Beschreibung

Die Erfindung betrifft Peptide des Antigens CENP-A (CENtromer Protein-A), die von Autoantikörpern in biologischen Flüssigkeiten gebunden werden, insbesondere von Autoantikörpern in Körperflüssigkeiten von Patienten mit systemischer Sklerose (SSc).

Ferner betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Peptide und ihrer Folgeprodukte für die Diagnostik von SSc und verwandten Autoimmunerkrankungen sowie zur Differenzial- und Ausschlussdiagnostik. Weiterhin betrifft die Erfindung die Verwendung dieser Peptide für die Immunabsorption, als Vakzine zur Erzeugung von Toleranz sowie als immunogene und antigene Komposition für die Herstellung von Antikörpern in-vivo und in-vitro.

Hintergrund der Erfindung und bekannter Stand

Unter Sklerosen versteht man eine Verhärtung von Organen oder Gewebe durch eine Vermehrung des Bindegewebes. Als Ursachen gelten Gewebsschädigungen in der Folge von Entzündungen, von Durchblutungsstörungen oder auch von Alterungsprozessen, ebenso aufgrund von Autoimmunerkrankungen.

Bei der diffusen systemischen Sklerose (dSSc) handelt es sich um eine Systemerkrankung des Bindegewebes mit Kollagenanhäufung und Fibrose von Haut und inneren Organen und obliterierende Angiopathie (arterielle Verschlusskrankheit) mit Haut- und Organinfarkten (nach Pschyrembel: Klinisches Wörterbuch 2007, 261. Aufl.).

Autoantikörper (AAK) gegen Zentromer-Proteine (CENP), auch als ACA (anti-centromere antibodies) bekannt, gelten als spezifische Marker für die limitierte Form der systemischen Sklerose (ISSc). CENP-A, -B und -C sind als Hauptantigene der gegen die Zentromerproteine gerichteten Autoimmunreaktion beschrieben. ACA treten vorwiegend in ISSc Patienten und im CREST-Syndrom {Calcinosis cutis, Raynaud-Syndrom, Esophageale Dysfunktion, Skier odaktylie, Teleangiektasia) auf (Ho KT, Reveille JD. Arthritis Res Ther 2003; 5:80-93). Die Antikörper können mittels indirekter Immunfluoreszenz auf HEp-2-Zellen (als Monolayer wachsende humane Larynxkarzinomzellen) und Immunoassays mit rekombinanten Antigenen nachgewiesen werden. Derzeit gilt das rekombinante CENP-B als gängiges Antigen für die Bestimmung der Antikörper (Stahnke G, et al, J Autoimmun. 1994, 7:107-18; DE 69324509 T2 / EP 552829 Bl : "CENP-B-Peptid", Patentinhaber: Akzo Nobel N. V., Arnheim /Arnhem, NL; Erfinder: Verheyen, Ronald u.a.).

In einigen Studien wurden ACA auch in Patienten mit systemischem Lupus Erythematodes (SLE) und Primär biliäre Zirrhose (PBC) beschrieben. Die berichtete Prävalenz in SLE lag bei bis zu 10% und in PBC bis zu 60% (Tojo J, et al. Hepatol Res. 2002, 22:187-195).

CENP-A stellt nach Sullivan et al. ein Protein der Sequenz

1 mgprrrsrkp eaprrrspsp tptpgpsrrg pslgasshqh srrrqgwlke irklqksthl

61 lirklpfsrl areicvkftr gvdfnwqaqa llalqeaaea flvhlfeday lltlhagrvt

121 lfpkdvqlar rirgleeglg

dar (Sullivan, K.F., Hechenberger, M. and Masri, K.: Human CENP-A contains a histone H3 related histone fold domain that is required for targeting to the centromere, J. Cell Biol. (1994) 127 (3), 581-592).

CENP-A weist im C-terminalen Teil eine große Sequenzähnlichkeit mit Histon Protein H3 auf, welches als Ziel von Autoantikörpern in Seren von SLE Patienten bekannt ist. Daher besteht bei der Verwendung von CENP-A als Voll-Lange Antigen (nativ oder rekombinant) die Gefahr, kreuzreaktive anti-Histon Antikörper zu detektieren.

In zahlreiche Studien wurde die Epitopverteilung auf dem CENP-A Protein untersucht. Unabhängige Studien konnten mit rekombinanten Fragmenten und synthetischen Peptiden verschiedene Epitope im N-terminalen Bereich des CENP-A identifizieren. Innerhalb von zwei Hauptepitopregionen wurde das Epitopmotif G/A-P-R/S-R-R, das sich dreimal innerhalb dieser Regionen wiederholt, beschrieben (Mahler M, et al. Clin Immunol 2003; 107:65-79).

In einer Verlaufsstudie eines Patienten mit SSc konnte die Entstehung der ACA auf Peptidebene beschrieben werden. Diese verlief über eine Epitop Diversifizierung von Histon H3 über ein Epitop im H3 homologen Bereich auf den N-terminalen Bereich von CENP-A und anschließend auf CENP-B. Im ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) konnten die ACA mit einem CENP-A Peptid früher detektiert werden, als es mit rekombinantem CENP-B möglich war (Mahler M et al. Arthritis Rheum 2002; 46:1866-72).

In einer weiteren Studie wurden 263 ACA positive Proben mit einem ELISA basierend auf einem rekombinant hergestellten CENP-A Protein getestet. 93,5 % der Proben waren positiv für anti-CENP-A Antikörper (Akbarali Y, J Autoimmun 2006; 27:272-80). Von diesen 246 anti-CENP-A positiven Proben waren 219 (89%) positiv in einem CENP-A Peptid-ELISA. Dieser ELISA basierte auf einem multimeren CENP-A Peptid bestehend aus den Aminosäuren 17-30 (SPSPTPTPGPSRRG). Die technische Sensitivität des Peptid-ELISAs in dieser Studie lang somit bei nur 83,3% (219 von 263 ACA positiven Proben waren positiv). Über die klinische Sensitivität und Spezifität der resultierenden ELISAs lässt sich in dieser Studie keine Aussage treffen, da ACA positive Seren vorselektioniert wurden. Ferner wurde kein aussagekräftiges Kontrollkollektiv, sondern ausschließlich sechs Negativ-Seren getestet. Als MAP™ ELISA zeigte das Peptid nur eine Spezifität von 50%. Als mögliche Ursache wurde eine erhöhte Hintergrundreaktion durch das Poly-Lysin Grundgerüst des verwendeten Konstruktes diskutiert.

Mimotope des CENP-A Epitop-Motifs wurden auch auf zahlreichen anderen Autoantigenen und auf dem Epstein-Barr nuclear antigen 1 (EBNA-I) identifiziert. Einige dieser Motive sind untereinander kreuzreaktiv. Wesen der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die Diagnosemöglichkeiten für systemische Sklerosen zu erweitern und sie gegenüber verwandten Kollagenosen zu verbessern.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch die Merkmale der Ansprüche realisiert. Demnach liegen der Erfindung Peptide des N-terminalen Bereichs des Zentromerproteins CENP-A (CENtromer Protein-A) zugrunde, die von Autoantikörpern in biologischen Flüssigkeiten gebunden werden und die zur Diagnostik systemischer Sklerosen (SSc) und verwandter Autoimmunerkrankungen geeignet sind. Überraschenderweise wurden im N-terminalen Bereich von CENP-A solche Peptide gefunden, die Autoantikörper in Seren von SSc-Patienten binden.

Die erfindungsgemäßen Peptide sind dadurch charakterisiert, dass sie aus den Aminosäure- Bereichen 2 - 40 stammen und alle Sequenzen von 15 oder mehr Aminosäuren umfassen.

Ein bevorzugtes Peptid besteht aus der Aminosäuresequenz SPSPTPTPGPSRRGPSLGAS. Des Weiteren betrifft die Erfindung Peptide, die aus dieser Sequenz oder aus Teilen davon bestehen und aus solchen Peptiden, die Aminosäureaustauschprodukte enthalten, ohne die antigenen Eigenschaften zu verändern.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht in der Verwendung der besagten Peptide zu Diagnosezwecken, vor allem zur Diagnose von Patienten mit systemischen Sklerosen (SSc) und verwandten Autoimmunerkrankungen, auch zur Differentialdiagnose von Patienten mit Kollagenosen sowie zur Differenzial- und Ausschlussdiagnostik, insbesondere zur Unterscheidung von Patienten mit SSc und SLE. In die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide fällt auch der Einsatz von multimeren Peptiden oder einer Verbindung dieser Peptide mit Trägermolekülen in immunogenen Kompositionen. Dazu gehören insbesondere über einen poly-Lysin- Anker verbundene Mehrfach-Peptide sowie Konjugationen an Trägerproteine wie Rinderserum Albumin (RSA oder BSA), humanes Serumalbumin oder Keyhole limpet hemocyanin (KLH). Durch den Einsatz von Mehrfach-Peptiden sowie Konjugationen an Trägerproteine lassen sich Peptide besser an Oberflächen (z.B. Mikrotiterplatten) binden. Die erfindungsgemäßen Peptide eignen sich auch als wirksamer Bestandteil von Vakzinen zur Erzeugung von Toleranz, als Absorptionsmittel zur Absorption von Autoantikörpern aus den Seren von Patienten mit ACA sowie als immunogene und antigene Komposition für die Herstellung von Antikörpern in-vivo und in-vitro.

Peptide sind geeignete Moleküle zur Erzeugung von Toleranz in Patienten mit Autoimmun- erkrankungen und zirkulierenden Autoantikörpern (Bisceglie MB et al. Pemphigus: The promises of peptide immunotherapy Immunopharmacol Immunotoxicol. 2009). Des Weiteren können Autoantikörper durch spezifische oder semi-spezifische Immunabsorption in der Plasmaphorese entfernt werden (Elliott JD et al., Semi-specific immunoabsorption and monoclonal antibody therapy in ANCA positive vasculitis: experience in four cases. Autoimmunity. 1998;28(3): 163-71). Die erfindungsgemäßen Peptide eignen sich daher für die Immunabsorption und damit zur Entfernung von Autoantikörpern aus den Seren von Patienten mit systemischen Autoimmunerkrankungen mittels Plasmaphorese und verwandten Verfahren. Antikörper gegen körpereigene Peptide lassen sich als molekularbiologische Werkzeuge zur Erforschung zellulärer Prozesse einsetzen. Die erfϊndungsgemäßen Peptide eignen sich auch als wirksames Immunogen zur Herstellung von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern für zellbiologische Untersuchungen.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht in der Bereitstellung von Test-Kits für die Diagnose von Patienten mit SSc und verwandten Erkrankungen durch die Detektion von Autoantikörpern mit Hilfe der erfindungsgemäßen Peptide. Derartige Kits lassen sich auch zur Differenzierung zwischen SSc und SLE einsetzen.

Ein weiteres Merkmal der Erfindung besteht darin, dass Verfahren zum Nachweis von Anticentromer-Autoantikörpern in Testflüssigkeiten zur Verfügung gestellt werden. Dazu werden die erfϊndungsgemäßen Peptide mit einer Testflüssigkeit in Kontakt gebracht und dann die entstandenen Immunkomplexen gemessen / nachgewiesen. Ein erfϊndungsgemäßes Verfahren zur Diagnostik systemischer Sklerosen (SSc) und verwandter Autoimmunerkrankungen beruht darauf, dass die besagten Peptide von Autoantikörpern in biologischen Flüssigkeiten gebunden werden.

Ein weiteres Verfahren besteht darin, dass zur Überwachung einer Behandlung oder eines Krankheitsverlaufs ein wiederholtes Testen zur Überprüfung des Titers der Autoantikörper erfolgt.

Ein weiteres Verfahren besteht in dem Nachweis von ACA in Testflüssigkeiten, wobei die erfindungsgemäßen Peptide mit der Testflüssigkeit und damit mit möglichen ACA in Kontakt gebracht werden und die Anwesenheit von Immunkomplexen gemessen wird.

Unter den erfϊndungsgemäßen Peptiden spielt die Sequenz aus 20 Aminosäuren - das Peptid SPSPTPTPGPSRRGPSLGAS - wegen seiner überraschend positiven Effekte (klinisch sichere SSc-Diagnose, Unterscheidung von SSc und anderen Kollagenosen) - eine besondere Rolle, weil sich an ihm die erwünschten Eigenschaften besonders gut erkennen lassen.

Das Ergebnis der Erfindung liegt darin, dass es gelungen ist, spezifische Peptide des Antigen CENP-A bereitzustellen, wobei diese Peptide und ihre Folgeprodukte sich für die Diagnose von SSc als besonders gut geeignet erwiesen haben. Des Weiteren ermöglicht es die Erfindung, auf der Basis der Peptide einen einfachen, schnell durchführbaren und klinisch sicheren Test zur Diagnose von SSc zu entwickeln. Außerdem gelingt es mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens überraschenderweise, Patienten mit SSc und verwandten Kollagenosen besser zu unterscheiden.

Als Folgeprodukte der erfindungsgemäßen Peptide werden solche verstanden, in denen eine oder mehrere Aminosäuren durch andere Aminosäuren oder Aminosäuren- Analoge oder durch Derivate ersetzt worden sind, wie Säureadditionssalze (mit geeigneten anorganischen oder organischen Säuren hergestellte physiologisch verträgliche Salze), Ester, Amide oder N-Acyl- Derivate.

Die Merkmale der Erfindung gehen aus den Elementen der Ansprüche und aus der Beschreibung hervor, wobei sowohl einzelne Merkmale als auch mehrere in Form von Kombinationen vorteilhafte Ausführungen darstellen, für die mit dieser Schrift Schutz beantragt wird. Die Erfindung besteht in einer Kombination aus bekannten (CENtromer Protein-A, CENP-Peptide, ELISA,) und neuen Elementen (neue CENP-A-Peptide, Differenzial- und Ausschlussdiagnostik SSc - SLE, CENP-A-ELISA), die sich gegenseitig beeinflussen und in ihrer neuen Gesamtwirkung einen Gebrauchsvorteil und den erstrebten Erfolg ergeben, der darin liegt, dass die erfindungsgemäßen Peptide zur Differentialdiagnose von Patienten mit Kollagenosen geeignet sind und es überraschenderweise gelingt, Patienten mit SSc und verwandten Kollagenosen besser zu unterscheiden.

Die Erfindung soll anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden, ohne auf diese Beispiele beschränkt zu sein.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Die Herstellung der Peptide erfolgt gemäß der üblichen Verfahren zur Peptidsynthese nach Merrifield (R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85 (1963), 2149).

Die Qualitätskontrolle der Peptide erfolgt durch Prüfung der Peptide im„Enzyme-linked immunosorbent assay" (ELISA).

Die Mikrotiterplatten wurden mit 0,2 μg/mL Peptid über Nacht bei 4°C beschichtet. Überschüssiges Peptid wurde durch Waschzyklen entfernt. Unspezifische Bindungsstellungen wurden anschließend abgeblockt und die Platten durch Trocknung bei 37° für 2 Stunden konserviert. Zur Lagerung der Platten wurden die Peptid-beschichteten Mikrotiterplatten mit Trockenmittel in Aluminiumbeutel eingeschweißt.

Zu Beginn werden Patientenproben (1 :101 verdünnt), Kontrollen und der Kalibrator (unverdünnt) in den Kavitäten inkubiert. Während dieser Zeit binden im Serum enthaltene anti- CENP-A Antikörper an das festphasengebundene CENP-A. Nach einem Waschzyklus wird anti-IgG Meerrettich Peroxidase (HRP) Konjugat zugegeben, das spezifisch an die anti-CENP Antikörper bindet. Nach einem erneuten Waschzyklus zur Entfernung des überschüssigen Konjugates wird die Substratlösung zugegeben. Dadurch kommt es zur Umsetzung des Substrates und somit zu einer blauen Farbentwicklung. Durch Zugabe der Stopplösung schlägt die Färbung von blau nach gelb um. Die Bildung des Farbstoffs ist direkt proportional zur Menge der gebundenen anti-CENP-A Antikörper und kann spektralphotometrisch bei 450 nm bestimmt werden.

Parallel zu den Patientenproben wird ein Kalibrator mit bekannter Konzentration an anti- CENP-A Antikörpern getestet. Durch das Verhältnis der optischen Dichte (OD) zwischen dem Kalibrator und den Patientenproben können die Konzentrationen der anti-CENP-A Antikörper semi-quantitativ bestimmt werden. Die OD [Δ 450 nm - 620 nm] Werte jeder Patientenprobe sowie der Kontrollen werden durch den OD Mittelwert des Kalibrators dividiert und mit dem Berechnungsfaktor multipliziert. Daraus ergibt sich das zu interpretierende Ergebnis der Patientenprobe. Bei den Werten handelt es sich um relative Einheiten (relative units), die abgekürzt als RU angegeben werden.

Beispiel 2

Zunächst wurden verschiedene potentielle Marker-Peptide basierend auf der Aminosäuresequenz des CENP-A synthetisiert, die sich in Länge, Aminosäuresequenz und Form unterschieden. Neben linearen Peptiden wurden auch Multiple Antigen Peptide (MAP) hergestellt. Dazu wurde ein Linker gewählt, der während der Synthese ein Vierfach-Peptid entstehen lässt.

Tabelle 1 : Übersicht der untersuchten Peptide

biotinyliert; # MAP

Alle CENP-A Peptide wurden in verschiedenen Konzentrationen (zwischen 0,2 und 2,0 μg/mL) auf Mikrotiterplatten beschichtet und die resultierenden Platten mit ACA positiven und negativen Patientenproben ausgetestet. Alle Peptide zeigten unterschiedliche Reaktionen mit den Patientenseren insbesondere in Abhängigkeit von der Beschichtungskonzentration. Basierend auf einem CENP-A Peptid (F02-4) wurde ein Prototyp ELISA für die Detektion von ACA entwickelt.

Beispiel 3

Bei der Austestung von 100 SSc Patienten Proben mittels Immunfluoreszenz wurden 20 Proben mit zentromerem Fluoreszenzmuster identifiert. In 19/20 konnten die ACA mittels LIA (line immunoassay) mit rekombinantem CENP-B bestätigt werden. Alle 19/19 (100%) der Proben waren anti-CENP-A Peptid positiv.

Beispiel 4

Seren von Patienten mit Systemsklerose (n=131) und Kontrollen (n=134) wurden auf anti- CENP-B und anti-CENP-A Antikörper (neuer Peptid- Assay) im direkten Vergleich gestestet. Die anschließende ROC (Receiver operating characteristic) Analyse zeigt überraschenderweise eine deutlich bessere Differenzierung zwischen SSc- und SLE- Patienten (0.81 für CENP-A vs. 0.53 für CENP-B). Die Differenz der AUC (Area under the curve) aus der ROC Analyse liegt bei 0.28 (p < 0,0001) (siehe Figur 1).

Anschließend wurden weitere Proben im anti-CENP-A Peptid-ELISA ausgetestet und die Ergebnisse mittels ROC Analyse ausgewertet. Die ROC Kurve zeigt eine gute Differenzierung zwischen SSc Patienten (n=137) und Kontrollen (n=316) mit einem AUC Wert von 0,84 (siehe Abbildung 2). Die Sensitivität und Spezifität wurde mit 38,7% und 97,2% berechnet.

Tabelle 2: Ergebnisse der klinischen Evaluierung des CENP-A Prototyp ELISAs

SSc = Systemsklerose; SLE = systemischer Lupus Erythematodes; RA = Rheumatoide Arthritis; SjS = Sjögren Syndrom; Beispiel 5

Proben von Patienten mit ISSc und dSSc wurden im CENP-A und CENP-B ELISA im parallelen Ansatz getestet. Der Vergleich der Ergebnisse zeigt, dass mit dem CENP-A Peptid besser zwischen den beiden Verlaufsformen differenziert werden kann (AUC 0.94 vs. 0.87). Diese Differenzierung ist maßgeblich für die Behandlung und Prognose der Patienten.

Beispiel 6

Seren von Patienten mit SSc (n=131) und SLE (n=109) wurden mit dem CENP-A und CENP- B ELISA getestet. Überraschenderweise zeigt der CENP-A ELISA eine deutlich bessere Differenzierung zwischen SSc- und SLE-Patienten (0.79 für CENP-A vs. 0.54 für CENP-B) (siehe Figur 5). Die Differenz der AUC aus der ROC Analyse liegt bei 0.25 (p < 0.0001).

Beispiel 7

Seren von Patienten mit ACA bestimmt mit indirekter Immunfluoreszenz und bestätigt im ELISA mit rekombinantem CENP-B, Krankheitskontrollen und Proben von gesunden Spendern wurden parallel mit rekombinantem CENP-A und dem CENP-A Peptid gestestet. Das CENP-A Peptid zeigt eine deutliche Überlegenheit in der Differenzierung zwischen ACA positiven Proben und Krankheitskontrollen (siehe Figur 6).

Erläuterung der Figuren

Figur 1:

Vergleichende Receiver operating characteristic (ROC) Analyse. Differenzierung zwischen Patienten mit Systemsklerose (SSc; n=35) und Kontrollen (n=208) gemessen im direkten Vergleich (CENP-A Peptid vs. CENP-B rekombinantes Protein).

Figur 2:

Receiver operating characteristic (ROC) Analyse. Differenzierung zwischen Patienten mit Systemsklerose (SSc; n=137) und Kontrollen (n=316) gemessen mit dem erfindungsgemäßen CENP-A ELISA. Figur 3:

Anti-CENP-A Reaktivität in verschiedenen Krankheitsgruppen. Die Reaktivität gegen das neue CENP-A Peptid ist in Patienten mit SSc signifikant höher im Vergleich zu den Kontrollgruppen.

Figur 4:

Receiver operating characteristic (ROC) Analyse. Differenzierung zwischen Patienten mit diffuser und limitierter Form der Systemsklerose (SSc) gemessen mit dem CENP-B ELISA und dem erfindungsgemäßen CENP-A Peptid ELISA (F02.4).

Figur 5:

Vergleichende Receiver operating characteristic (ROC) Analyse des CENP-A und CENP-B ELISAs zur Differenzierung zwischen SSc und SLE. Figur 6:

Vergleich zwischen rekombinantem (rCENP-A) und synthetischem CENP-A (Peptid, sCENP- A).

Abkürzungsverzeichnis

AAK Autoantikörper

ACA anti-centromere antibodies

AUC Area under the curve

CENP Zentromerprotein(e) / CENtromer Protein

CENP-A CENtromer Protein-A

CENP-B CENtromer Protein-B

dSSc diffuse systemische Sklerose

ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay

HD "Healthy donors" - Gesunde Spender

LIA line immuno assay

ISSc limitierte Form der diffusen systemischen Sklerose

MAP Multiple Antigen Peptide OD optische Dichte

PA Polyarthritis

PBC Primär biliäre Zirrhose

RA Rheumatoide Arthritis

rCENP-A rekombinantes CENP-A

ROC Receiver operating characteristic

RU relative Einheiten / relative units sCENP-A synthetisches CENP-A

SjS Sjögren-Syndrom

SLE systemischer Lupus erythematodes

SSc systemische Sklerose