältigung bestimmt, die während der optothermischen Vervielfältigungsreaktion in den unterschiedlichen

Probenröhrchen erzeugt wurde. Dies ist in Figur 6d dargestellt. Hier ist deutlich zu sehen, dass die Gesamtvervielfältigung trotz gleicher Prozesszeit (jeweils 10 Minuten, vgl. Fig. 6 a) mit zunehmender Zyklendauer (und dabei abnehmender Zyklenzahl) stark abnimmt. Unter der Annahme, dass über die gesamte Vervielfältigungsreaktion der Vervielfältigungsfaktor pro Zyklus konstant bleibt errechnet sich der Zugewinn je Zyklus g aus Formel (2). Das so bestimmte g ist in Figur 6c dargestellt. Hier ist klar zu erkennen, dass g mit steigender Zyklendauer zunimmt. Trotz des abnehmenden g mit abnehmender Zyklendauer nimmt die Gesamtvervielfältigung bei gleicher Prozessdauer mit abnehmender Zyklendauer zu.

Figur 4 zeigt das idealisierte Temperaturprofil einer herkömmlichen PCR (gestrichelte Linie) mit einer Zyklusdauer von t _Cf = 15 s. Für die Temperatur-Flanken wurde eine konstante Steilheit von 5 K/s angenommen. Im Vergleich hierzu ist eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen PCR-Verfahrens mit Zyklusdauer t _Cfi = 2 s dargestellt mit einer konstanten Steilheit der Temperaturflanken von 3000K/s, wie sie sich z.B. durch die erfindungsgemäße optische Anregung von Nanopartikeln erreichen lassen (durchgezogene Linie; für bessere Erkennbarkeit wurde das Temperaturprofil um 1 °C nach unten verschoben).

Figur 5 zeigt den Vervielfältigungs-Faktor N _k /N ₀ als Funktion der Zeit für unterschiedliche Parameter. Die gepunktete Linie zeigt die Vervielfältigung einer typischen konventionellen PCR bei einer Zyklusdauer von t _Ch = 25 s und einem Zugewinn je Zyklus von g _h =

100%. Die gestrichelte Linie zeigt die Vervielfältigung bei einer bevorzugten

erfindungsgemäßen Umsetzung mit gi = 25%, x = 4 und t _Ci = = 6,25 s. Die

durchgezogene Linie zeigt eine andere bevorzugte erfindungsgemäße Umsetzung mit g _t = 100%, x = 2 und t _c . = ^ = 12,5 s.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und den Zeichnungen offenbarten Merkmale können sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein. Bezugszeichenliste

1 Nukleinsäure

2 Reaktionsvolumen

3 erste Nanopartikel

4 Oligonukleotid

5 Primersequenz

6 Spacersequenz

7 Abasische Modifikation

8 Vorwärtsprimer

9 Nanopartikel

10 Füllmolekül

11 DNA-Polymerase

12 Probe

13 Original, Amplikon

14 Komplement

15 Rückwärtsprimer

16 Laser

17 Spiegelscanner

18 Proberöhrchen

19 Glasküvette

20 Wasserbad

Sequenzen

(von 5' nach 3')

ZiSp9/= abasische Modifikation„Space r9"

I D1 : 5'-Thiol - AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA /iSp9/ /iSp9/

GTTCAGGCACAGCACATCA

ID2: GCTCACACCGATACCATCAGCG

ID3:

TGCGACGCTCACACCGATACCATCAGCGATCTCTTTGATGTGCTGTGCCTGAAC CGTTA

ID4: CATGCCTGCACCCGTTCCACC

ID5: GTTCAGGCACAGCACATCA

ID6: CGCTCACACCGATACCATCA