PROTEIN AUS PENICILLIUM OLSONII, DAS RESISTENZ GEGEN 2-DEOXYGLUCOSE VERLEIHT Beschreibung Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteine, die eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose verleihen, Nukleinsäuresequenzen kodierend für besagte Proteine, transgene Expressionskassetten umfassend besagte Nukleinsäuresequenzen sowie transgene Organis- men transformiert mit besagten Expressionskassetten. Ferner betrifft die Erfindung Verfahren zur Selektion genetisch trans- formierter Zellen unter Verwendung besagter Expressionskassetten basierend auf der Steigerung der Resistenz gegenüber 2-Deoxy- glucose (2-DOG).

Das Einführen von genetischem Material in Zielzellen gelingt meist nur für eine sehr begrenzte Anzahl von Zellen einer Popu- lation bzw. eines Gewebes. Dies macht die Unterscheidung und Iso- lierung von erfolgreich transformierten von nicht transformierten Zellen erforderlich, ein Verfahren, das als Selektion bezeichnet wird. Traditionell erfolgt die Selektion mittels einer sogenann- ten"positiven Selektion", wobei die nicht-transformierte Zellen entweder stark geschädigt bzw. abgetötet werden und nur die transformierte Zelle die entsprechende Resistenz erwirbt, damit überlebt und sich teilen kann oder nur die transformierte Zelle einen Wachstumsvorteil erhält. Üblicherweise wird eine derartige positive Selektion durch Gene realisiert, die für eine Resistenz gegen ein Biozid (z. B. ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glypho- sat oder Bromoxynil, einen Metabolismusinhibitor wie 2-Deoxyglu- cose (2-DOG ; WO 98/45456) oder ein Antibiotikum wie Tetracyclin, Ampicillin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygro- mycin) kodieren. Derartige Gene werden auch als positive Selek- tionsmarker bezeichnet.

Das Gen des positiven Selektionsmarkers wird mit der in das Zellgenom einzuführenden Nukleinsäuresequenz gekoppelt (physi- kalisch oder mittels Cotransformation) in die Zelle eingebracht.

Anschließend werden die Zellen auf einem Medium unter dem ent- sprechenden Selektionsdruck (d. h. in Gegenwart eines entsprechen- den Antibiotikums oder Herbizids) kultiviert, wodurch die trans- formierten Zellen aufgrund der erworbenen Resistenz gegen besag- ten Selektionsdruck einen Wachstums-/Überlebensvorteil haben und so selektioniert werden können. Beispielhaft als positive Selek- tionsmarker seien genannt :

Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT) (auch Bialophos- Resistenzgen (bar) genannt), welche die freie Aminogruppe des Glutaminsynthaseinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylieren und damit eine Detoxifizierung des PPT erreichen (de Block et al. (1987) EMBO J 6 : 2513-2518).

5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasen (EPSP Synthase- gene), die eine Resistenz gegen das nicht-selektive Herbizid Glyphosat (N- (phosphonomethyl) glycin) verleihen (Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate ; A literature analysis, p. 48-74. In : Grossbard E und Atkinson D (eds. ) The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston). Glyphosat-tolerante EPSPS Varianten zur Verwendung als Selektionsmarker sind beschrie- ben (Padgette SR et al. (1996) New weed control opportuni- ties : development of soybeans with a Roundup Ready'gene. In : Herbicide Resistant Crops (Duke SO, ed. ), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL).

Neomycinphosphotransferasen verleihen eine Resistenz gegen Antibiotika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygromycin, Paromomycin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphory- lierungsreaktion deren inhibierende Wirkung reduzieren (Beck et al. (1982) Gene 19 : 327-336).

Sulfonylharnstoff-und Imidazolinon tolerante Acetolactat- synthasen (Sathasivan K et al. (1990) Nucl Acids Res 18 (8) : 2188).

Darüber hinaus sind Resistenzgene gegen die Antibiotika Hygromy- cin (Hygromycinphosphotransferasen), Chloramphenicol (Chloramphe- nicolacetyltransferase), Tetracyclin, Streptomycin, Zeocin, Ampi- cillin (ß-Lactamase Gen ; Datta N, Richmond MH (1966) Biochem J 98 (1) : 204-9) beschrieben.

Gene wie das Isopentenyltransferasegen (ipt) aus Agrobakterium tumefaciens (Genbank Acc. -No. : AB025109) können ebenfalls als sogenannte"positive"Selektionsmarker eingesetzt werden. Sie verschaffen den transformierten Zellen einen Wachstumsvorteil, ohne dass die nicht-transformierten Zellen abgetötet werden. Das ipt-Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokinin-Biosynthese. Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z. B.

Selektion auf Cytokinin-freiem Medium) (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94 : 2117- 2121). Nachteilig ist hier, dass eine strenge Regulation der Genexpression erforderlich ist, an- dernfalls beeinträchtigt eine nicht-optimal kontrollierte Cyto-

kininbiosynthese den Regenerationserfolg oder zumindest den Phänotyp der Regeneranten.

Verschiedene weitere positive Selektionsmarker sind u. a. in EP-A 0 601 092 beschrieben. Beispielhaft sind zu nennen ß-Glucu- ronidase (in Verbindung mit z. B. Cytokininglucuronid), Man- nose-6-phosphat-Isomerase (in Verbindung mit Mannose), UDP-Galak- tose-4-Epimerase (in Verbindung mit z. B. Galactose).

2-Deoxyglucose (2-DOG) ist ein-abgesehen von einer Hexokinase vermittelten Phosphorylierung-nicht-metabolisierbares Glucosea- nalogon. Die Applikation von 2-DOG zu lebenden Zellen führt zur Bildung von 2-DOG-6-phosphat (2-DOG-6-P). 2-DOG-6-P inhibiert die Glykolyse und die Proteinbiosynthese, interferiert mit der Pro- teinglycosylierung und stört die Biosynthese von Zellwandpolysac- chariden wie Mannanen und damit die Zellwandbildung. Phänotypisch resultiert eine Inhibition der Sprosselongation und der Wurzel- bildung.

Das Gen DOGR1 aus Saccharomyces cerevisiae (Genbank Acc. -No. : NC001140, Chromosom VIII S. cerevisiae Position 194799-194056) kodiert für eine 2-DOG-6-P-Phosphatase. Das Enzym ermöglicht die Dephosphorylierung von 2-DOG-6-P, welches sich durch Phosphory- lierung von 2-Deoxyglucose unter Verwendung der pflanzeneigenen Hexokinase bildet, und initiiert damit einen zyklischen Detoxifi- zierungsprozess. Dadurch wird die Selektion auf einem 2-DOG hal- tigen Medium möglich (EP-A 0 870 836 ; Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11 : 1233-1240 ; Sanz et al. (1994) Yeast 10 : 1195-1202). Die- ses System kann als Selektionsmarker für die Transformation ins- besondere von Tabak und Kartoffel eingesetzt werden (Kunze et al.

(2001) Mol Breeding 7 : 221-227).

Die im Stand der Technik beschriebenen Systeme haben oft einen oder mehrere der nachfolgenden Nachteile : 1) Zahlreiche Systeme basieren auf der Verwendung von Antibio- tika. Derartige Systeme können aus Gründen der Verbraucherak- zeptanz und der Produktzulassung problematisch sein.

2) Zahlreiche Systeme sind nur in einer begrenzten Anzahl von Arten einsetzbar und erreichen zudem nur geringe Effizienzen.

Zudem erfordern komplexe biotechnologische Arbeiten oft Mehrfach- transformationen. Hier ist das Repertoire an kompatiblen Selek- tionssystemen nach wie vor beschränkt und erzwingt oft eine auf-

wendige Deletion von Markern um nachfolgende Selektionen effi- zient durchführen zu können.

Es besteht daher die Aufgabe, neue Selektionsmarker zur Verfügung zu stellen, die zur Selektion transformierter Bakterien-, Hefe- und Pflanzenzellen oder Pflanzen eingesetzt werden können. Diese Aufgabe wird durch die vorliegende Erfindung gelöst. Im Rahmen der Erfindung wird ein neuer Selektionsmarker, isoliert aus einem Penicillium olsonii Stamm, bereitgestellt, der eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose zu verleihen vermag (SEQ ID NO : 2).

Ein erster Gegenstand der Erfindung betrifft eine Aminosäure- sequenz, kodierend für ein Protein, das eine Resistenz gegen 2-Deoxyglucose zu verleihen vermag, wobei die Aminosäuresequenz eine Sequenz umfasst ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus a) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2, und b) funktionell äquivalenten Fragmenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2, und c) funktionellen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2 oder eines funktionell äquivalenten Fragmentes dersel- ben, die eine Homologie von mindestens 60% zu der Aminosäure- sequenz gemäß SEQ ID NO : 2 oder dem funktionell äquivalenten Fragment derselben aufweisen.

Alle diese Aminosäuresequenzen bzw. Proteine sind infolge unter dem Begriff DGR1-Protein (oder auch Dgrlp) subsumiert.

In einer bevorzugten Ausführungsform kodiert die Dgrlp-Amino- säuresequenz für ein Fusionsprotein aus einer Aminosäuresequenz kodierend für ein DGR1-Protein und einer Aminosäuresequenz kodie- rend für eine 2-DOG-6-P-Phosphatase. Besonders bevorzugt sind Fusionsproteine aus dem DOGR1 Genprodukt aus Saccharomyces cerevi- siae gemäß SEQ ID NO : 4 und dem DGR1-Protein aus Penicillium olsonii gemäß SEQ ID NO : 2. Dabei kann die Reihenfolge der Ver- knüpfung von DGR1 und DOGR1 beliebig sein. Besonders bevorzugt ist beispielsweise das Fusionsprotein gemäß SEQ ID NO : 6.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nukleinsäure- sequenzen, die für die besagten Aminosäuresequenzen kodieren. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleinsäurese- quenz, kodierend für ein DGR1-Protein eine Sequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus

a) der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1, und b) Sequenzen, die sich entsprechend dem degenerierten geneti- schen Code von einer Sequenz mit der SEQ ID NO : 1 ableiten, und c) Sequenzen, die eine Homologie von mindestens 60 % zu der Sequenz mit der SEQ ID NO : 1 aufweisen.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform umfasst die Nukleinsäuresequenz die Sequenz kodierend für ein DGR1-Protein aus Penicillium olsonii gemäß SEQ ID NO : 1 und die Sequenz kodie- rend für das DOGRl-Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae gemäß SEQ ID NO : 3. Besonders bevorzugt ist beispielsweise eine Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Fusionsprotein gemäß SEQ ID NO : 5.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Expres- sionskassetten zur Expression der erfindungsgemäßen Nukleinsäure- sequenzen in Wirtsorganismen oder davon abgeleiteten Zellen, Zellkulturen, Organen, Geweben oder Vermehrungsgut (wie z. B.

Samen oder Früchten). Besagte transgene Expressionskassetten um- fassen : a) mindestens einen Promotor, der zur Regulation der Transkrip- tion in mindestens einem Wirtsorganismus befähigt ist, und b) mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Amino- säuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen beste- hend aus i) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2, und ii) funktionell äquivalenten Fragmenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2, und iii) funktionellen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2 oder eines funktionell äquivalenten Fragmen- tes derselben, die eine Homologie von mindestens 60% zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2 oder dem funk- tionell äquivalenten Fragment derselben aufweisen, wobei der Promotor a) und die besagte Nukleinsäuresequenz b) funktionell miteinander verknüpft sind und die Nukleinsäurese- quenz b) in Bezug auf den Promotor a) oder den Wirtsorganismus heterolog ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die transgenen Expressionskassetten eine Sequenz kodierend für ein Fusionspro- tein aus dem DGR1-Protein aus Penicillium olsonii gemäß SEQ ID NO : 2 und dem DOGR1 Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae gemäß SEQ ID NO : 4. Besonders bevorzugt ist beispielsweise das Fusions- protein gemäß SEQ ID NO : 6.

In einer weiterhin bevorzugten Ausführungsform kann die transgene Expressionskassette in funktioneller Verknüpfung mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz weitere regulatorische Sequen- zen umfassen, die beispielsweise als Transkriptions-Termina- tions-und/oder Polyadenylierungssignale in dem jeweiligen Wirts- organismen dienen können. Auch kann die Expressionskassette wei- tere Funktionselemente wie beispielsweise weitere Selektionsmar- ker (z. B. DOGR1) enthalten.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Verfahren zur Selektion transgener Organismen oder Zellen, umfassend nachfol- gende Schritte : I. Einführen mindestens einer Expressionskassette umfassend a) mindestens einen Promotor, der zur Regulation der Transkription in besagten Zellen befähigt ist, und b) mindestens eine Nukleinsäuresequenz kodierend für eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe von Sequenzen bestehend aus i) der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2, und ii) funktionell äquivalenten Fragmenten der Aminosäure- sequenz gemäß SEQ ID NO : 2, und iii) funktionellen Äquivalenten der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2 oder eines funktionell äquivalen- ten Fragmentes derselben, die eine Homologie von min- destens 60% zu der Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO : 2 oder dem funktionell äquivalenten Fragment der- selben aufweisen, wobei der Promotor a) und die besagte Nukleinsäuresequenz b) funktionell miteinander verknüpft sind,

in Kombination mit mindestens einer weiteren Nukleinsäure- sequenzen in Zellen einer 2-Deoxyglukose-sensitiven Zellpopu- lation, und II. Behandlung besagter Zellpopulation mit 2-Deoxyglucose in einer Konzentration, die für nicht-transformierte Zellen der Zellpopulation einen toxischen Effekt hat, und III. Selektion von transformierten Zellen ; die in ihrem Genom min- destens eine der besagten weiteren Nukleinsäuresequenz auf- weisen und die gegenüber nicht-transformierten Zellen einen Wachstumsvorteil aufweisen, aus besagter Zellpopulation.

In einer bevorzugten Ausführungsform kommen in dem erfindungs- gemäßen Selektionsverfahren transgene Expressionskassetten zum Einsatz, die eine Sequenz kodierend für ein Fusionsprotein aus dem DGR1-Protein aus Penicillium olsonii gemäß SEQ ID NO : 2 und einer 2-Deoxyglukose-6-phosphat Phosphatase, bevorzugt dem DOGR1 Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae gemäß SEQ ID NO : 4 umfas- sen. Besonders bevorzugt ist beispielsweise das Fusionsprotein gemäß SEQ ID NO : 6. Zwischen den beiden Sequenzen können weitere Sequenzen wie zum Beispiele"Linker"o. ä. lokalisiert sein.

Alternativ kann auch parallel zu der Expression einer der erfindungsgemäßen DGRI-Proteine eine 2-Deoxyglukose-6-phosphat Phosphatase exprimiert werden, ohne dass ein Fusionsprotein aus beiden vorliegen muß. So kann die 2-Deoxyglukose-6-phosphat Phosphatse von einer separaten Expressionskassette exprimiert werden. Bevorzugt werden das DGR1-Protein und die 2-Deoxyglu- kose-6-phophat Phosphatase dabei unter Verwendung eines bi- direktionalen Promotors exprimiert. Weiterhin bevorzugt ist die Expression von einem Promotor, wobei zwischen die die Sequenzen kodierend für die jeweiligen Proteine (DGR1 und 2-Deoxyglu- kose-6-phosphat Phosphatase) eine sogenannte"IRES"-Sequenz (interne Ribosomen-Eintrittssequenz) lokalisiert wird, die eine separate Translation beider Proteine von einem RNA-Strang ermög- licht.

Überraschenderweise wurde gefunden, dass das DGRl-Protein aus dem Pilz Penicillium olsonii in der Lage ist, eine effiziente Resi- stenz gegenüber 2-DOG zu verleihen. Die Expression des DGR1-Pro- teins kann daher zur Selektion im Rahmen von Transformationen genutzt werden. Es ist prinzipiell zur Selektion aller Wirtsorga- nismen geeignet, auf die 2-DOG eine toxische Wirkung ausüben kann. Die Nutzbarkeit im Rahmen der Hefe-als auch der Pflanzen- transformation wurde demonstriert (Beispiel 2 und 3). Dabei er- wies sich das DGR1-Protein als effizienter als das bereits be-

kannte DOGR1 Genprodukt aus Saccharomyces cerevisiae und stellt insofern eine deutliche Verbesserung des bezüglich dieses Pro- teins beschriebenen Selektionsverfahrens dar.

"Funktionelle Äquivalente"meint in Bezug auf das DGR1-Protein gemäß SEQ ID NO : 2 insbesondere natürliche oder künstliche Muta- tionen des DGR1-Proteins gemäß SEQ ID NO : 2 sowie homologe Poly- peptide aus anderen Organismen, bevorzugt aus Pilzen, die die gleichen wesentlichen Eigenschaften aufweisen.

"Wesentliche Eigenschaften"des DGR1 Proteins beschrieben durch SEQ ID NO : 2 meint insbesondere die Eigenschaft, bei transgener Expression in einem Organismus (bevorzugt einem pflanzlichen Organismus) oder einer von diesem abgeleiteten Zellen, Zellkultu- ren, Organen, Geweben oder Vermehrungsgut eine Resistenz gegen 2-DOG bewirken zu können, wobei bevorzugt diese Resistenz nicht durch Dephosphorylierung von 2-DOG-6-P bewirkt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform gelten als wesentliche Ei- genschaften ferner mindestens eine Eigenschaft ausgewählt aus nachfolgender Gruppe : a) ein rechnerisches Molekulargewicht entsprechend der Polypep- tidsequenz in einem Bereich von ungefähr 14 bis ungefähr 44 kDa, bevorzugt ungefähr 24 bis ungefähr 34 kDa, besonders bevorzugt ungefähr 29 kDa. b) einen theoretischen isoelektrischen Punkt (pI) in einem Bereich von ungefähr 4,0 bis ungefähr 5,8, bevorzugt ungefähr 4,5 bis ungefähr 5,3, besonders bevorzugt ungefähr pH 4,8 bis 5,1, am meisten bevorzugt ungefähr pH 4,9.

Funktionelle Äquivalente aus anderen Organismen, beispiels- weise aus pflanzlichen Organismen deren genomische Sequenz ganz oder teilweise bekannt ist, wie beispielsweise aus Arabi- dopsis thaliana, Brassica napus, Nicotiana tabacum oder Solanum tuberosum-können z. B. durch Datenbanksuche in Sequenzdaten- banken wie GenBank oder Durchmustern von Gen-oder cDNA-Banken- z. B. unter Verwendung der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1 oder eines teils derselben als Suchsequenz bzw. Sonde-aufgefunden werden.

Mutationen umfassen Substitutionen, Additionen, Deletionen, Inversion oder Insertionen eines oder mehrerer Aminosäurereste.

Bevorzugt haben besagte funktionelle Äquivalente eine Homologie von mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, am meisten bevorzugt min- destens 95 % zu dem DGR1-Protein mit der SEQ ID NO : 2. Dabei er-

streckt sich die Homologie über mindestens 30 Aminosäuren, bevor- zugt mindestens 60 Aminosäuren besonders bevorzugt mindestens 90 Aminosäuren, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge des DGR1 Proteins gemäß SEQ ID NO : 2.

Unter Homologie zwischen zwei Polypeptiden wird die Identität der Aminosäuresequenz über die jeweilige Sequenzlänge ver- standen, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Gap Weight : 8 Length Weight : 2 Average Match : 2,912 Average Mismatch : -2, 003 Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80% auf Proteinbasis mit der Sequenz SEQ ID NO : 2 auf- weist, eine Sequenz verstanden, die bei einem Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO : 2 nach obigem Programmalgorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von mindestens 80% aufweist.

Funktionelle Äquivalente umfassen auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die eine Homologie von mindestens 60 %, besonders bevorzugt mindestens 80 %, besonders bevorzugt mindestens 90 %, am meisten bevorzugt mindestens 95 % zu der Nukleinsäuresequenz mit der SEQ ID NO : 1 haben. Dabei erstreckt sich die Homologie über mindestens 100 Basen, bevorzugt mindestens 200 Basen besonders bevorzugt mindestens 300 Basen, am meisten bevorzugt über die gesamte Länge der Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1.

Unter Homologie zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen wird die Identität der beiden Nukleinsäuresequezen über die jeweilige Sequenzlänge verstanden, die durch Vergleich mit Hilfe des Programmalgorithmus GAP (Wisconsin Package Version 10.0, University of Wisconsin, Genetics Computer Group (GCG), Madison, USA ; Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25 : 3389ff) unter Einstellung folgender Parameter berechnet wird : Gap Weight : 50 Length Weight : 3 Average Match : 10 Average Mismatch : 0 Beispielhaft wird unter einer Sequenz, die eine Homologie von mindestens 80 % auf Nukleinsäurebasis mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 aufweist, eine Sequenz verstanden, die bei einem

Vergleich mit der Sequenz SEQ ID NO : 1 nach obigem Programm- algorithmus mit obigem Parametersatz eine Homologie von min- destens 80 % aufweist.

Funktionelle Äquivalente umfasst auch solche Proteine, die durch Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, die unter Standard- bedingungen mit einer der durch SEQ ID NO : 1 beschriebenen Nukleinsäuresequenz, der zu dieser komplementären Nukleinsäure- sequenz oder Teilen der vorgenannten hybridisieren und die wesentlichen Eigenschaften des Proteins gemäß SEQ ID NO : 2 auf- weisen.

Der Begriff"Standardhybridisierungsbedingungen"ist breit zu verstehen und meint stringente als auch weniger stringente Hybri- disierungsbedingungen. Solche Hybridisierungsbedingungen sind unter anderem bei Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T et al., in Molecular Cloning (A Laboratory Manual), 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, Seiten 9.31-9. 57) oder in Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3. 1-6.3. 6. beschrieben.

Beispielhaft können die Bedingungen während des Waschschrittes ausgewählt sein aus dem Bereich von Bedingungen begrenzt von solchen mit geringer Stringenz (mit ungefähr 2X SSC bei 50°C) und solchen mit hoher Stringenz (mit ungefähr 0,2X SSC bei 50°C bevor- zugt bei 65°C) (20X SSC : 0,3 M Natriumcitrat, 3 M NaCl, pH 7,0).

Darüberhinaus kann die Temperatur während des Waschschrittes von niedrig stringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, ungefähr 22°C, bis zu stärker stringenten Bedingungen bei ungefähr 65°C angehoben werden. Beide Parameter, Salzkonzentration und Temperatur, können gleichzeitig variiert werden, auch kann einer der beiden Para- meter konstant gehalten und nur der andere variiert werden.

Während der Hybridisierung können auch denaturierende Agenzien wie zum Beispiel Formamid oder SDS eingesetzt werden. In Gegen- wart von 50% Formamid wird die Hybridisierung bevorzugt bei 42°C ausgeführt. Einige beispielhafte Bedingungen für Hybridisierung und Waschschritte sind infolge gegeben : (1) Hybridisierungbedingungen zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein : a) 4X SSC bei 65°C, b) 6X SSC bei 45°C, c) 6X SSC, 100 Rg/ml denaturierter, fragmentierte Fisch- sperma-DNA bei 68°C, f) 50% Formamid, 4X SSC bei 42°C, h) 2X oder 4X SSC bei 50°C (schwach stringente Bedingung),

i) 30 bis 40 % Formamid, 2X oder 4X SSC bei 42°C (schwach stringente Bedingung).

(2) Waschschritte können zum Beispiel aus nachfolgenden Bedingungen ausgewählt sein : a) 0,015 M NaCl/0, 0015 M Natriumcitrat/0, 1% SDS bei 50°C. b) 0,1X SSC bei 65°C. c) 0, 1X SSC, 0,5 % SDS bei 68°C. d) 0,1X SSC, 0,5 % SDS, 50 % Formamid bei 42°C. e) 0,2X SSC, 0,1 % SDS bei 42°C. f) 2X SSC bei 65°C (schwach stringente Bedingung).

Funktionelle Äquivalente umfassen ferner Fusionsproteine aus einer der erfindungsgemäßen DGR1-Proteine und Sequenzen, die für Transitpeptide (sogenannte"Targeting"-Peptide) kodieren. Die Ex- pression besagter Fusionsproteine kann so für jedes gewünschte Zellkompartiment, wie z. B. dem Endomembransystem, der Vakuole, den Chloroplasten, Apoplasten oder anderen Plastiden, den Mito- chondrien, dem Endoplasmatischen Retikulum (ER), dem Zellkern, den Ölkörperchen oder anderen Kompartimenten gewährleistet wer- den. Derartige Signalpeptidsequenzen sind bekannt (z. B. Braun (1992) EMBO J 11 : 3219-3227 ; Wolter (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85 : 846-850 ; Sonnewald (1991) Plant J 1 : 95-106). Entsprechende Verfahren, z. B. um an sich nicht in den Plastiden lokalisierte Proteine gezielt in die Plastiden zu transportieren, sind be- schrieben (Klosgen RB & Weil JH (1991) Mol Gen Genet 225 (2) : 297-304 ; Van Breusegem F et al. (1998) Plant Mol Biol 38 (3) : 491-496).

Alternativ kann auch eine transgene Expressionskassette direkt in das Genom der Organellen (z. B. der Plastiden oder Mitochondrien) eingebracht werden. Entsprechende Verfahren sind dem Fachmann ge- läufig und basieren beispielsweise auf gezielter Insertion in die plastidäre DNA unter Verwendung homologer Rekombination. Um eine Expression in den Organellen zu gewährleisten, verwendet der Fachmann bevorzugt entsprechende in den Organellen funktionelle Promotoren.

"Expressionskassette"meint im Rahmen dieser Erfindung allgemein solche Konstruktionen in denen eine zu exprimierende Nuklein- säuresequenz in funktioneller Verknüpfung mit mindestens einer genetischen Kontrollsequenz-bevorzugt einer Promotorsequenz- steht. Expressionskassetten bestehen bevorzugt aus doppelsträngi- ger DNA und können eine lineare oder zirkuläre Struktur haben.

Sie können in verschiedener Form vorliegen, beispielsweise als separate Moleküle oder aber integriert in das Genom einer Zelle.

"Transgen"meint-zum Beispiel bezüglich eine Expressionskas- sette (oder einen diese umfassenden Expressionsvektor oder trans- genen Organismus) alle solche durch gentechnische Methoden zu- stande gekommenen Konstruktionen, in denen sich entweder a) die für ein Dgrlp-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz (beispielsweise die Sequenz gemäß SEQ ID NO : 1), oder b) eine mit a) funktionell verknüpfte Promotor, oder c) (a) und (b) sich nicht in ihrer natürlichen, genetischen Umgebung befinden oder durch gentechnische Methoden modifiziert wurden, wobei die Modifikation beispielhaft eine Substitution, Addition, Dele- tion, Inversion oder Insertion eines oder mehrerer Nukleotidreste sein kann. Bevorzugt ist die in den Expressionskassetten enthal- tene erfindungsgemäße Promotorsequenz heterolog in Bezug auf die mit ihr funktionell verknüpfte, transgen zu exprimierende Nukleinsäuresequenz."Heterolog"meint in diesem Zusammenhang, dass die für ein Dgrlp-Protein kodierende Nukleinsäuresequenz nicht für das Gen kodiert, das natürlicherweise unter der Kon- trolle des besagten Promotors steht.

"Natürliche genetische Umgebung"meint den natürlichen chromoso- malen Locus in dem Herkunftsorganismus oder das Vorliegen in einer genomischen Bibliothek. Im Fall einer genomischen Biblio- thek ist die natürliche, genetische Umgebung der Nukleinsäurese- quenz bevorzugt zumindest noch teilweise erhalten. Die Umgebung flankiert die Nukleinsäuresequenz zumindest an einer Seite und hat eine Sequenzlänge von mindestens 50 bp, bevorzugt mindestens 500 bp, besonders bevorzugt mindestens 1000 bp, ganz besonders bevorzugt mindestens 5000 bp. Ein natürlich vorkommendes Expres- sionskonstrukt-beispielsweise die natürlich vorkommende Kombi- nation des Promotors eines Gens kodierend für ein Dgrlp-Protein gemäß SEQ ID NO : 2 oder ein funktionelles Äquivalent desselben mit seinen entsprechenden kodierenden Sequenzen wird zu einem transgenen Expressionskonstrukt, wenn besagte Expressionskassette durch nicht-natürliche Verfahren (wie beispielsweise einer Muta- genese) geändert oder in einen heterologen Organismus eingebracht wird. Entsprechende Verfahren zur Mutagenese sind beschrieben (US 5,565, 350 ; WO 00/15815).

"Transgen"meint in Bezug auf eine Expression ("transgene Expression") bevorzugt all solche unter Einsatz einer transgenen Expressionskassette, transgenen Expressionsvektor oder transgenen Organismus-entsprechend dem oben gegebenen Definitionen-rea- lisierten Expressionen.

"Heterolog"meint in Bezug auf eine Nukleinsäuresequenz und die sie umfassende Zelle, dass besagte Nukleinsäuresequenz natürli- cherweise nicht in der besagten Zelle vorkommt.

"Heterolog"meint in Bezug auf eine Nukleinsäuresequenz und den mit ihr funktionell verknüpften Promotor, dass die Nukleinsäure- sequenz nicht für das Gen kodiert, das natürlicherweise unter der Kontrolle des besagten Promotors steht.

"Genom"meint die Gesamtheit der Erbinformation einer Zelle und umfasst sowohl die genetische Information des Zellkerns als auch die der Plastiden (z. B. Chloroplasten) und Mitochondrien. Bevor- zugt meint"Genom"jedoch die genetische Information des Zell- kerns (beispielsweise der nukleären Chromosomen).

Unter einer funktionellen Verknüpfung versteht man zum Beispiel die sequentielle Anordnung eines Promotors mit einer zu transkri- bierenden Nukleinsäuresequenz (beispielsweise kodierend für ein DGR1-Protein) und ggf. weiterer genetischen Kontrollsequenzen oder regulativer Elemente wie zum Beispiel einem Terminator und/ oder Polyadenylierungssignalen derart, dass jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Transkription der Nukleinsäure- sequenz, je nach Anordnung der Nukleinsäuresequenzen erfüllen kann. Funktion kann dabei beispielsweise die Kontrolle der Expression d. h. Transkription und/oder Translation der Nuklein- säuresequenz (beispielsweise kodierend für ein DGR1-Protein) bedeuten."Kontrolle"umfasst beispielsweise das Initiieren, Steigerung, Steuerung oder Suppression der Expression d. h. Trans- kription und ggf. Translation. Dazu ist nicht unbedingt eine direkte Verknüpfung im chemischen Sinne erforderlich. Genetische Kontrollsequenzen, wie zum Beispiel Enhancer-Sequenzen, können ihre Funktion auch von weiter entfernten Positionen oder gar von anderen DNA-Molekülen aus auf die Zielsequenz ausüben. Bevorzugt sind Anordnungen, in denen die zu transkribierende Nukleinsäure- sequenz hinter der als Promoter fungierenden Sequenz positioniert wird, so dass beide Sequenzen kovalent miteinander verbunden sind. Bevorzugt ist dabei der Abstand zwischen der Promotor- sequenz und der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz geringer als 200 Basenpaare, besonders bevorzugt kleiner als 100 Basenpaare, ganz besonders bevorzugt kleiner als 50 Basenpaare.

Dem Fachmann sind verschiedene Wege bekannt, um zu einer der erfindungsgemäßen Expressionskassette zu gelangen. Die Herstel- lung einer erfindungsgemäßen Expressionskassette erfolgt bei- spielsweise bevorzugt durch direkte Fusion einer als Promotor fungierenden Nukleinsäuresequenz mit einer zu exprimierenden Nukleoteinsäuresequenz (beispielsweise kodierend für ein DGR1-Protein). Die Herstellung einer funktionellen Verknüpfung kann mittels gängiger Rekombinations-und Klonierungstechniken realisiert werden, wie sie beispielsweise in Maniatis T, Fritsch EF und Sambrook J, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in Silhavy TJ, Berman ML und Enquist LW, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience (1987) beschrieben sind.

Unter einer Expressionskassette sind aber auch solche Konstruk- tionen zu verstehen, bei denen zum Beispiel eine Nukleinsäure- sequenz (beispielsweise kodierend für ein DGR1-Protein) hinter einen endogenen Promotor platziert wird, dass der gleiche Effekt auftritt. Auch dieser Ansatz führt zu einer erfindungsgemäßen Expressionskassette.

Der Begriff der"genetischen Kontrollsequenzen"ist breit zu ver- stehen und meint all solche Sequenzen, die einen Einfluss auf das Zustandekommen oder die Funktion der erfindungsgemäßen Expres- sionskassette haben. Genetische Kontrollsequenzen gewährleisten zum Beispiel die Transkription und gegebenenfalls Translation in prokaryotischen oder eukaryotischen Organismen. Genetische Kon- trollsequenzen sind beispielsweise beschrieben bei"Goeddel ; Gene Expression Technology : Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)"oder"Gruber and Crosby, in : Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnolgy, CRC Press, Boca Raton, Florida, eds. : Glick and Thompson, Chapter 7, 89-108"sowie den dort aufgewiesenen Zitaten.

Vorteilhafte Kontrollsequenzen für die erfindungsgemäßen Expres- sionskassetten oder Vektoren sind beispielsweise in Promotoren wie cos-, tac-, trp-, tet-, lpp-, lac-, lacIq-, T7-, T5-, T3-, gal-, trc-, ara-, SP6-, 1-PR-oder im 1-PL-Promotor enthalten, die vorteilhafterweise in gram-negativen Bakterien Anwendung finden.

Weitere vorteilhafte Kontrollsequenzen sind beispielsweise in den gram-positiven Promotoren amy und SP02, in den Hefe-oder Pilz- promotoren ADC1, MFa, AC, P-60, CYC1, GAPDH, TEF, rp28 oder ADH enthalten.

Für eine Expression in Vertebraten, bevorzugt in Säugern, sind Vektoren wie der TK-Promotor, der RSV 3'LTR-Promotor, der CMV- Promotor, der SV40"early"-oder late"-Promotor, geeignet. Wei- tere Promotoren sind dem Fachmann geläufig. Induzierbare Promoto- ren geeignet für die Verwendung in Vertebraten, bevorzugt in Säugern, umfassen beispielsweise den Tet-Promotor/Repressor indu- zierbar oder reprimierbar durch Tetrazyklin oder Derivate, den Dexamethason-induzierbaren MMTV-LTR-Promotor, den Drosophila minimal"heat shock"-Promotor induzierbar durch Ecdysone oder das Analog Ponasterone A (im Rahmen beispielsweise des pVgRXR Expres- sionssystems ; Invitrogen, Inc.).

Genetische Kontrollsequenzen umfassen insbesondere in Pflanzen funktionelle Promotoren. Als bevorzugte Promotoren für die Expressionskassetten ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflan- zen steuern kann.

Vorzugsweise umfassen die erfindungsgemäßen Expressionskassetten 5'-stromaufwärts von der jeweiligen transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz einen Promotor und 3'-stromabwärts eine Ter- minatorsequenz als zusätzliche genetische Kontrollsequenz, sowie gegebenenfalls weitere übliche regulative Elemente, und zwar je- weils funktionell verknüpft mit der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz.

"Pflanzenspezifischer Promotor"meint. grundsätzlich jeden Promotor, der die Expression von Genen, insbesondere Fremdgenen, in Pflanzen oder Pflanzenteilen,-zellen,-geweben,-kulturen steuern kann. Dabei kann die Expression beispielsweise konstitu- tiv, induzierbar oder entwicklungsabhängig sein. Bevorzugt sind : a) Konstitutive Promotoren "Konstitutive Promotoren"meint solche Promotoren, die eine Expression in zahlreichen, bevorzugt allen, Geweben über einen größeren Zeitraum der Pflanzenentwicklung, bevorzugt zu allen Zeitpunkten der Pflanzenentwicklung, gewährleisten (Benfey et al. (1989) EMBO J 8 : 2195-2202). Vorzugsweise verwendet man ins- besondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvirus oder einem anderen Pflanzenpathogen (z. B.

Agrobakterium) entstammt. Insbesondere bevorzugt sind der 35S-

Promotor des CaMV Blumenkohlmosaikvirus (Franck et al. (1980) Cell 21 : 285-294 ; Odell et al. (1985) Nature 313 : 810-812 ; Shewmaker et al. (1985) Virology 140 : 281-288 ; Gardner et al.

(1986) Plant Mol Biol 6 : 221- 228), der 19S CaMV-Promotor (US 5,352, 605 ; WO 84/02913 ; Benfey et al. (1989) EMBO J 8 : 2195-2202), der Promotor der Nopalinsynthase (NOS) oder der Octopinsynthase (OCS) aus Agrobakterium, der TR-Doppelpromotor, Ubiquitin Promotoren (Holtorf S et al. (1995) Plant Mol Biol 29 : 637-649 ; Christensen et al. (1992) Plant Mol Biol 18 : 675-689 ; Bruce et al. (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86 : 9692-9696), sowie der Promotor des Nitrilase-1 Gens aus Arabidopsis thaliana (Gen- Bank Acc. -No. : U38846, Nükleotide 3862 bis 5325 oder alternativ 5342 ; GenBank Acc. -No. : Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hille- brand et al. (1996) Gene 170 : 197-200). b) Chemisch induzierbare Promotoren Die Expressionskassetten können auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten (Übersichtsartikel : Gatz et al. (1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48 : 89-108), durch den die Expression des exogenen Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert werden kann. Derartige Promotoren, wie z. B. der PRPl-Promotor (Ward et al. (1993) Plant Mol Biol 22 : 361-366), durch Salicylsäure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzolsulfonamid-induzierbarer Promotor (EP 0 388 186), ein durch Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al. (1992) Plant J 2 : 397-404), ein durch Abscisinsäure induzierbarer Promo- tor (EP 0 335 528) bzw. ein durch Ethanol-oder Cyclohexanon- induzierbarer Promotor (WO 93/21334) können ebenfalls verwendet werden. Ferner geeignet ist der Promotor des Glutathione-S-trans- ferase Isoform II Gens (GST-II-27), der durch exogen applizierte Safener wie z. B. N, N-Diallyl-2,2-dichloroacetamid aktiviert werden kann (WO 93/01294) und in zahlreichen Geweben von sowohl Monokotyledonen als auch Dikotyledonen funktionell ist.

Besonders bevorzugt sind konstitutive Promotoren.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen auch weitere Promotoren, Promotorelemente oder Minimalpromotoren, die die expressions- teuernden Eigenschaften modifizieren können. So kann durch gene- tische Kontrollsequenzen zum Beispiel die gewebespezifische Expression zusätzlich abhängig von bestimmten Stressfaktoren er- folgen. Entsprechende Elemente sind zum Beispiel für Wasser- stress, Abscisinsäure (Lam E und Chua NH (1991) J Biol Chem 266 (26) : 17131-17135) und Hitzestress (Schoffl F et al. (1989) Molecular & General Genetics 217 (2-3) : 246-53) beschrieben.

Genetische Kontrollsequenzen umfassen ferner auch die 5'-untrans- latierte Regionen, Introns oder nichtkodierende 3'-Region von Genen wie beispielsweise das Actin-1 Intron, oder die Adhl-S Introns 1, 2 und 6 (allgemein : The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling and Walbot, Eds., Springer, New York (1994)). Es ist gezeigt worden, dass diese eine signifikante Funktionen bei der Regulation der Genexpression spielen können. So wurde gezeigt, dass 5'-untranslatierte Sequenzen die transiente Expression hete- rologer Gene verstärken können. Sie können ferner die Gewebsspe- zifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15 : 435-440). Bei- spielhaft für Translationsverstärker sei die 5'-Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus zu nennen (Gallie et al. (1987) Nucl Acids Res 15 : 8693-8711) und dergleichen. Sie können ferner die Gewebs- spezifität fördern (Rouster J et al. (1998) Plant J 15 : 435-440).

Als Kontrollsequenzen geeignete Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadenylierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA Polyadenylierungssignale aus Agrobakterium tumefaciens. Beispiele für besonders geeignete Terminatorsequen- zen sind der OCS (Octopin-Synthase)-Terminator und der NOS (Nopa- lin-Synthase) -Terminator (Depicker A et al (1982) J Mol Appl Genet 1 : 561-573), als auch die Terminatoren von Sojabohnen Actin, RUBISCo oder alpha-Amylase aus Weizen (Baulcombe DC et al (1987) Mol Gen Genet 209 : 33-40).

Es können ferner weitere Promotoren funktionell mit der zu expri- mierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sein, die eine Expression in weiteren Pflanzengeweben oder in anderen Organismen, wie zum Beispiel E. coli Bakterien ermöglichen.

Ferner sind für die gezielte Expression in den Plastiden plasti- den-spezifische Promotoren bevorzugt. Geeignete Promotoren sind beispielsweise beschrieben in WO 98/55595 oder WO 97/06250. Zu nennen sind das rpo B-Promotorelement, das atoB Promotorelement, das clpP-Promotorelement (siehe auch WO 99/46394) oder das 16SrDNA-Promotorelement. Weiterhin sind virale Promotoren geeignet (WO 95/16783). Eine gezielte plastidäre Expression kann auch erreicht werden, wenn man zum Beispiel einen bakteriellen oder bakteriophagen Promotor verwendet, die resultierende Expres- sionskassette in die plastidäre DNA einbringt und die Expression dann durch ein Fusionsprotein aus einer bakteriellen oder bacte- riophagen Polymerase und einem plastidären Transitpeptid ex- primiert. Ein entsprechendes Verfahren ist in US 5,925, 806 beschrieben.

Die Expressionskassette kann vorteilhafterweise eine oder mehrere sogenannte"enhancer Sequenzen"funktionell verknüpft mit dem Promotor enthalten, die eine erhöhte transgene Expression der Nukleinsäuresequenz ermöglichen. Auch am 3'-Ende der transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können zusätzliche vorteil- hafte Sequenzen insertiert werden, wie weitere regulatorische Elemente oder Terminatoren. Die transgen zu exprimierenden Nukleinsäuresequenzen können in einer oder mehreren Kopien im Genkonstrukt enthalten sein.

Als Kontrollsequenzen sind weiterhin solche zu verstehen, die eine homologe Rekombination bzw. Insertion in das Genom eines Wirtsorganismus ermöglichen oder die Entfernung aus dem Genom erlauben. Methoden wie die cre/lox-Technologie erlauben eine gewebsspezifische, unter Umständen induzierbare Entfernung der Expressionskassette aus dem Genom des Wirtsorganismus (Sauer B.

Methods. 1998 ; 14 (4) : 381-92). Hier werden bestimmte flankierende Sequenzen dem Zielgen angefügt (lox-Sequenzen), die später eine Entfernung mittels der cre-Rekombinase ermöglichen.

Bevorzugt kann die Expressionskassette, bestehend aus einer Ver- knüpfung von Promotor und zu transkribierender Nukleinsäure- sequenz, integriert in einem Expressionsvektor vorliegen und durch zum Beispiel Transformation-nach einem der unten beschriebenen Verfahren-in die eukaryotische Zelle oder Orga- nismus eingebracht werden. Die nachfolgende Expression kann transient sein oder aber auch-bevorzugt-stabil nach Insertion (beispielsweise unter Verwendung von Selektionsmarkern) der Expressionskassetten in das Genom erfolgen. Weitere im Rahmen der Erfindung geeignete Expressionsvektoren sind weiter unten im Rah- men der Transformationsverfahren beispielhaft beschrieben.

Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren zum Einsatz kommen- den Expressionskassetten und/oder die von ihnen abgeleiteten Expressionsvektoren können weitere Funktionselemente enthalten.

Der Begriff Funktionselement ist breit zu verstehen und meint all solche Elemente, die einen Einfluss auf Herstellung, Vermehrung oder Funktion der Expressionskassetten und/oder der von diesen abgeleitete Expressionsvektoren oder Organismen haben. Beispiel- haft aber nicht einschränkend seien zu nennen : 1. Selektionsmarker "Selektionsmarker"meint all solche Nukleinsäure-oder Proteinse- quenzen, deren Expression (d. h. Transkription und ggf. Transla- tion) einer Zelle, Gewebe oder Organismus einen anderen Phänotyp verleiht, als einer nicht transformierten. Selektionsmarker um-

fasst beispielsweise solche Nukleinsäure-oder Proteinsequenzen, deren Expression einer Zelle, Gewebe oder Organismus einen Vor- teil (positiver Selektionsmarker) oder Nachteil (negativer Selek- tionsmarker) gegenüber Zellen vermittelt, die diese Nukleinsäure oder Protein nicht exprimieren. Positive Selektionsmarker wirken beispielsweise dadurch, das eine auf die Zelle inhibitorisch wir- kende Substanz detoxifiziert wird (Bsp. Antibiotika-/Herbizid- resistenz), oder eine Substanz gebildet wird, welche der Pflanze unter den gewählten Bedingungen verbesserte Regeneration oder erhöhtes Wachstum ermöglicht (zum Beispiel nutritive Marker, hormonproduzierender Marker wie ipt ; s. u. ). Eine andere Form positiver Selektionsmarker umfasst mutierte Proteine oder RNAs, die gegenüber einem selektiven Agenz nicht empfindlich sind (bei- spielsweise 16S rRNA Mutanten, die unempfindlich gegenüber Spectinomycin sind). Negative Selektionsmarker wirken beispiels- weise dadurch, dass sie die Bildung einer toxischen Substanz in den transformierten Zellen katalysieren (zum Beispiel das codA-Gen) und damit die transformierten Zellen schädigen oder abtöten. Ferner können Selektionsmarker auch Reporterproteine um- fassen, insofern diese geeignet sind, transformierte von nicht- transformierten Zellen, Geweben oder Organen (beispielsweise durch Farbgebung oder einen anderen detektierbaren Phänotyp) zu unterscheiden.

1.1 Positive Selektionsmarker : Die Expressionskassetten können (z. B. zur weiteren Steigerung der Effizienz der erfindungsgemäßen Selektionsverfahren) zusätzliche positive Selektionsmarker umfassen. Entsprechende Proteine und Sequenzen sowie Selektionsverfahren sind dem Fachmann geläufig.

Bevorzugt sind selektionierbare Marker, die den erfolgreich transformierten Zellen eine Resistenz gegen ein Biozid (zum Bei- spiel ein Herbizid wie Phosphinothricin, Glyphosat oder Bromoxy- nil), einen Metabolismusinhibitor (z. B. 2-Deoxyglucose ; WO 98/45456) oder ein Antibiotikum (z. B. Tetracycline, Ampicil- lin, Kanamycin, G 418, Neomycin, Bleomycin oder Hygromycin) ver- leihen und so die Selektion der transformierten Zellen von un- transformierten ermöglichen. Besonders bevorzugte Selektionsmar- ker sind solche, die eine Resistenz gegen Herbizide verleihen.

Beispielhaft als Selektionsmarker seien genannt : - Phosphinothricinacetyltransferasen (PAT ; auch Bialophossresi- stenz (bar)), welche die freie Aminogruppe des Glutaminsyntha- seinhibitors Phosphinothricin (PPT) acetylieren und damit eine Detoxifizierung des PPT erreichen (de Block et al. (1987) EMBO J 6 : 2513-2518). Das bar-Gen kodierend für eine Phosphinothri- cinacetyltransferase (PAT) kann aus beispielsweise Streptomyces

hygroscopicus oder S. viridochromogenes isoliert werden. Ent- sprechende Sequenzen sind dem Fachmann bekannt (GenBank Acc.- No. : X17220, X05822, M22827 und X65195 ; US 5,489, 520). Ferner sind synthetische Gene beispielsweise für die Expression in Plastiden beschrieben. Ein synthetisches Pat-Gen ist beschrie- ben in Becker et al. (1994) Plant J 5 : 299-307. Die Gene ver- leihen Resistenz gegen das Herbizid Bialaphos oder Glufosinat und sind viel benutze Marker für die Herstellung von transgenen Pflanzen (Vickers JE et al. (1996) Plant Mol Miol Reporter 14 : 363-368 ; Thompson CJ et al. (1987) EMBO J 6 : 2519-2523).

5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphatsynthasen (EPSPS), die eine Resistenz gegen Glyphosat (N- (phosphonomethyl) glycin) verlei- hen. Das nicht-selektive Herbizid Glyphosat hat die EPSPS als molekulares Target. Diese hat eine Schlüsselfunktion in der Biosynthese aromatischer Aminosäuren in Mikroben und Pflanzen, jedoch nicht in Säugern (Steinrucken HC et al. (1980) Biochem Biophys Res Commun 94 : 1207-1212 ; Levin JG & Sprinson DB (1964) J Biol Chem 239 : 1142-1150 ; Cole DJ (1985) Mode of action of glyphosate a literature analysis, p. 48-74. In : Grossbard E und Atkinson D (eds. ). The herbicide glyphosate. Buttersworths, Boston. ). Glyphosat-tolerante EPSPS Varianten werden bevorzugt als Selektionsmarker verwendet (Padgette SR et al. (1996) New weed control opportunities : development of soybeans with a Roundup Readyw gene. In : Herbicide Resistant Crops (Duke, S. O., ed. ), pp. 53-84. CRC Press, Boca Raton, FL ; Saroha MK & Malik VS (1998) J Plant Biochem Biotechnol 7 : 65-72). Das EPSPS Gen des Agrobakterium sp. Stammes CP4 vermittelt eine natürliche Toleranz gegen Glyphosat, die auf entsprechende transgene Pflanzen transferiert werden kann (Padgette SR et al.

(1995) Crop Science 35 (5) : 1451-1461). Sequenzen von Glyphosat- toleranten EPSPS Varianten sind beschrieben (z. B. in US 5,510, 471 ; US 5,776, 760 ; US 5,864, 425 ; US 5,633, 435 ; US 5,627 ; 061 ; US 5,463, 175 ; EP 0 218 571 ; GenBank Acc. -No. : X63374 ; insbesondere das aroA-Gen M10947).

Glyphosat degradierende Enzyme wie z. B. Glyphosatoxidoreduk- tase (gox-Genprodukt). GOX katalysiert die Spaltung einer C-N Bindung im Glyphosat, welches so zu Aminomethylphosphonsäure (AMPA) und Glyoxylat umgesetzt wird. GOX kann dadurch eine Resistenz gegen Glyphosat vermitteln (Padgette SR et al. (1996) J Nutr 126 (3) : 702-16 ; Shah D et al. (1986) Science 233 : 478-481).

Dehalogenasen, die Dalapons inaktivieren (z. B. das deh-Genpro- dukt ; GenBank Acc. -No. : AX022822, AX022820 sowie WO 99/27116).

Bromoxynil degradierende Nitrilaseenzyme (z. B. das bxn-Genpro- dukt aus Klebsiella ozanenae). Sequenzen sind beschrieben (Gen- Bank Acc. -No : E01313 ; J03196).

Neomycinphosphotransferasen verleihen Resistenz gegen Antibio- tika (Aminoglykoside) wie Neomycin, G418, Hygromycin, Paromomy- cin oder Kanamycin, indem sie durch eine Phosphorylierungsreak- tion deren inhibierende Wirkung reduzieren. Besonders bevorzugt ist das nptII-Gen. Sequenzen können aus der GenBank erhalten werden (GenBank Acc. -No : AF080390 ; AF080389). Zudem ist das Gen bereits Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren und kann unter Verwendung von dem Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerasekettenreaktion) aus diesen isoliert werden (GenBank Acc. -No : AF234316 ; AF234315 ; AF234314). Das nptII-Gen kodiert für eine Aminoglycosid-3'0-phosphotransferase aus E. coli, Tn5 (GenBank Acc. -No : U00004 Position 1401-2300 ; Beck et al. (1982) Gene 19 : 327-336). das DOGRl-Genprodukt. Das Gen DOGR1 wurde aus der Hefe Saccharo- myces cerevisiae isoliert (EP 0 807 836). Es kodiert für eine 2-DOG-6-P-Phosphatase, die Resistenz gegenüber 2-DOG verleiht (Randez-Gil et al. (1995) Yeast 11 : 1233-1240 ; Sanz et al.

(1994) Yeast 10 : 1195-1202, Sequenz : GenBank Acc. -No. : NC001140 ; Position 194799 bis 194056).

Sulfonylurea-und Imidazolinon tolerante Acetolactatsynthasen, die eine Resistenz gegen die genannten Herbizidklassen verlei- hen. Beispielhaft seien für Imidazolinon-Herbizide die Wirk- stoffe Imazamethabenz-methyl, Imazzamox, Imazapyr, Imazaquin, Imazethapyr zu nennen. Für Sulfonylharnstoff-Herbizide seien beispielhaft Amidosulforon, Azimsulfuron, Chlorimuronethyl, Chlorsulfuron, Cinosulfüron, Imazosulforon, Oxasulforon, Pro- sulforon, Rimsulforon, Sulfosulforon zu nennen. Dem Fachmann sind zahlreiche weitere Wirkstoffe der genannten Klassen be- kannt. Geeignet sind Nukleinsäuresequenzen wie beispielsweise die unter der GenBank Acc-No. : X51514 abgelegte Sequenz für das Arabidopsis thaliana Csr 1.2 Gen (EC 4.1. 3.18) (Sathasivan K et al. (1990) Nucleic Acids Res. 18 (8) : 2188). Imidazolinon tole- rante Acetolactatsynthasen sind ferner beschrieben unter den GenBank Acc. -No. : AB049823, AF094326, X07645, X07644, A19547, A19546, A19545, 105376, 105373, AL133315.

Hygromycinphosphotransferasen, verleihen eine Resistenz gegen das Antibiotikum Hygromycin (z. B. GenBank Acc. -No. : X74325).

Das Gen ist Bestandteil zahlreicher Expressionsvektoren (z. B.

GenBank Acc. -No. : AF294981 ; AF234301 ; AF234300 ; AF234299 ; AF234298 ; AF354046 ; AF354045) und kann unter Verwendung von dem

Fachmann geläufigen Verfahren (wie beispielsweise Polymerase- kettenreaktion) aus diesen isoliert werden.

Resistenzgene gegen Chloramphenicol (Chloramphenicolacetyl- transferase), Tetracyclin (z. B. GenBank Acc. -No. : X65876), Streptomycin (z. B. GenBank Acc. -No. : AJ278607), Zeocin (z. B. umfasst von GenBank Acc. -No. : L36849), Ampicillin (ß-Lactamase Gen ; Datta N, Richmond MH. (1966) Biochem J 98 (1) : 204-9 ; Heffron F et al (1975) J Bacteriol 122 : 250-256) Gene wie die Isopentenyltransferase aus Agrobakterium tumefaciens (Stamm : P022) (Genbank Acc. -No. : AB025109). Das ipt- Gen ist ein Schlüsselenzym der Cytokinin-Biosynthese. Seine Überexpression erleichtert die Regeneration von Pflanzen (z. B.

Selektion auf Cytokinin-freiem Medium). Das Verfahren zur Nut- zung des ipt-Gens ist beschrieben (Ebinuma H et al. (2000) Proc Natl Acad Sci USA 94 : 2117-2121 ; Ebinuma, H et aI. (2000) Selec- tion of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, In Molecu- lar Biology of Woody Plants. Kluwer Academic Publishers).

Verschiedene weitere positive Selektionsmarker, die den trans- formierten Pflanzen einen Wachstumsvorteil gegenüber nicht- transformierten verleihen, sowie Verfahren zu ihrer Verwendung sind u. a. beschrieben in EP-A 0 601 092. Beispielhaft sind zu nennen ß-Glucuronidase (in Verbindung mit z. B. Cytokininglucu- ronid), Mannose-6-phosphat-Isomerase (in Verbindung mit Man- nose), UDP-Galaktose-4-Epimerase (in Verbindung mit z. B. Galac- tose), wobei Mannose-6-phosphat-Isomerase in Verbindung mit Mannose besonders bevorzugt ist.

Für einen in Plastiden funktionellen Selektionsmarker sind ins- besondere solche bevorzugt, die eine Resistenz gegen Spectino- mycin, Streptomycin, Kanamycin, Lincomycin, Gentamycin, Hygro- mycin, Methotrexat, Bleomycin, Phleomycin, Blasticidin, Sulfon- amid, Phosphinotricin, Chlorsulfuron, Bromoxymil, Glyphosat, 2,4-Datrazin, 4-Methyltryptophan, Nitrat, S-Aminoethyl-L-cy- stein, Lysin/Threonin, Aminoethyl-Cystein oder Betainaldehyd verleihen. Besonders bevorzugt sind die Gene aadA, nptII, BADH, FLARE-S (eine Fusion aus aadA und GFP, beschrieben bei Khan MS & Maliga P (1999) Nature Biotech 17 : 910-915). Ganz besonders bevorzugt ist das aadA Genprodukt (Svab Z und Maliga P (1993) Proc Natl Acad Sci USA 90 : 913-917).

1.2 Negative Selektionsmarker Negative Selektionsmarker ermöglichen beispielsweise die Selek- tion von Organismen mit erfolgreich deletierten Sequenzen, die das Markergen umfassen (Koprek T et al. (1999) Plant J 19 (6) : 719-726). Im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens können mit der erfindungsgemäßen Expressionskassette auch negative Selek- tionsmarker (bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe der oben genann- ten Markerproteingene) eingebracht werden, wobei der als Funkti- onselement eingebrachte Marker bevorzugt ein anderer ist, als der von dem bereits in der pflanzlichen Zelle vorliegenden Marker- proteingen kodierte.

Die jeweils für die Selektion verwendeten Konzentrationen der Antibiotika, Herbizide, Biozide oder Toxine müssen an die jeweiligen Testbedingungen bzw. Organismen angepasst werden.

Beispielhaft seien für Pflanzen zu nennen Kanamycin (Km) 30 bis 100 mg/L, Hygromycin B 40 mg/L, Phosphinothricin (Ppt) 6 mg/L, Spectinomycin (Spec) 500 mg/L.

2) Reportergene Reportergene kodieren für leicht quantifizierbare Proteine und gewährleisten so über Eigenfarbe oder Enzymaktivität eine Bewer- tung der Transformationseffizienz, des Expressionsortes oder -zeitpunktes. Ganz besonders bevorzugt sind dabei Gene kodierend für Reporter-Proteine (siehe auch Schenborn E, Groskreutz D (1999) Mol Biotechnol 13 (1) : 29-44) wie -"green fluorescent protein" (GFP) (Chui WL et al. (1996) Curr Biol 6 : 325-330 ; Leffel SM et al. (1997) Biotechniques 23 (5) : 912-8 ; Sheen et al. (1995) Plant J 8 (5) : 777-784 ; Haseloff et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94 (6) : 2122-2127 ; Reichel et al. (1996) Proc Natl Acad Sci USA 93 (12) : 5888-5893 ; Tian et al. (1997) Plant Cell Rep 16 : 267-271 ; WO 97/41228) - Chloramphenicoltransferase - Luziferase (Millar et al. (1992) Plant Mol Biol Rep 10 : 324-414 ; Ow et al. (1986) Science 234 : 856-859) ; erlaubt Biolu- minescenzdetektion.

- ß-Galactosidase (kodiert für ein Enzym für das verschiedenen chromogene Substrate zur Verfügung stehen)

- ß-Glucuronidase (GUS) (Jefferson et al. (1987) EMBO J 6 : 3901-3907) oder das uidA-Gen (kodieren für Enzyme für die ver- schiedene chromogene Substrate zur Verfügung stehen) - R-Locus Genprodukt, das die Produktion von Anthocyaninpigmenten (rote Färbung) in pflanzlichen Gewebe reguliert und so eine di- rekte Analyse der Promotoraktivität ohne Zugabe zusätzlicher Hilfsstoffe oder chromogener Substrate ermöglicht (Dellaporta et al. (1988) In : Chromosome Structure and Function : Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11 : 263-282) - Tyrosinase (Katz et al. (1983) J Gen Microbiol 129 : 2703- 2714), Enzym, das Tyrosin zu DOPA und Dopaquinon oxidiert, die infolge das leicht nachweisbare Melanin bilden.

- Aequorin (Prasher et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126 (3) : 1259-1268), kann in der Calcium-sensitiven Biolumine- scenzdetektion verwendet werden.

3) Replikationsursprünge, die eine Vermehrung der erfindungsgemäßen Expressionskasset- ten oder Vektoren in zum Beispiel E. coli gewährleisten. Bei- spielhaft seien genannt ORI (origin of DNA replication), der pBR322 ori oder der P15A ori (Sambrook et al. : Molecular Clo- ning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Labora- tory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989).

4) Elemente zum Beispiel"Bordersequenzen", die einen Agrobakte- rien-vermittelte Transfer in Pflanzenzellen für die Übertra- gung und Integration ins Pflanzengenom ermöglichen, wie zum Beispiel die rechte oder linke Begrenzung der T-DNA oder die vir-Region.

5) Multiple Klonierungsregionen (MCS) erlauben und erleichtern die Insertion eines oder mehrerer Nukleinsäuresequenzen.

Als zusätzliches Funktionselement besonders bevorzugt ist das DOGRl-Gen (s. o. ). Die parallele Expression des DOGRl-Genproduktes vermag die Resistenz gegen 2-DOG signifikant zu steigern. Die parallele Expression kann in Form von zwei separaten Marker- proteinen (DOGRl-Genprodukt neben DGR-1) oder in Form eines DOG- R1/DGR-1 Fusionsproteins realisiert werden (s. o. ), wobei letztere Ausführungsform bevorzugt ist, da sie z. B. nur eine Expressions- kassette erfordert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft transgene Zellen oder Organismen, die eine der erfindungsgemäßen Nukleinsäurese- quenzen, Expressionskassetten oder Expressionsvektoren enthalten.

Die Zelle kann von einem Organismus abgeleitet oder in diesem enthalten sein. Es können aber auch einzellige Organismen wie Mi- kroorganismen sein. Die Zelle kann prokaryotisch oder eukaryoti- scher Natur sein.

Das erfindungsgemäße Selektionsverfahren wird bevorzugt auf 2-DOG-sensitive Wirtsorganismen angewendet, am meisten bevorzugt auf 2-DOG-sensitive Bakterien, Pilze, Hefen, tierisch oder pflanzliche Organismen. Diese sind als Gegenstand der Erfindung besonders bevorzugt.

In den Beispielen 7 und 8 werden Experimente beschrieben, die zeigen, dass das Penicillium olsonii DGR1 Genprodukt im Gegensatz zu dem Genprodukt des aus der Hefe stammenden Gens DOGR1 nicht für eine 2-DOG-6-P Phosphatase codiert. Das bedeutet, dass der durch das Penicillin Gen DGR1 bewirkte 2-DOG-Resistenzmechanismus nicht auf einer Dephosphorylierung von 2-DOG-P beruht, wie er in EP-A 0 870 836 für das Hefegen DOGR1 beschrieben ist.

Erfindungsgemäß umfasst sind jedoch auch weitere Organismen (wie z. B. prokaryotische Organismen), die die erfindungsgemäßen Ex- pressionssysteme-beispielsweise zum Zwecke der Vektorproduktion - enthalten. Auch können prokaryotische Organismen, beispiels- weise Agrobakterien, vorteilhaft als Vehikel für die Transforma- tion beispielsweise pflanzlicher Organismen eingesetzt werden.

Bevorzugte Prokaryoten sind vor allem Bakterien wie Bakterien der Gattung Escherichia, Corynebacterium, Bacillus, Clostridium, Pro- pionibacterium, Butyrivibrio, Eubacterium, Lactobacillus, Erwi- nia, Agrobakterium, Flavobakterium, Alcaligenes, Phaeodactylum, Colpidium, Mortierella, Entomophthora, Crypthecodinium oder Cya- nobakterien zum Beispiel der Gattung Synechocystis. Bevorzugt sind vor allem Mikroorganismen, welche zur Infektion von Pflanzen und damit zur Übertragung der erfindungsgemäßen Konstrukte befä- higt sind. Bevorzugte Mikroorganismus sind solche aus der Gattung Agrobakterium und insbesondere der Art Agrobakterium tumefaciens.

Der Begriff"eukaryotische Zellen und Organismen"umfasst pflanz- liche und tierische, nicht-menschliche Organismen und/oder Zellen sowie eukaryotische Mikroorganismen wie beispielsweise Hefen, Al- gen oder Pilze. Eine entsprechender transgener Organismus kann beispielsweise durch Einführen der entsprechenden Expressionskas- sette oder Expressionsvektors in eine Zygote, Stammzelle, Proto-

plast oder eine andere geeignete von dem Organismus abgeleitete Zelle hergestellt werden.

"Tierischer Organismus"meint nicht-menschliche Vertebraten oder Invertebraten. Bevorzugte Vertebraten umfassen beispielsweise Fi- scharten, nicht-menschliche Säugetiere wie Rind, Pferd, Schaf, Ziege, Maus, Ratte oder Schwein, sowie Vögel wie Huhn oder Gans.

Bevorzugte tierische Zellen umfassen CHO, COS, HEK293 Zellen. In- vertebraten umfassen Nematoden oder andere Würmer sowie Insekten.

Invertebraten umfassen Insektenzellen wie Drosophila S2 und Spo- doptera Sf9 oder Sf21 Zellen.

Bevorzugte Pilze sind Aspergillus, Trichoderma, Ashbya, Neu- rospora, Fusarium, Beauveria oder weitere in Indian Chem Engr.

Section B. Vol 37, No 1,2 (1995) auf Seite 15, Tabelle 6 be- schriebene Pilze. Besonders bevorzugt ist der filamentöse Hemia- scomycet Ashbya gossypii.

Bevorzugte Hefen sind Candida, Saccharomyces, Hansenula, Yarro- wia, Arxula oder Pichia, besonders bevorzugt sind Saccharomyces cerevisiae, Hansenula polymorpha oder Pichia pastoris (ATCC Ac- cession No. 201178).

Besonders bevorzugt sind pflanzliche Zellen und pflanzliche Orga- nismen.

"Pflanzliche Zelle"meint im Rahmen der vorliegenden Erfindung jegliche Art von Zellen, die von einem pflanzlichen Organismus abgeleitet oder in diesem vorhanden ist. Der Begriff umfasst da- bei beispielhaft Protoplasten, Kallus-oder Zellkulturen, Mikros- poren, Pollen, Zellen in Form von Geweben wie Blättern, Meristem, Wurzeln usw.

"Pflanzlicher Organismus"umfasst dabei jeden Organismus, der zur Photosynthese befähigt ist, sowie die von diesem abgeleitete Zel- len, Gewebe, Teile oder Vermehrungsgut (wie Samen oder Früchte).

Eingeschlossen sind im Rahmen der Erfindung alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Einjäh- rige, mehrjährige, monokotyledone und dikotyledone Pflanzen sowie Gymnospermen sind bevorzugt.

"Pflanze"im Rahmen der Erfindung meint alle Gattungen und Arten höherer und niederer Pflanzen des Pflanzenreiches. Eingeschlossen unter dem Begriff sind die reifen Pflanzen, Saatgut, Sprossen und Keimlinge, sowie davon abgeleitete Teile, Vermehrungsgut (zum Beispiel Knollen, Samen oder Früchte), Pflanzenorgane, Gewebe, Protoplasten, Kallus und andere Kulturen, zum Beispiel Zellkultu-

ren, sowie alle anderen Arten von Gruppierungen von Pflanzenzel- len zu funktionellen oder strukturellen Einheiten. Reife Pflanzen meint Pflanzen zu jedem beliebigen Entwicklungsstadium jenseits des Keimlings. Keimling meint eine junge, unreife Pflanze in ei- nem frühen Entwicklungsstadium.

"Pflanze"umfasst alle einjährigen und mehrjährigen, monokotyle- donen und dikotyledonen Pflanzen und schließt beispielhaft jedoch nicht einschränkend solche der Gattungen Cucurbita, Rosa, Vitis, Juglans, Fragaria, Lotus, Medicago, Onobrychis, Trifolium, Trigo- nella, Vigna, Citrus, Linum, Geranium, Manihot, Daucus, Arabidop- sis, Brassica, Raphanus, Sinapis, Atropa, Capsicum, Datura, Hyo- scyamus, Lycopersicon, Nicotiana, Solarium, Petunia, Digitalis, Majorana, Cichorium, Helianthus, Lactuca, Bromus, Asparagus, An- tirrhinum, Heterocallis, Nemesis, Pelargonium, Panieum, Pennise- tum, Ranunculus, Senecio, Salpiglossis, Cucumis, Browaalia, Gly- cine, Pisum, Phaseolus, Lolium, Oryza, Zea, Avena, Hordeum, Se- cale, Triticum, Sorghum, Picea und Populus ein.

Bevorzugt sind Pflanzen nachfolgender Pflanzenfamilien : Amarant- haceae, Asteraceae, Brassicaceae, Carophyllaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitaceae, Labiatae, Leguminosae, Pa- pilionoideae, Liliaceae, Linaceae, Malvaceae, Rosaceae, Rubia- ceae, Saxifragaceae, Scrophulariaceae, Solanacea, Sterculiaceae, Tetragoniacea, Theaceae, Umbelliferae.

Bevorzugte monokotyledone Pflanzen sind insbesondere ausgewählt aus den monokotyledonen Kulturpflanzen, wie zum Beispiel der Fa- milie der Gramineae wie Alfalfa, Reis, Mais, Weizen oder andere Getreidearten wie Gerste, Hirse, Roggen, Triticale oder Hafer so- wie dem Zuckerrohr sowie alle Arten von Gräsern.

Die Erfindung wird ganz besonders bevorzugt auf dikotyledone pflanzliche Organismen angewendet. Bevorzugte dikotyledone Pflan- zen sind insbesondere ausgewählt aus den dikotyledonen Kultur- pflanzen, wie zum Beispiel - Asteraceae wie Sonnenblume, Tagetes oder Calendula und andere mehr, - Compositae, besonders die Gattung Lactuca, ganz besonders die Art sativa (Salat) und andere mehr, - Cruciferae, besonders die Gattung Brassica, ganz besonders die Arten napus (Raps), campestris (Rübe), oleracea cv Tastie (Kohl), oleracea cv Snowball Y (Blumenkohl) und oleracea cv Em- peror (Broccoli) und weitere Kohlarten ; und der Gattung Arabi-

dopsis, ganz besonders die Art thaliana sowie Kresse oder Ca- nola und andere mehr, - Cucurbitaceae wie Melone, Kürbis oder Zucchini und andere mehr, - Leguminosae besonders die Gattung Glycine, ganz besonders die Art max (Sojabohne) sowie Alfalfa, Erbse, Bohnengewächsen oder Erdnuss und andere mehr - Rubiaceae, bevorzugt der Unterklasse Lamiidae wie beispiels- weise Coffea arabica oder Coffea liberica (Kaffeestrauch) und andere mehr, - Solanaceae besonders die Gattung Lycopersicon, ganz besonders die Art esculentum (Tomate), die Gattung Solanum, ganz beson- ders die Art tuberosum (Kartoffel) und melongena (Aubergine) und die Gattung Capsicum, ganz besonders die Art annum (Pfeffer) sowie Tabak und andere mehr, - Sterculiaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie bei- spielsweise Theobroma cacao (Kakaostrauch) und andere mehr, - Theaceae, bevorzugt der Unterklasse Dilleniidae wie beispiels- weise Camellia sinensis oder Thea sinensis (Teestrauch) und an- dere mehr, - Umbelliferae, besonders die Gattung Daucus (ganz besonders die Art carota (Karrotte)) und Apium (ganz besonders die Art gra- veolens dulce (Sellerie) ) und andere mehr ; sowie Lein, Baumwolle, Hanf, Flachs, Gurke, Spinat, Möhre, Zuk- kerrübe. und den verschiedenen Baum-, Nuss-und Weinarten, insbe- sondere Banane und Kiwi.

"Pflanzliche Organismen"im Sinne der Erfindung sind weiterhin weitere photosynthetisch aktive befähigte Organismen, wie zum Beispiel Algen, Cyanobakterien sowie Moose. Bevorzugte Algen sind Grünalgen, wie beispielsweise Algen der Gattung Haematococcus, Phaedactylum tricornatum, Volvox oder Dunaliella. Insbesondere bevorzugt ist Synechocystis.

Am meisten bevorzugt sind a) Pflanzen, die zur Ölproduktion geeignet sind, wie beispiels- weise Raps, Sonnenblume, Sesam, Färberdistel (Carthamus tinc- torius), Ölbaum, Soja, Mais, Erdnuss, Rizinus, Ölpalme, Wei- zen, Kakaostrauch oder verschiedene Nussarten wie beispiels-

weise Walnuss, Kokosnuss oder Mandel. Unter diesen wieder be- sonders bevorzugt sind dikotyledonen Pflanzen, insbesondere Raps, Soja und Sonnenblume. b) Pflanzen, die der Stärkeproduktion dienen, wie beispielsweise Mais, Weizen oder Kartoffel. c) Pflanzen, die als Nahrungs-und/oder Futtermittel und/oder Nutzpflanze genutzt werden und bei denen eine Resistenz gg.

Pathogene vorteilhaft wäre, wie beispielsweise Gerste, Rog- gen, Reis, Kartoffel, Baumwolle, Flachs, Lein. d) Pflanzen, die zur Produktion von Feinchemikalien wie bei- spielsweise Vitaminen und/oder Carotinoiden dienen können, wie beispielsweise Raps.

"Zellpopulation"meint jede Gruppe von Zellen die im Rahmen der vorliegenden Erfindung einer Transformation unterworfen werden kann und von der nach dem erfindungsgemäßen Verfahren transfor- mierte transgene Zellen erhalten und isoliert werden können.

Besagte Population kann dabei beispielsweise auch ein Gewebe, eine Zellkultur usw. sein.

"2-DOG sensitiver-Wirtsorganismus"oder"2-DOG sensitive Zell- population"meint im Rahmen des erfindungsgemäßen Selektionsver- fahrens alle diejenigen der oben genannten Organismen und von de- nen abgeleitete Zellen, auf die 2-DOG direkt oder indirekt (z. B. durch einen durch den Wirtsorganismus hergestellten 2-DOG Metabo- liten) einen toxischen Effekt auszuüben vermag.

"Toxischer Effekt"einen messbaren, negativen Einfluss auf die Physiologie eines Organismus (z. B. einer Pflanze) oder einer davon abgeleiteten Zelle und kann dabei Symptome wie beispiels- weise jedoch nicht einschränkend ein vermindertes oder gestörtes Wachstum, eine verminderte oder gestörte Photosyntheserate, eine verminderte oder gestörte Zellteilung, eine verminderte oder ge- störte Membranausbildung, eine verminderte oder gestörte Sprosse- longation, eine verminderte oder gestörte Regeneration einer vollständigen Organismus (z. B. einer Pflanze) aus Zellkultur oder Kallus usw. umfassen. Die mittels des erfindungsgemäßen Verfah- rens erfolgreich transformierten Zellen weisen-anders ausge- drückt-gegenüber den nicht-transformierten einen Wachstumsvor- teil oder Selektionsvorteil unter Einwirkung von 2-DOG auf.

Wachstums-oder Selektionsvorteil ist dabei breit zu verstehen und meint beispielsweise die Tatsache, dass besagte transfor- mierte Zellen in der Lage sind, Schösslinge auszubilden und/oder zu vollständigen Pflanzen regenerierbar sind, wohingegen die

nicht-transformierten Zellen dies nicht oder nur mit deutlicher Verzögerung realisieren können.

Die zum Erzielen eines toxischen Effektes vorteilhaften toxischen Konzentrationen an 2-DOG können je nach Organismus, Zell-oder Gewebeart, Entwicklungsstadium etc. unterschiedlich sein. Insbe- sondere kann die toxische Konzentration auch von Zellkulturbedin- gungen wie beispielsweise dem Angebot weiterer Kohlenstoffquellen (z. B. metabolisierbarer Kohlenhydrate) abhängig sein. Ferner sollte die eingesetzte 2-DOG Konzentration nicht zu hoch gewählt werden, da ansonsten eine effiziente Detoxifizierung unter Umständen nicht gewährleistet werden kann. In der Regel können 2-DOG Konzentrationen in einem Bereich von ungefähr 10 bis 5000 mg/l, bevorzugt 20 bis 2000 mg/l, besonders bevorzugt 50 bis 1000 mg/l, am meisten bevorzugt 100 bis 500 mg/1 eingesetzt wer- den.

"Selektion"meint das Identifizieren und/oder Isolieren von erfolgreich transformierten pflanzlichen Zellen aus einer Popula- tion nicht-transformierter Zellen unter Einsatz des erfindungsge- mäßen Verfahrens. Dabei ist es nicht zwingend erforderlich, dass die Selektion unmittelbar nach der Transformation direkt mit den transformierten Zellen erfolgt. Es ist auch möglich, die Selek- tion erst zu einem späteren Zeitpunkt, ja sogar bei einer späte- ren Generation der aus der Transformation resultierenden pflanz- lichen Organismen (bzw. von diesen abgeleiteten Zellen, Geweben, Organen oder Vermehrungsgut) vorzunehmen. So können beispiels- weise Arabidopsispflanzen direkt mit z. B. der Vakuuminfiltra- tionsmethode transformiert werden (Clough S & Bent A (1998) Plant J 16 (6) : 735-43 ; Bechtold N et al. (1993) CR Acad Sci Paris 1144 (2) : 204-212) und ergeben infolge transgene Samen, welche anschließend der Selektion ausgesetzt werden können.

Die Tatsache, dass die weitere Nukleinsäuresequenz"in Kombina- tion mit"der Expressionskassette für das DGR1-Protein transfor- miert wird, ist breit zu verstehen und meint, dass mindestens eine weitere Nukleinsäuresequenz und mindestens eine der besagten transgenen Expressionskassetten funktionell, physikalisch-che- misch oder andersartig gekoppelt sind, so dass das Vorliegen der Expressionskassette in einer Zelle-und des damit verbundenen Selektionsvorteils-das parallele Vorliegen der weiteren Nukleinsäuresequenz als wahrscheinlich anzeigt. Die weitere Nukleinsäuresequenz und die Expressionskassette können dabei bevorzugt, jedoch nicht zwingend, Teil eines einzigen Nuklein- säurekonstruktes (z. B. eines Transformationsvektors) sein. Sie können jedoch auch getrennt, beispielsweise im Rahmen einer

Co-Transformation eingeführt werden und auch so ihre Funktion im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens wahrnehmen.

"Einführen"umfasst im Rahmen der Erfindung alle Verfahren, die dazu geeignet sind, eine Nukleinsäuresequenz (beispielsweise eine erfindungsgemäße Expressionskassette) direkt oder indirekt, in einen Organismus (z. B. ein Pflanze) oder eine Zelle, Komparti- ment, Gewebe, Organ oder Vermehrungsmaterial (z. B. Samen oder Früchte) derselben einzuführen oder dort zu generieren. Das Ein- bringen kann zu einer vorübergehenden (transienten) Präsenz be- sagter Nukleinsäuresequenz führen oder aber auch zu einer dauer- haften (stabilen). Einführen umfasst beispielsweise Verfahren wie Transfektion, Transduktion oder Transformation. Die in den Ver- fahren verwendeten Organismen werden je nach Wirtsorganismus in dem Fachmann bekannter Weise angezogen bzw. gezüchtet.

Das Einführen einer erfindungsgemäßen transgenen Expressionskas- sette in einen Organismus oder Zellen, Geweben, Organe, Teile bzw. Samen desselben (bevorzugt in Pflanzen bzw. pflanzliche Zel- len, Gewebe, Organe, Teile oder Samen) kann vorteilhaft unter Verwendung von Vektoren realisiert werden, in denen die trans- genen Expressionskassetten enthalten sind. Vektoren können bei- spielhaft Plasmide, Cosmide, Phagen, Viren oder auch Agrobakte- rien sein. Die transgenen Expressionskassetten können in den Vek- tor (bevorzugt ein Plasmidvektor) über eine geeignete Restrik- tionsschnittstelle insertiert werden. Der entstandene Vektor kann zunächst in E. coli eingeführt und amplifiziert werden. Korrekt transformierte E. coli werden selektioniert, gezüchtet und der rekombinante Vektor mit dem Fachmann geläufigen Methoden gewon- nen. Restriktionsanalyse und Sequenzierung können dazu dienen, den Klonierungsschritt zu überprüfen. Bevorzugt sind solche Vek- toren, die eine stabile Integration der Expressionskassette in das Wirtsgenom ermöglichen.

Die Herstellung eines transformierten Organismus (bzw. einer transformierten Zelle oder Gewebes) erfordert, dass die entspre- chende DNA (z. B. der Expressionsvektor) oder RNA in die entspre- chende Wirtszelle eingebracht wird. Für diesen Vorgang, der als Transformation (oder Transduktion bzw. Transfektion) bezeichnet wird, steht eine Vielzahl von Methoden zur Verfügung (Keown et al. (1990) Methods in Enzymology 185 : 527-537). So kann die DNA oder RNA beispielhaft direkt durch Mikroinjektion oder durch Bom- bardierung mit DNA-beschichteten Mikropartikeln eingeführt wer- den. Auch kann die Zelle chemisch, zum Beispiel mit Polyethylen- glycol, permeabilisiert werden, so dass die DNA durch Diffusion in die Zelle gelangen kann. Die DNA kann auch durch Protopla- stenfusion mit anderen DNA-enthaltenden Einheiten wie Minicells,

Zellen, Lysosomen oder Liposomen erfolgen. Elektroporation ist eine weitere geeignete Methode zum Einführen von DNA, bei der die Zellen reversibel durch einen elektrischen Impuls permeabilisert werden. Entsprechende Verfahren sind beschrieben (beispielsweise bei Bilang et al. (1991) Gene 100 : 247-250 ; Scheid et al. (1991) Mol Gen Genet 228 : 104-112 ; Guerche et al. (1987) Plant Science 52 : 111-116 ; Neuhause et al. (1987) Theor Appl Genet 75 : 30-36 ; Klein et al. (1987) Nature 327 : 70-73 ; Howell et al. (1980) Science 208 : 1265 ; Horsch et al. (1985) Science 227 : 1229-1231 ; De- Block et al. (1989) Plant Physiology 91 : 694-701 ; Methods for Plant Molecular Biology (Weissbach and Weissbach, eds. ) Academic Press Inc. (1988) ; and Methods in Plant Molecular Biology (Schuler and Zielinski, eds. ) Academic Press Inc. (1989)).

Als Vektoren zur Expression in E. coli sind bevorzugt pQE70, pQE60 und pQE-9 (QIAGEN, Inc. ) ; pBluescript Vektoren, Phagescript Vek- toren, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A (Stratagene Cloning Systems, Inc. ) ; ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia Bio- tech, Inc.).

Bevorzugte Vektoren zur Expression in Säugerzellen umfassen pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 und pSG (Stratagene Inc.) ; pSVK3, pBPV, pMSG und pSVL (Pharmacia Biotech, Inc. ). Als induzierbare Vektoren seien pTet-tTak, pTet-Splice, pcDNA4/TO, pcDNA4/TO/ LacZ, pcDNA6/TR, pcDNA4/TO/Myc-His/LacZ, pcDNA4/TO/Myc-His A, pcDNA4/TO/Myc-His B, pcDNA4/TO/Myc-His C, pVgRXR (Invitrogen, Inc. ) oder die pMAM-Serie (Clontech, Inc. ; GenBank Accession No. : U02443) zunennen. Diese stellen bereits das induzierbare regula- torische Kontrollelement beispielsweise für eine chemisch, indu- zierbare Expression zur Verfügung.

Vektoren für die Expression in Hefe umfassen beispielhaft pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3. 5, PHIL-D2, PHIL-S1, pPIC3SK, pPIC9K, und PA0815 (Invitro- gen, Inc.).

Klonierungsvektoren und Techniken zur genetischen Manipulation von Ciliaten und Algen sind dem Fachmann bekannt (WO 98/01572 ; Falciatore et al. (1999) Marine Biotechnology 1 (3) : 239-251 ; Dunahay et al. (1995) J Phycol 31 : 10004-1012).

Prinzipiell sind für die Transformation tierischer Zellen oder von Hefezellen ähnliche Verfahren wie für die"direkte"Transfor- mation von pflanzlichen Zellen anzuwenden. Insbesondere Verfahren wie die Calciumphosphat oder Liposomen vermittelte Transformation oder aber Elektroporation sind bevorzugt.

Verschiedene Methoden und Vektoren zum Einschleusen von Genen in das Genom von Pflanzen sowie zur Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen sind bekannt (Plant Molecular Biology and Biotechnology (CRC Press, Boca Raton, Florida), Kapi- tel 6/7, S. 71-119 (1993) ; White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in : Transgenic Plants, Bd. 1, Engi- neering and Utilization, Hrsgb. : Kung und Wu R, Academic Press, 15-38 ; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrsgb. : Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143 ; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42 : 205-225 ; Halford NG, Shewry PR (2000) Br Med Bull 56 (1) : 62-73). Dazu zählen beispielhaft die oben erwähnten. Bei Pflanzen werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind vor allem die Protoplastentransformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, Calciumphosphat-vermittelte Transformation, DEAE- Dextran-vermittelte Transformation, Liposomen vermittelte Trans- formation (Freeman et al. (1984) Plant Cell Physiol. 29 : 1353ff ; US 4,536, 475), biolistische Verfahren mit der Genkanone ("parti- cle bombardment"Methode ; US 5,100, 792 ; EP-A 0 444 882 ; EP-A 0 434 616 ; Fromm ME et al. (1990) Bio/Technology.

8 (9) : 833-9 ; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2 : 603), die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-halti- ger Lösung, Elektroporation (EP-A 290 395, WO 87/06614), Mikron- jektion (WO 92/09696, WO 94/00583, EP-A 0 331 083, EP-A 0 175 966) oder andere Methoden der direkten DNA-Einführung (DE 4 005 152, WO 90/12096, US 4,684, 611). Physikalische Methoden der DNA-Einführung in pflanzliche Zellen sind im Überblick be- schrieben bei Oard (1991) Biotech Adv 9 : 1-11.

Im Falle dieser"direkten"Transformationsmethoden sind keine besonderen Anforderungen an das verwendete Plasmid gestellt. Ein- fache Plasmide wie die der pUC-Reihe, pBR322, M13mp Reihe, pACYC184 etc. können verwendet werden. Sollen vollständige Pflan- zen aus den transformierten Zellen regeneriert werden, so ist es erforderlich, das sich auf dem Plasmid ein zusätzliches selektio- nierbares Markergen befindet.

Neben diesen"direkten"Transformationstechniken kann eine Trans- formation auch durch bakterielle Infektion mittels Agrobakterium (z. B. EP 0 116 718), virale Infektion mittels viraler Vektoren (EP 0 067 553 ; US 4,407, 956 ; WO 95/34668 ; WO 93/03161) oder mit- tels Pollen (EP 0 270 356 ; WO 85/01856 ; US 4,684, 611) durchgeführt werden.

Bevorzugt erfolgt die Transformation mittels Agrobakterien, die "entwaffnete" (disarmed) Ti-Plasmidvektor enthalten, wobei deren natürliche Fähigkeit zum Gentransfer auf Pflanzen. genutzt wird (EP-A 0 270 355 ; EP-A 0 116 718).

Agrobakterium-Transformation ist weit verbreitet für die Trans- formation von Dicotyledonen, wird aber auch zunehmend auf Mono- cotyledonen angewandt (Toriyama et al. (1988) Bio/Technology 6 : 1072-1074 ; Zhang et al. (1988) Plant Cell Rep 7 : 379-384 ; Zhang et al. (1988) Theor Appl Genet 76 : 835-840 ; Shimamoto et al.

(1989) Nature 338 : 274-276 ; Datta et al. (1990) Bio/Technology 8 : 736-740 ; Christou et al. (1991) Bio/Technology 9 : 957-962 ; Peng et al. (1991) International Rice Research Institute, Manila, Phi- lippines 563-574 ; Cao et al. (1992) Plant Cell Rep 11 : 585-591 ; Li et al. (1993) Plant Cell Rep 12 : 250-255 ; Rathore et al. (1993) Plant Mol Biol 21 : 871-884 ; Fromm et al. (1990) Bio/Technology 8 : 833-839 ; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2 : 603-618 ; D'Hal- luin et al. (1992) Plant Cell 4 : 1495-1505 ; Walters et al. (1992) Plant Mol Biol 18 : 189-200 ; Koziel et al. (1993) Biotechnology 11 : 194-200 ; Vasil IK (1994) Plant Mol Biol 25 : 925-937 ; Weeks et al. (1993) Plant Physiol 102 : 1077-1084 ; Somers et al. (1992) Bio/Technology 10 : 1589-1594 ; WO 92/14828 ; Hiei et al. (1994) Plant J 6 : 271-282).

Die für die Agrobakterium-Transformation meist verwendeten Stämme Agrobakterium tumefaciens oder Agrobakterium rhizogenes enthalten ein Plasmid (Ti bzw. Ri Plasmid), das auf die Pflanze nach Agro- bakterium-Infektion übertragen wird. Ein Teil dieses Plasmids, genannt T-DNA (transferred DNA), wird in das Genom der Pflanzen- zelle integriert. Alternativ können durch Agrobakterium auch binäre Vektoren auf Pflanzen übertragen und in deren Genom inte- griert werden. Die Agrobakterium-vermittelte Transformation ist am besten für dicotyledone, diploide Pflanzenzellen geeignet, wohingegen die sich direkte Transformationstechniken für jeden Zelltyp eignen.

Die Anwendung von Agrobakterium tumefaciens für die Transforma- tion von Pflanzen unter Verwendung von Gewebekulturexplantaten ist beschrieben (u. a. Horsch RB et al. (1985) Science 225 : 1229ff. ; Fraley et al. (1983) Proc Natl Acad Sci USA 80 : 4803-4807 ; Bevans et al. (1983) Nature 304 : 184-187). Viele Stämme von Agrobakterium tumefaciens sind in der Lage, genetisches Mate- rial-beispielsweise die erfindungsgemäßen Expressionskassetten - zu übertragen, wie z. B. die Stämme EHA101 [pEHA101], EHA105 [pEHA105], LBA4404 [pAL4404], C58Cl [pMP90] und C58Cl [pGV2260] (Hood et al. (1993) Transgenic Res 2 : 208-218 ; Hoekema et al. (1983) Nature 303 : 179-181 ; Koncz and Schell (1986)

Gen Genet 204 : 383-396 ; Deblaere et al. (1985) Nucl Acids Res 13 : 4777-4788).

Werden Agrobakterien verwendet, so ist die Expressionskassette in spezielle Plasmide zu integrieren, entweder in einen Zwischenvek- tor (englisch : shuttle or intermediate vector) oder einen binären Vektor. Bevorzugt werden binäre Vektoren verwendet, die sowohl in E. coli als auch in Agrobakterium replizieren können. Sie enthal- ten in der Regel ein Selektionsmarkergen und einen Linker oder Polylinker flankiert von der rechten und linken T-DNA Begren- zungssequenz. Sie können direkt in Agrobakterium transformiert werden (Holsters et al. (1978) Mol Gen Genet 163 : 181-187). Das in diesem Fall als Wirtsorganismus fungierende Agrobakterium sollte bereits ein Plasmid mit der vir-Region enthalten. Diese ist für die Übertragung der T-DNA auf die pflanzliche Zelle erforderlich.

Ein so transformiertes Agrobakterium kann zur Transformation pflanzlicher Zellen verwendet werden. Die Verwendung von T-DNA zur Transformation pflanzlicher Zellen ist intensiv untersucht und beschrieben (EP-A 0 120 516 ; Hoekema, In : The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B. V., Alblasserdam, Chapter V ; An et al. (1985) EMBO J 4 : 277-287). Verschiedene binäre Vektoren sind bekannt und teilweise kommerziell erhältlich wie zum Beispiel pBI101. 2 oder pBINl9 (Clontech Laboratories, Inc. USA ; Bevan et al. (1984) Nucl Acids Res 12 : 8711), pBinAR, pPZP200 oder pPTV.

Die mit einem solchen Vektor transformierten Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, ins- besondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Raps, verwendet wer- den, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist beschrieben (White FF (1993) Vectors for Gene Transfer in Higher Plants ; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engi- neering and Utilization, herausgegeben von SD Kung und R Wu, Academic Press, S. 15-38 ; Jenes B et al. (1993) Techniques for Gene Transfer, in : Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, S. 128-143 ; Potrykus (1991) Annu Rev Plant Physiol Plant Molec Biol 42 : 205-225). Aus den transformierten Zellen der ver- wundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die integriert die oben beschriebenen erfindungsgemäßen Expressionssysteme enthalten.

Stabil transformierte Zellen d. h. solche, die die eingeführte DNA integriert in die DNA der Wirtszelle enthalten, können auf der Basis des erfindungsgemäßen Selektionsverfahrens (oder aber auch

unter Nutzung anderer gegebenenfalls von den erfindungsgemäßen Expressionskassetten oder Expressionsvektoren umfassten selektio- nierbarer Marker (s. o.)) identifiziert und isoliert (d. h. selek- tiert) werden. Transformierte Zellen, die ein solches Markergen exprimieren, sind in der Lage, in der Gegenwart von Konzentratio- nen von 2-DOG (oder ggf. eines entsprechenden Antibiotikums oder Herbizides) zu überleben, die einen untransformierten Wildtyp ab- töten. Die erhaltenen Pflanzen können in üblicher Weise gezüchtet und gekreuzt werden. Zwei oder mehr Generationen sollten vorzugs- weise kultiviert werden, um sicherzustellen, dass die genomische Integration stabil und vererblich ist.

Sobald eine transformierte Pflanzenzelle hergestellt wurde, kann eine vollständige Pflanze unter Verwendung von dem Fachmann be- kannten Verfahren erhalten werden. Hierbei geht man beispielhaft von Kalluskulturen, einzelnen Zellen (z. B. Protoplasten) oder Blattscheiben aus (Vasil et al. (1984) Cell Culture and Somatic Cel Genetics of Plants, Vol I, II and III, Laboratory Procedures and Their Applications, Academic Press ; Weissbach and Weissbach (1989) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press). Aus diesen noch undifferenzierten Callus-Zellmassen kann die Bildung von Spross und Wurzel in bekannter Weise induziert werden. Die erhaltenen Sprösslinge können ausgepflanzt und gezüchtet werden.

Entsprechende Verfahren sind beschrieben (Fennell et al. (1992) Plant Cell Rep. 11 : 567-570 ; Stoeger et al (1995) Plant Cell Rep.

14 : 273-278 ; Jahne et al. (1994) Theor Appl Genet 89 : 525-533).

Die Wirksamkeit der Expression der transgen exprimierten Nuklein- säuren kann beispielsweise in vitro durch Sprossmeristemvermeh- rung unter Verwendung einer der oben beschriebenen Selektions- methoden ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe verän- derte Expression eines Zielgens und die Auswirkung auf den Phäno- typ der Pflanze an Testpflanzen in Gewächshausversuchen getestet werden.

Bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Selektionsverfahren im Rahmen der Pflanzenbiotechnologie zur Erzeugung von Pflanzen mit vorteilhaften Eigenschaften eingesetzt. So kann Eignung der Pflanzen oder deren Samen als Nahrungs-oder Futtermittel verbes- sert werden, beispielsweise über eine Veränderung der Zusammen- setzungen und/oder des Gehalt an Metaboliten, insbesondere Pro- teinen, Ölen, Vitaminen und/oder Stärke. Auch können Wachstums- rate, Ertrag oder die Resistenz gegen biotische oder abiotische Stressfaktoren erhöht werden.

Vorteilhafte Effekte können sowohl durch transgene Expression von Nukleinsäuren oder Proteinen als auch durch gezielte Verminderung der Expression endogener Gene hinsichtlich des Phänotypes der transgenen Pflanze erzielt werden. Die in der transgenen Pflanze zu erzielenden vorteilhaften Effekte umfassen beispielsweise : - Erhöhte Resistenz gegen Pathogene (biotischer Stress) - Erhöhte Resistenz gegen Umwelteinflüsse wie Hitze, Kälte, Frost Trockenheit, UV-Licht, oxidativen Stress, Nässe, Salz etc. (abiotischer Stress) - Erhöhte Ertragsleistung - Verbesserte Qualität z. B. erhöhter Nährwert, erhöhte Lager- fähigkeit Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung der erfindungsgemäßen, transgenen Organismen, bevorzugt der transge- nen Pflanzen, und der von ihnen abgeleitete Zellen, Zellkulturen, Teile-wie zum Beispiel bei transgenen pflanzlichen Organismen Wurzeln, Blätter etc. -, und transgenes Vermehrungsgut wie Saaten oder Früchte, zur Herstellung von Nahrungs-oder Futtermitteln, Pharmazeutika oder Feinchemikalien, wie beispielsweise Enzymen, Vitaminen, Aminosäuren, Zucker, Fettsäuren, natürliche und syn- thetische Geschmacks-, Aroma-und Farbstoffe. Besonders bevorzugt ist die Produktion von Triacylglyceriden, Lipiden, Ölen, Fettsäu- ren, Stärke, Tocopherolen und Tocotrienolen sowie Carotinoiden.

Von Menschen und Tieren verzehrbare erfindungsgemäße, genetisch veränderte Pflanzen können auch beispielsweise direkt oder nach an sich bekannter Aufbereitung als Nahrungsmittel oder Futter- mittel verwendet werden.

Sequenzen 1. SEQ ID NO : 1 Nukleinsäuresequenz kodierend für das DGR1- Protein aus P. oison-n 2. SEQ ID NO : 2 Aminosäuresequenz kodierend für das DGR1- Protein aus P. olsonii 3. SEQ ID NO : 3 Nukleinsäuresequenz kodierend für das DOGR1- Protein aus Saccharomyces cerevisiae 4. SEQ ID NO : 4 Aminosäuresequenz kodierend für das DOGR1- Protein aus Saccharomyces cerevisiae

5. SEQ ID NO : 5 Nukleinsäuresequenz kodierend für ein Fusions- protein aus DGR1 und DOGR1 6. SEQ ID NO : 6 Aminosäuresequenz kodierend für ein Fusions- protein aus DGR1 und DOGR1 7. SEQ ID NO : 7 Oligonukleotidprimer DGRlPst 5'-CTGCAGATGGCAACCCCCCAAACAGT-3' 8. SEQ ID NO : 8 Oligonukleotidprimer DGRlBam 5'-GGATCCTTATCTAGATCCCCTCGAAGTC-3' 9. SEQ ID NO : 9 Oligonukleotidprimer DGRINcoI 5'-CCATGGCAACCCCCCAAACAGT-3' 10. SEQ ID NO : 10 Oligonukleotidprimer DGRISal 5'-GTCGACTTATCTAGATCCCCTCGAAGTC-3' 11. SEQ ID NO : 11 Oligonukleotidprimer KR-05 5-GGGCGCCCGGTTCTTTTTG-3 12. SEQ ID NO : 12 Oligonukleotidprimer KR-06 5-ACACCCAGCCGGCCACAGTCG-3 13. SEQ ID NO : 13 Oligonukleotidprimer KR-13 5'-ATGCCCGATCGMGCTCAAGT-3' 14. SEQ ID NO : 14 Oligonukleotidprimer KR-14 5'-CCTGACCCAAACATCTCGGC-3' 15. SEQ ID NO : 15 Oligonukleotidprimer KR-07 5-CCACAGCGCCGAAGTCCTCT-3 16. SEQ ID NO : 16 Oligonukleotidprimer KR-08 5-GTCCGTATCCCTCACCATCATCTC-3 17. SEQ ID NO : 17 Oligonukleotidprimer KR-09 5-CCATGGCAGAATTTTCAGCTGATCTAT-3 18. SEQ ID NO : 18 Oligonukleotidprimer KR-10 5\-TACTCAGGCCCTTGTCAAAGG-3 19. SEQ ID NO : 19 pUC Plasmid (pNIT18) umfassend die Nukleotid- sequenz des Nitrilase-I Promotors aus Arabidopsis thaliana

Abbildungen Fig. 1 Schematische Darstellung der DGR1-Nukleinsäuresequenz mit einigen Restriktionsschnittstellen.

DGR1 : kodierende Region von DGR1. Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen mit ihrer Position.

Fig. 2 Schematische Darstellung des Hefe-Expressionsvektors pAD- GAL4-2.1-DGR1 zur Expression von DGR1 (Abkürzungen : Amp : Ampicillinresistenz ; Adhl-prom : Promotor der Alkoholde- hydrogenase 1 ; Adhl-term : Transkriptionsterminator der Alkoholdehydrogenase 1 ; fl-origin : fl-Replikations- ursprung zur Replikation in E. coli ; 2) J-origin : 2F-Re- plikationsursprung zur Replikation in Hefe ; DGR1 : Nukleinsäuresequenz kodierend für DGR1 Marker aus P. olso- nii ; LEU2 : Leucin-Komplementierungsmarker). Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen mit ihrer Position.

Fig. 3 2-DOG-Resistenzsteigerung nach Transformation von pAD- GAL4-2.1-DGR1 in S. cerevisiae CL3ABY S86.

Der Resisistenz-vermittelnde Effekt von DGR1 wurde anhand der 2-DOG-Resistenz von DGR1-transformierten (DGR1) und nicht-transformierten ("Wildtyp", WT) Hefen ermittelt.

Dazu wurden die Hefen in SD-Medium mit 1% Fructose bis zum Beginn der stationären Wachstumsphase kultiviert (48 h) und davon Aliquote (je 10 W1) einer 10-2, 10-3, 10-4 bzw. 10-5 Verdünnung (Bahn 1, 2,3 bzw. 4) auf SD-Agar-Platten mit 1% Fructose und den entsprechenden DOG-Konzentrationen ausplattiert. Diese Platten wurden anschließend 5 d bei 30°C inkubiert. Man erkennt eine signifikante Steigerung der Resistenz gg. 2-DOG.

Fig. 4 Konstruktionsschema für das Plasmid YEpll2-DGRl.

(Abkürzungen : Amp (r) : Ampicillinresistenz ; Adhl-p : Promo- tor der Alkoholdehydrogenase 1 ; Adhl-t : Transkriptions- terminator der Alkoholdehydrogenase 1 ; 2F-origin : 2F-Re- plikationsursprung zur Replikation in Hefe ; DGR1 : Nu- kleinsäuresequenz kodierend für DGR1 Marker aus P. olso- nii ; TRP1 : Tryptophan-Komplementierungsmarker. ). Angege- ben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen.

Fig. 5A Konstruktionsschema für das Plasmid pBi-Nit-P-DGR1.

(Abkürzungen : LB/RB : Linke bzw. recht T-DNA-Grenze ; Nit- P : Nitrilase-I Promotor ; nos-T : nos-Terminator, nos-P : nos-Promotor ; nptII : Kanamycinresistenzgen, OCS-T OCS- Terminator, DGR1 : Nukleinsäuresequenz kodierend für DGR1 Marker aus P. olsonii). Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen.

Fig. 5B Konstruktionsschema für das Plasmid pBi-Nit-P-DOGR1.

(Abkürzungen : LB/RB : Linke bzw. recht T-DNA-Grenze ; Nit- P : Nitrilase-I Promotor ; nos-T : nos-Terminator, nos-P : nos-Promotor ; nptII : Kanamycinresistenzgen, OCS-T OCS- Terminator, DOGR11 : Nukleinsäuresequenz kodierend für DOGR1 Marker aus s. cerevisae). Angegeben sind ferner wichtige Restriktionsschnittstellen.

Fig. 6 Effizienz der selektiven Regeneration sechs Wochen nach Transformation des originalen Hefegens DOGR1 (weiße Säulen) and des P. olsonii Gens DGR1 (gestreifte Säulen).

Die Regeneration fand während der gesamten sechs Wochen in Gegenwart der jeweils angegebenen selektiven Kompo- nente statt. Drei unabhängige Experimente wurden durchge- führt. Die Anzahl der eingesetzten Explantate betrug zwi- schen 100 und 250 für die Transformation von DGR1 and zwischen 20 and 70 für das Gen DOGR1.

Fig. 7 Selektive Regeneration von Tabakexplantaten nach Trans- formation der 2-DOG Resistenz verleihenden Gene DOGR1 und DGR1 in Gegenwart von 500,600 and 700 mg/1 2-DOG. Die Abbildung wurde fünf Wochen nach Versuchsbeginn aufge- nommen.

Fig. 8 : DOGR1 und DGR1 Transkripte in transgenen und nicht- transformierten Tabaklinien. a) mit P32 markierten DOGR1 (Hefegen) und DGR1 (Penicil- liumgen) Sonden hybridisierter Blot, b) RNA Agarosegel unmittelbar vor Transfer der RNA auf die Nylonmembran 1 : WT, 4 : GFP-Kontrolle ; 7,8, 9 : hybridisiert mit dem DOGR1 Gen und 10,11, 12 transgene Tabaklinien, die das Penicilliumgen DGR1 tragen, hybridisiert mit der entsprechenden Sonde.

Fig. 9 : HPLC-Profile zum Nachweis von 2-DOG-6-P in radioaktiv markierten Hefestämmen mit und ohne DGR1

Beispiele : Allgemeine Methoden : Die chemische Synthese von Oligonukleotiden kann beispielsweise, in bekannter Weise, nach der Phosphoamiditmethode (Voet, Voet, 2. Auflage, Wiley Press New York, S. 896-897) erfolgen. Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonierungs- schritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarosegelelektro- phorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nukleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Frag- menten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA werden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press ; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgt mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma ABI nach der Methode von Sanger (Sanger et al. (1977) Proc Natl Acad Sci USA 74 : 5463- 5467).

Beispiel 1 : Isolation und Charakterisierung der Nukleinsäure- sequenz kodierend für den erfindungsgemäßen Selek- tionsmarker aus P. olsonii.

Aus einem P. olsonii Stamm wurde die Nukleinsäuresequenz (cDNA ; SEQ ID NO : 1) kodierend für den erfindungsgemäßen Selektionsmar- ker isoliert. Die cDNA kodiert für ein offenes Leseraster (ORF) von 786 Nukleotiden und damit für ein 261 Aminosäuren umfassendes Protein (SEQ ID NO : 2). Da der aus P. olsonii gescreent ORF die Resistenz gegenüber 2-DOG beeinflusst, wurde das entsprechende Gen als DGRI-Gen, das Protein als DGRlp bezeichnet. Das Protein zeigt keine signifikante Homologie zu dem bekannten Genprodukt des DOGRl-Gens (Anmerkung : Das DOGR1-Gen kodiert für eine 2-Deo- xyglukose-6-phosphat Phosphatase aus S. cerevisiae ; EP-A 0 870 836 ; Kunze et al. (2001) Molecular Breeding 7 : 221-227).

Anhand der Aminosäuresequenz ließen sich folgende potentielle Eigenschaften ableiten : Anzahl der Aminosäuren : 261, theoretisches Molekulargewicht : 28,561 kDa, theoretischer pI : 4,87, Ausgehend von einer P. olsonii Phagemid-Genbank wurde das Plasmid pAD-GAL4-2. 1-DGRl mittels Helferphagen, wie im Instruction Manual-HybridZAP-2. 1 Two-Hybrid cDNA Gigapack Cloning Kit and HybridZAP-2.1 Two-Hybrid cDNA Synthesis Kit"der Fa. Stratagene

beschrieben, ausgeschnitten, im E. coli-System vermehrt und in die Hefe S. cerevisiae SEY6210 [a leu2-3-112 ura3-52 his3-A200 trplA901 lys2-801 suc2-A9] (Robinson JS, Klionsky DJ, Banta LM, Emr SD (1988) Mol Cell Biol 8 : 4936-4948) nach der im"Instruc- tion Manual-HybridZAP-2. 1 Two-Hybrid cDNA Gigapack Cloning Kit and HybridZAP-2. 1 Two-Hybrid cDNA Synthesis Kit"der Fa. Strata- gene beschriebenen Prozedur transformiert und auf SD-Medium (Rose MD et al. (1990) Methods in yeast genetics. A laboratory course manual. Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, New York) mit 1 % Glucose plus 1 mg/ml DOG ausplattiert. Unter diesen Bedingungen ist der untransformierte S. cerevisiae Stamm SEY6210 nicht mehr in der Lage zu wachsen.

Die Analyse von S. cerevisiae C13ABY S86/pAD-GAL4-2. 1-DGRl zeigte, dass sie auf flüssigem und festem SD-Medium plus 2-DOG- Konzentrationen bei denen der entsprechende Ausgangsstamm kein Wachstum aufweist, wachsen können. Für diese Analyse wurden die Transformanten in SD-Medium mit 1% Fructose (unter diesen Bedin- gungen ist der Ausgangsstamm sensitiver gegenüber 2-DOG) für 48 h kultiviert, geerntet und entsprechende Verdünnungsstufen auf SD- Medium mit 1% Fructose plus 2-DOG ausplattiert und alles für 5 Tage bei 30°C inkubiert. Im Gegensatz zum Ausgangsstamm S. cerevi- siae C13ABY S86, der bis maximal 0,2 mg/ml DOG Wachstum aufweist, lassen sich die Transformanten auch noch auf SD-Platten mit 1% Fructose und 0,5 mg/ml 2-DOG kultivieren. Damit weisen sie eine Steigerung in der Resistenz gegenüber 2-DOG auf (Fig. 5).

Beispiel 2 : Etablierung der DRGl-kodierenden Sequenz als Selek- tionsmarker in S. cerevisiae Zur Testung der Eignung von DGR1 als Selektionsmarker für die Hefetransformation wurde die für DGR1 kodierende Nukleinsäure- sequenz in ein S. cerevisiae Expressionsplasmid eingebaut, diese in S. cerevisiae transformiert und die Hefetransformanten über ihre Resistenz gegen 2-DOG selektiert.

Dazu wurde zunächst die für DGR1 kodierende Nukleinsäuresequenz mittels PCR aus dem sie umfassenden Plasmid pAD-GAL4-2. 1-DGR1 amplifiziert, wobei die Primer DGRIPst und DGRlBam (Tab. 1 ; SEQ ID NO : 7 und 8) so gewählt wurden, dass das Amplifikationsprodukt von den Erkennungsregionen der Restriktionsendonukleasen PstI bzw. BamHI flankiert war. Dieses Fragment wurde in das S. cere- visiae Expressionplasmid YEP112A1NE (Riesmeier JW et al. (1992) EMBO J 11 : 4705-4713) zwischen den ADH1-Promotor und dem ADH1-Ter- minator von S. cerevisiae eingebaut. Der ADHl-Promotor ist ein

starker konstitutiver Promotor und bewirkt eine konstitutive Expression von Dgrlp in S. cerevisiae (Fig. 7).

Tabelle 1 : Primer zur Amplifikation des DGRl-Gens Name Sequenz Seq ID NO DGRlPst 5'-CTG CAG ATG GCA ACC CCC CAA ACA GT 7 DGRlBam 5'-GGA TCC TTA TCT AGA TCC CCT CGA AGT C 8 DGRINcoI 5'-CCA TGG CAA CCC CCC AAA CAG T 9 DGRlSal 5'-GTC GAC TTA TCT AGA TCC CCT CGA AGT C 10 Das Plasmid YEpll2-DGRl wurde anschließend in S. cerevisiae SEY6210 nach der Methode von Ito et al. (Ito T et al. (1987) J Bacteriol 169 : 4171-4176) transformiert und die Transformanten über die Resistenz gegenüber 2-DOG bzw. die Komplementation der trpl Mutation durch das TRPl-Gen selektiert. Dazu wurden sie auf 1) SD-Agar mit 1% Fructose ohne Tryptophan, 2) SD-Agar mit 1% Fructose ohne Tryptophan mit 0,5 mg/ml 2-DOG und 3) SD-Agar mit 1% Fructose mit Tryptophan plus 0,5 mg/ml 2-DOG ausplattiert.

Bei Nutzung allein des TRPl-Selektionsmarkers werden Transforma- tionsfrequenzen von 5, 0 x 102 Transformanten pro jig DNA erreicht.

Wird gleichzeitig über den TRP1-und den DGR1-Selektionsmarker selektiert, kommt es zu einem geringen-statistisch insignifi- kanten-Abfall in der Transformationsfrequenz.

Wird auf die Resistenz gegenüber 2-DOG selektiert, so lassen sich im Gegensatz zu den Kontrollen (Versuchsansatz ohne DNA) 2-DOG- resistente Kolonien erhalten. Diese waren auf die Gegenwart des entsprechenden Plasmides zu prüfen. Dazu wurden die Kolonien so- wohl auf die Komplementation des TRPl-Selektionsmarkers als auch auf das Vorhandensein des zur Transformation genutzten Plasmides geprüft. 80 bis 90% aller 2-DOG-resistenten Kolonien komplemen- tierten auch die trpl-Mutation. Für die Überprüfung der in den Hefetransformanten S. cerevisiae SEY6210/YEpll2-DGRl enthaltenen Plasmide wurde deren pDNA isoliert und in E. coli retransfor- miert. Von den dabei erhaltenen E. coli-Transformanten wurde die pDNA isoliert und deren Restriktionsmuster mit dem des zur Trans- formation genutzten Plasmides verglichen. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Restriktionsmuster der Plasmide von S. cerevi-

siae SEY6210/YEpll2-DGRl mit dem des Ausgangsplasmides YEpll2-DGRl identisch waren.

Tabelle 2 : Transformationsfrequenzen von S. cerevisiae SEY6210 mit dem Plasmid Yepll2-DRGl nach Selektion über den Auxotrophie-und/oder DGR1-Marker. genutzter genutztes Selektionsmedium Transformanten Selektionsmarker pro gg DNA TRP1 SD-Medium + 1% Fruktose 5,0 x 102 ohne Tryptophan TRP1 und DGR1 SD-Medium + 1% Fruktose 4,3 x 102 ohne Tryptophan + 0,5 mg/ml DOG DGR1 SD-Medium + 1% Fruktose 1,2 x 102 mit Tryptophan + 0,5 mg/ml DOG Beispiel 3 : Etablierung der DGRl-kodierenden Sequenz als Selek- tionsmarker zur Transformation von Pflanzen Die DGR1 kodierende Sequenz wird im Vergleich zum Hefegen DOGR1 hinsichtlich ihrer Eignung als Selektionsmarker für die Pflanzen- transformation getestet werden. Zu diesem Zweck werden die fol- genden Konstrukte wie folgt hergestellt : 3.1 Herstellung des Konstruktes pBiNit-P-DOGR1 Das in EP-A 0 870 836 beschriebene Konstrukt BINAR-DOGR1 wird wie das den Nitrilase-I Promotor aus Arabidopsis thaliana (GenBank Acc. -No. : U38846, Nukleotide 3862 bis 5342 ; GenBank Acc. -No. : Y07648.2, Nukleotide 2456-4340, Hillebrand et al. (1996) Gene 170 : 197-200) umfassende Konstrukt pNitl8 (SEQ ID NO : 19) mit den Restriktionsenzymen EcoRI und BamHI verdaut. Der in dem Konstrukt BINAR-DOGR1 enthaltene Promotor wird dadurch deletiert. Dieses Fragment und das Nitrilase-I Promotor tragende Fragment aus pNitl8 werden anschließend ligiert, was zu dem Binärplasmid pBi- Nit-P-DOGRl führt (Fig. 5A).

3.2 Herstellung des Konstruktes pBiNit-P-DGRl Die Plasmide pBiNit-P-DOGRl und das in Beispiel 1 beschriebene Plasmid pAD-GAL4-2. 1-DGR1 werden mit den Restriktionsenzymen NcoI und SalI verdaut. Dadurch kann das originale Hefegen DOGR1 aus dem Plasmid pBiNit-P-DOGR1 entfernt und durch das DGR1 tragende NcoI- SalI Fragment ersetzt werden (Fig. 5B). Dazu wurde zunächst die

für DGR1 kodierende Nukleinsäuresequenz mittels PCR aus dem sie umfassenden Plasmid pAD-GAL4-2. 1-DGR1 amplifiziert, wobei die Primer DGRINcoI und DGRlSalI (Tab. 1 ; SEQ ID NO : 9 und 10) so gewählt wurden, dass das Amplifikationsprodukt von den Erken- nungsregionen der Restriktionsendonukleasen NcoI bzw. SalI flan- kiert war. Durch Ligation des von pBiNit-P-DOGRl verbleibenden Vektorfragmentes mit dem oben beschriebenen NcoI/SalI-verdauten DGR1-PCR Produkt wird das Plasmid pBiNit-P-DGRl erhalten.

3.3 Verwendung von DGR1 als Selektionsmarker für die Trans- formation von Tabak Für die Transformation von Tabak werden die Nukleinsäuresequenzen kodierend für DOGR1 (aus Saccharomyces cerevisiae) und DGR1 (cDNA aus P. olsonii) im Vergleich transformiert. Zu diesem Zweck wer- den die oben beschriebenen Vektoren pBiNit-P-DOGR1 bzw. pBiNit- P-DGR1. Die beiden Konstrukte werden separat in den Agrobakte- rienstamm EHA105 übertragen und jeweils für drei unabhängige Experimente verwendet.

Blattstücken von jungen in vitro Pflanzen des Kultivars Nicotiana tabacum cv. SNN werden in ca. 1 cm2 Stücke geschnitten und in eine Petrischale, die ca. 20 ml flüssiges MS Medium enthält, in dem die pelletierten Agrobakterien resuspendiert werden, zum Zwecke ihrer Infektion überführt. Die optische Dichte der Agrobakterien- suspension sollte zwischen 1 und 2 (0D6oonm) liegen und ergibt sich durch Resuspendierung in demselben Volumen der zentrifugier- ten Übernachtkultur, die in Kanamycin haltigem (50 mg/l) YEB Medium erfolgt.

Die Infektion findet für ca. 20 Minuten bei Raumtemperatur unter langsam rotierendem Schütteln statt. Anschließend wird die Agro- bakteriensuspension abgesaugt und die Blattstücke für die Co-Kul- tur auf festes MS Medium übertragen. Die Platten werden mit Para- film verschlossen und im Dunkeln bei 24°C für zwei Tage inkubiert.

Danach werden die Explantate unter selektiven Bedingungen wie folgt regeneriert. Die Explantate beider Transformationsansätze (DOGR1 und DGR1) werden auf festes MG Medium (MS mit 1,6 % Glu- kose, 1 mg/1 BAP, 0,2 mg/1 NAA, 500 mg/1 Timentin) sowie mit un- terschiedlichen 2-DOG Konzentrationen (500,600 bzw. 700 mg/l) übertragen und bei 24°C im schwachen Licht (50 bis 100 RM/m2s) inkubiert. Alle zwei Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medium. Wie oben erwähnt, werden jeweils drei unab- hängige Experimente durchgeführt. In Experiment I wird der 2-DOG Selektionsdruck nach 6 Wochen entfernt, bei den beiden folgenden Experimenten bleibt 2-DOG während der gesamten Regeneration im Medium. Fig. 6 zeigt das Ergebnis der quantitativen Auswertung

der selektiven Regeneration nach sechswöchiger Kultur. Die Anzahl der eingesetzten Explantate beträgt zwischen 100 und 250 für die Transformation von DGR1 and zwischen 20 and 70 für das Gen DOGR1.

DGR zeigt insofern eine signifikant bessere Effizienz bei der Selektion entsprechend transformierter Tabakzellen.

Bei den 2-DOG Selektionen wurden Unterschiede in Abhängigkeit des verwendeten Gens deutlich. Bei Verwendung des Hefegens DOGR1 wurden Regenerationseffizienzen von 35 %' (500 mg/1 2-DOG), 15 % (600 mg/1 2-DOG) und 21 % (700 mg/1 2-DOG) erfasst während nach Einsatz von DGR1 aus P. olsonii bei den entsprechenden 2-DOG Konzentrationen Regenerationseffizienzen von 49 %, 60 % bzw. 56 % registriert wurden. (Fig. 10 zeigt repräsentative Explantate aus den Versuchsvarianten nach fünf wöchiger Regenerationszeit).

Überraschenderweise konnte bei der Mehrzahl der Experimente keine Korrelation zwischen 2-DOG verursachten Schädigungen der Explan- tate und der 2-DOG Konzentration festgestellt werden. Meistens sahen die Explantate, die in Gegenwart von 600 und 700 mg/1 2-DOG regeneriert worden sind besser aus als diejenigen, die mit 500 mg/1 2-DOG inkubiert worden waren. Diese Beobachtung war unab- hängig davon ob DGR1 oder DOGR1 als Selektionsmarker verwendet wurde.

Nachdem die regenerierten Sprosse bewurzelt waren, wurden sie mit Hilfe der genomischen PCR Analyse hinsichtlich ihrer Transgenizi- tät analysiert. Dabei wurde das Gen nptII, das sich in beiden Expressionskonstrukten ebenso wie die 2-DOG Resistenz verleihen- den Selektionsmarker auf der T-DNA befand, amplifiziert. Da eine nptII positive Reaktion auch durch die Gegenwart kontaminierender Agrobakterien DNA verursacht werden kann, ist als Kontrollreak- tion das Agrobakteriengen virD2 amplifiziert worden. Bei virD2 positiven Proben ist eine Entscheidung über die Transgenizität nicht möglich.

Tabelle 3 : Ergebnis der genomischen PCR Analyse putativ transgener Tabakpflanzen, die, wie angezeigt selektiert worden sind. In Experiment I erfolgte die 2-DOG Selektion für sechs Wochen. Anschließend wurden die Explantate, die bis zu diesem Zeitpunkt kleine Sprossansätze entwickelt hatten, 2-DOG-frei weiter kultiviert. In Experiment II war 2-DOG während der gesamten Regeneration in den jeweiligen Konzentrationen anwesend. 500 mg/l 600 mg/l 700 mg/l 2-DOG 2-DOG 2-DOG Z npt vir 1 npt vir X npt vir II+ D+ II+ D+ II+ D+ DOGR1 I 12 9 0 11 8 0 10 5 0 DOGR1 II 12 12 0 12 12 0 11 11 0 DGR1 1 12 10 0 12 10 0 12 5 1 DGR1 II 11 11 1 10 10 0 12 12 0 E : insgesamt getestete Tabakpflanzen nptII+ : Anzahl der auf nptII positiv getesteten Tabakpflanzen virD+ : Anzahl der auf virD positiv getesteten Tabakpflanzen Im Falle der 2-DOG selektierten Pflanzen zeigten sich Unter- schiede zwischen den beiden Experimenten. Wenn 2-DOG nach sechs wöchiger Regenerationszeit (Experiment I) abgesetzt wird, sind- nach Transformation mit dem DOGRl-Gen-drei von 12 (500 mg/1 2-DOG), drei von 11 (600 mg/1 2-DOG) bzw. fünf von zehn (700 mg/1 2-DOG) regenerierten Pflanzen nicht transgen. Pflanzen aus Expe- riment II sind dagegen-unabhängig ob mit DOGR1 oder DGR1 trans- formiert-bis auf eine Ausnahme (DGR1-500 mg/1 2-DOG) alle transgen. Da die Versuchsauswertung hinsichtlich der selektiven Regenerationseffizienz noch zu einem Zeitpunkt vorgenommen worden ist, wo bei allen Experimenten 2-DOG bis zum Zeitpunkt der Aus- wertung anwesend war, können diese Effizienzen als tatsächliche Transformationseffizienzen angenommen werden. Das bedeutet, dass DGR1-unter den hier zugrundeliegenden experimentellen Bedingun- gen-signifikant höhere Transformationseffizienzen bei Tabak liefert als das das bekannte DOGR1.

Einige der transgenen Pflanzen wurden hinsichtlich der Gegenwart der 2-DOG Resistenz verleihenden Sequenz (DOGR1 bzw. DGR1) über- prüft (Tab. 4).

Tabelle 4 : PCR-Analyse nptII positiv getesteter Tabaklinien hin- sichtlich der Gegenwart die 2-DOG Resistenz verleihen- den Sequenz (DOGR1 bzw. DGR1).

Konstrukt und E : DOGR1 + DGR1 + Selektion DOGR1 13 10 n. d. 500 mg/1 2-DOG DOGR1 10 10 n. d. 700 mg/1 2-DOG DGR1 10 n. d. 10 500 mg/1 2-DOG DGR1 10 n. d. 9 600 mg/1 2-DOG DGR1 15 n. d. 14 700 mg/1 2-DOG Anzahl der insgesamt getesteten nptII positiven Linien DOGR1+ Positiv auf DOGR1 getestet DGR1+ Positiv auf DGR1 getestet n. d. nicht durchgeführt Transgene Pflanzen, die für das nptII Gen positiv getestet worden sind, enthielten in der Regel auch die 2-DOG Resistenz verlei- hende Sequenz.

4.1. 1. Genomische PCR Analyse Von den zu testenden, putativ transgenen Pflanzen sowie von nicht transformierten Wildtyppflanzen wurde die genomische DNA aus ca.

100 mg Material junger Blätter von in vitro Pflanzen mit Hilfe des Qiagen DNeasy plant mini kit (Katalog-Nr. 69106) nach den In- struktionen des Herstellers isoliert. Die DNA wurde in 100 1 re- suspendiert. 5 1 der so isolierten DNA wurde in einer Gelelek- trophorese auf Qualität und Quantität geprüft. 2 1 der so iso- lierten DNA sind jeweils für eine PCR Reaktion eingesetzt worden.

Das nptII Gen wird durch die Verwendung der beiden Primer KR-05 und KR-06 amplifiziert wobei ein Fragment von 515 bp entsteht.

Als Kontrolle für die Gegenwart von kontaminierender Agrobakte- rium tumefaciens DNA wird das Gen virD2 mit den Primern KR-07 und KR-08 amplifiziert. Das entsprechende Fragment hat eine Größe von 338 bp (Tab. 5). Der PCR-Ansatz setzte sich wie folgt zusammen :

17,5 µl H2O 2,5 pLi 10x Puffer 2,0 1 dNTPs 1,25 lu. jeden Primers 2, 0 µl genomische DNA 0,1 µl Taq Polymerase (Takara, Japan) Folgende Inkubationsschritte liefen ab : 95°C-5 min 62°C-1 min 72°C-1 min 95°C-0, 5 min 24 malige Wiederholung der Schritte 2 bis 4 62°C-1 min 72°C-10 min 4°C-Stop Im Anschluss an die PCR Reaktion sind 5 µl der einzelnen Proben mit 5 til Stopperlösung (10 mM Tris HCl, pH 8,0, 50% Glycerin, 0,05 % SDS, 0,2 % Xylencyanol) versetzt und in einem 1% igen Agarosegel aufgetrennt worden. Nach Ablauf der elektrophoreti- schen Trennung bei 100 V für 30 min wurde das Gel unter W-Licht ausgewertet.

Tab. 5 : Primer für die PCR-Analyse Name Sequenz Tem-Fragment- plate größe (bp) KR-05 upper 19-mer (SEQ ID NO : 11) nptII 515 5'-GGGCGCCCGGTTCTTTTTG-3 KR-06 lower 21-mer (SEQ ID NO : 12) 5-ACACCCAGCCGGCCACAGTCG-3 KR-13 upper 20mer (SEQ ID NO : 13) virD2 338 5'-ATGCCCGATCGMGCTCAAGT-3' KR-14 lower 20 mer (SEQ ID NO : 14) 5'-CCTGACCCAAACATCTCGGC-3' KR-07 upper 20-mer (SEQ ID NO : 15) DGR1 571 5-CCACAGCGCCGAAGTCCTCT-3 KR-08 lower 24-mer (SEQ ID NO : 16) 5-GTCCGTATCCCTCACCATCATCTC-3 KR-09 upper 27-mer (SEQ ID NO : 17) DOGR1 741 5-CCATGGCAGAATTTTCAGCTGATCTAT-3 KR-10 lower 21-mer (SEQ ID NO : 18) 5-TACTCAGGCCCTTGTCAAAGG-3'

Beispiel 5 Herstellung des Transformationsvektors pSUN3-Nit- P-DGR1 Das Asp718/HindIII Fragment (die Nitrilasel Promoter : : GUS Fusion enthaltend) wird in das Plasmid pSUN3 (WO 02/00900) ebenfalls mit Asp718/HindIII gespalten, kloniert. Mittels Restriktionsanalyse wird das entstandene Konstrukt pSUN3-Nit-P-DGRl überprüft.

Beispiel 6 : Verwendung von DGR1 als Selektionsmarker für die Transformation von Raps Für die Transformation von Raps wird das oben beschriebene (Bei- spiel 5) Konstrukt pSUN3-Nit-P-DGRl verwendet, das sowohl das nptII Gen als auch das Gen DGR1 enthält und demzufolge die Selek- tion sowohl für Kanamycin-als auch für 2-DOG Resistenz erlaubt.

Das Konstrukt wird in den Agrobakterium tumefaciens Stamm GV3101 übertragen und für drei unabhängige Transformationsexperimente verwendet.

Oberflächen-sterilisierte Rapssamen werden auf das Keimungsmedium MSB5 [MSB5 (Duchefa), 3% Saccharose, 0, 8% Agar, pH5, 8] gelegt.

Die Keimung findet für 4 d bei 24°C und einer Lichtintensität von < 50 UMol/m2s statt.

Ein Tag vor der Transformation wird ausgehend von einer Glyzerin- kultur (1 ml, in 10% Glyzerin, aufbewahrt bei-80°C, hergestellt durch Mischung von 900 gel einer ÜN + 100 Al steriles Glycerin) 50 ml YEB Medium [5 g/1 Beef extract, 1 g/1 Yeast Extract, 5 g/1 Peptone, 5 g/1 Sucrose, 0,49 g/l MgSO4] + 100 mg/1 Spectinomycin beimpft. Die Kultur wird für ca. 24 h bei 28°C unter Schütteln an- gezogen.

Am Tag des Transformationsstarts werden von den vier Tage alten Keimlingen die Kotyledonen mit ihren Petiolen präpariert. Die Pe- tiolen werden derart in das Co-culturmedium [Keimungsmedium, al- lerdings pH5,2, + 0, 5 g/1 MES, + 0, 5 mg/1 GA3 + 3, 75 mg/1 BAP] gesteckt, daß das Cotyledo den Agar nicht berührt. Um ein Aus- trocknen der Sämlinge während der Präparation zu vermeiden, wer- den nur 5 Sämlinge zeitgleich aus dem Keimungsbecher entnommen.

Sobald die Petiolen eines Sämlings präpariert worden sind, werden diese sofort ins Co-Kulturmedium überführt.

Nachdem die Präparation abgeschlossen ist werden die Explantate einzeln herausgenommen und die Petiolen für ca. 2 bis 3 Sekunden in die Agrobakterium tumefaciens Suspension getaucht. Das Coty- ledo sollte dabei nicht benetzt werden. Unmittelbar danach werden die infizierten Explantate für die dreitägige Co-Kultur in das

Medium auf die gleiche Weise zurückgesteckt (max. 20 pro Platte). Die optische Dichte der Bakteriensuspension wird be- stimmt und mit flüssigem Co-Kulturmedium derart verdünnt, dass sich eine optische Dichte von 0,5 ergibt. 10 ml der so einge- stellten Bakterienkultur werden in kleine Petrischalen gefüllt, die für das Dippen verwendet werden. Eine Schale wird für das Dippen von maximal 300 Petiolen verwendet. Die Co-Kultur findet für 3 Tage bei 24°C im schwachen Licht (ca. 50 RMol/m2s) statt.

Nach der Co-Kultur werden die Explantate (10 Explantate pro Platte) auf Regenerationsmedium (Co-Kulturmedium + 18 mg/1 Kana- mycin, + 300 mg/1 Timentin) überführt. Alle 4 Wochen erfolgt der Transfer der Explantate auf frisches Medium. Sobald die Explan- tate einen oder mehrere recht gut entwickelte Sprosse gebildet haben, werden sie in ELRO-1 Medium (MS Medium, 2% Saccharose, pH 5,8, 0, 5% Agar, 100 mg/1 myo-Inositol, 40 mg/1 Adeninsulfat, 500 mg/1 MES, 0,0025 mg/1 BAP, 150 mg/1 Timentin, 15 mg/l Kanamy- cin, 0,1 mg/1 IBA) überführt.

Wenn die Elongation beginnt und die Sprosse gut entwickelte Sprossachsen haben, werden sie vom Explantat getrennt. Sobald Wurzeln gebildet werden, erfolgt die Probennahme für die PCR Analyse. Die sprossbildenden Explantate werden fortlaufend numme- riert. Jeder Sproß dieses Explantates bekommt eine separate Nr.- Beispiel 23/1 bedeutet erster Sproß von Explantat 23.

ELRO-2 Medium entspricht ELRO-1 Medium ohne BAP. Es wird bei Be- darf für schwer bewurzelbare Sprosse verwendet.

Tabelle 6 enthält die Ergebnisse der ersten drei unabhängigen Transformationsexperimente. Tab. 6 : Transformation des Gens DGR1 in Raps. Transgene Pflan- zen werden parallel für Kanamycin-und für 2-DOG Resistenz selektioniert.

Exp Selec-Anz. Ex-PCR Ins GWH trans-PTEa tion plantate ferierte Pfl. von Explanta- ten _ # ge-nptI DGR1 MIN . testet I+ + 1 300 220 15 1 2 2 von 2 DOG 0,9 0,9 18 KAN 218 3 2 2 2 von 1 0,45 0,9 2 300 200 36 22 22 22 von 3 DOG 1,5 11,0 18 KAN 200 33 21 25 25 von 10 5, 0 12,5 3 300 150 21 7 7 7 von 1 DOG 0, 7 4,7 15 KAN 140 26 12 6 12 von 4 _ 2, 9 8,6 2-DOG Selektion, durchschnittliche Effizienz 1,0 5,5 KAN Selektion, durchschnittliche Effizienz 2,8 7,3 PTE ="preliminary transformation efficiency" (vorläufige Trans- formationseffizienz) definiert wie folgt : Vorläufige Transforma- tionseffizienz in %, die sich aus der Anzahl transgener in vitro Pflanzen bezogen auf die Anzahl der zur Transformation eingesetz- ten Explantate ergibt.

In drei unabhängigen Experimenten wird parallel sowohl für 300, 400 und 500 mg/1 2-DOG Resistenz als auch für Kanamycin Resistenz selektioniert. Putative transgene in vitro Pflanzen werden mit Hilfe der genomischen PCR auf die Gegenwart der Gene nptII, DGR1 und virD2 geprüft. Alle virD2 negativen Pflanzen bedeuten, dass keine kontaminierende Agrobakterium tumefaciens DNA anwesend sind (Ergebnis nicht gezeigt). Die Selektion transgener Pflanzen ist bei einer Konzentration von 300 mg/1 2-DOG möglich. Regeneration in Gegenwart von 400 und 500 mg/1 2-DOG ist nicht möglich (Daten nicht gezeigt). Die Anzahl der Explantate, die transgene Pflanzen produzieren ist sowohl mit 2-DOG als auch mit Kanamycin gering.

Doch die wenigen Explantate produzieren etliche Pflanzen, von de- nen jedoch nicht klar ist, ob sie das Ergebnis unabhängiger

Transformationsereignisse sind oder nachträglich aus einem Trans- formationsereignis entstanden sind.

Mit Hilfe der 2-DOG Selektion wird eine vorläufige Transformati- onseffizienz von 1 bis 5,5 erzielt während die Kanamycin-Selek- tion 2,8 bis 7, 3% liefert. Dies zeigt, dass eine Selektion mit 2-DOG unter Verwendung des DGRl-Markers mit einer der Kanamycin- Selektion vergleichbaren Effizienz erfolgt.

Beispiel 7 : In vivo Experiment zur Charakterisierung des DGR1 Genproduktes unter Verwendung von Tabak-Pflanzen- material Im Folgenden wird ein Experiment erläutert, dessen Ergebnis zeigt, das das Penicillium olsonii DGR1 Genprodukt im Gegensatz zu dem Genprodukt des aus der Hefe stammenden Gens DOGR1 nicht für eine 2-DOG-6-P Phosphatase codiert. Das bedeutet, dass der durch das Penicillium Gen DGR1 bewirkte 2-DOG Resistenzmechanismus nicht auf einer Dephosphorylierung von 2-DOG-P beruht, wie er in Patent EP-A 0 870 836 für das Hefegen DOGR1 beschrieben ist.

Der Nachweis einer eventuellen in vivo Funktionalität der 2-DOG-6-P Phosphatase wird wie folgt durchgeführt : Blattscheiben (ca. 100 mg Frischgewicht) von transgenen Tabakpflanzen, die entweder das Penicillium Gen DGR1 bzw. das Hefegen DOGR1 tragen oder zur Kontrolle ein beliebiges Fremdgen (z. B. Green Fluorescen Protein-GFP), dessen Genprodukt nicht an der Ausprägung der 2-DOG Resistenz beteiligt ist, exprimieren sowie von nicht trans- formierten Kontrollpflanzen werden für 24 Stunden im Dunkeln in 300 mM 2-DOG Lösung inku-biert. Anschließend werden die Blatt- scheiben eine Minute mit Wasser gewaschen und in flüssigem Stick- stoff eingefroren. Zur Extraktion der Metabolite wird das Pflanzenmaterial in auf Trockeneis vorgekühlten Mörsern zu einem feinen Pulver homogenisiert und mit 1,5 ml 16 % (w/v) Trichlor- essigsäure (TCA) in Diethylether (vorgekühlt auf 4°C) versetzt.

Anschließend werden die Homogenate für 15 Minuten auf Trockeneis inkubiert. Durch Zugabe von 0,8 ml 16% TCA, 5 mM EGTA werden die Metabolite gelöst. Nach Transfer der Homogenate in Eppendorfge- fäße werden diese 3 Stunden bei 4°C inkubiert. Anschließend werden die Proben 5 Minuten bei 15.000 rpm und 4°C in einer Biofuge 15R (Heraeus) zentrifugiert. Die wäßrige Phase wird in Eppendorfge- fäße überführt und 4mal mit wassergesättigtem Ether gewaschen.

Danach werden die Proben mit 5 M KOH/1 M Triethanolamin-Gemisch neutralisiert und für 1 Minute mit Stickstoff begast. Die so vor- bereiteten Proben werden mittels HPLC analysiert. Für die Analyse wird ein HPLC System der Firma Dionex verwendet, welches mit einer PA-1 (4x250 mm) Säule und einem gepulsten elektrochemischen

Detektor ausgestattet ist. Vor der Injektion werden die Proben für 2 Minuten bei 13.000 rpm abzentrifugiert. Metabolite werden anschließend mit einem 50-minütigen konkaven Gradienten von 1 mM bis 500 mM Natriumacetat nach 40 Minuten bei 10 mM NaOH und einer Durchflußrate von lml/min eluiert. Zur Identifizierung und Quantifizierung von 2-DOG-6-P wird als Standard 2-DOG-6-P der Firma Sigma verwendet.

Wie in Tabelle 7 dargestellt, führt die Expression der 2-DOG-6-P Phosphatase codiert von dem Hefegen DOGR1 wie erwartet zu einer Verminderung der 2-DOG-6-P Akkumulation. Dies ist jedoch nicht der Fall bei Expression des Penicillium Gens DGR1. Das Ausbleiben der Verminderung der 2-DOG-6-P Akkumulation legt nahe, dass das DGR1 Genprodukt keine Phosphataseaktivität besitzt.

Tab. 7 : Nachweis von 2-DOG-6-P in Blattscheiben : von transgenen und nichttransformierten Tabakpflanzen. Transgen 2-DOG-6-P 2-DOG-6-P (nmol) (% der Wildtyp- Kontrolle) Nicht vorhanden (Wildtyp) 223,28 72 100 GFP 340, 55 68 153 30 Hefegen DOGR1 41, 81 26 19 12 Penicilliumgen DGR1 406, 8 i 122 182 + 55 Die Daten entsprechen den Mittelwerten Standardabweichung.

Ob die in Tabelle 7 zusammengefaßten Ergebnisse lediglich auf Expressionsunterschiede der beiden 2-DOG Resistenz verleihenden Gene zurückgeführt werden müssen oder tatsächlich durch die Wirkung unterschiedlicher Genprodukte zustande kommen, sollen Northernblot Analysen klären. Das gleiche Blattmaterial, das für die HPLC Analysen zur Quantifizierung des 2-DOG-6-P ver- wendet worden ist, wird für einen semiquantitativen Vergleich der Expressionslevel der beiden Gene verwendet. Hierzu werden ebenfalls Blattproben der ins Gewächshaus überführten Pflanzen geerntet und für die Extraktion der Gesamt-RNA verwendet. Die Extraktion der Gesamt RNA, ihre gelelektrophoretische Auftrennung sowie ihr nachfolgender Transfer auf eine Nylonmembran, die schließlich zur Hybridisierung eingesetzt wird, ist in dem Patent EP-A 0 870 836 beschrieben.

Abb. 8 zeigt die Akkumulation von DOGR1 bzw. DGR1 Transkripten in transgenen Tabakpflanzen, die die entsprechenden Gene tragen.

Wildtyppflanzen bzw. transgene Pflanzen, die das Reportergen GFP besitzen, akkumulieren erwartungsgemäß keine entsprechenden

Transkripte. Da jeweils alle drei Linien (7,8, 9 bzw. 10,11, 12) ihre 2-DOG Resistenz verleihenden Gene exprimieren, sind die oben beschriebenenen Unterschiede in den 2-DOG-6-P Mengen nicht durch Expressionsunterschiede, sondern mit großer Wahrscheinlich- keit durch Unterschiede im Wirkmechanismus zu erklären.

Beispiel 8 : In vivo Experiment zur Charakterisierung des DGR1 Genproduktes unter Verwendung von Hefekulturen Ein vom bekannten 2-DOG-6-P Phosphatasesystem abweichender Wirk- mechanismus kann auch mit Hilfe von Hefekulturen unter Verwendung von radioaktiv markiertem 2-DOG erbracht werden. Dazu werden der S. cerevisiae DGR1-Stamm gemeinsam mit seinem DGR1-freien Aus- gangsstamm als Kontrolle (siehe Beispiel 1) in Gegenwart von 14C-2-DOG für 5 Stunden (Pulse) in flüssigem Minimalmedium kulti- viert und anschließend für weitere 3 Stunden ohne radioaktiv mar- kiertes 2-DOG inkubiert (Chase). Nach dem 5-stündigen Pulse als auch nach dem 3-stündigen Chase werden die Zellen durch Zentri- fugation bei 8.000 rpm für 10 Minuten bei 4°C geerntet und dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend wird das Zell- pellet in flüssigem Stickstoff eingefroren und wie im Beispiel 7 beschrieben aufgeschlossen. Akkumuliertes 2-DOG-6-P wird durch HPLC Analyse detektiert (Abb. 9). Dabei zeigt es sich, dass 2-DOG-6-P während des 5-stündigen"Pulses"sowohl in Kontroll- zellen als auch in Zellen des DGR1-Stammes akkumuliert wird.

Diese Akkumulation erklärt sich durch die Aufnahme des radioaktiv markierten 2-DOG und seine Phoyphorylierung durch die Hefe-eigene Hexokinase. Auch in dem sich anschließenden 3-stündigen Chase" ist in beiden Stämmen noch das Phosphat nachweisbar. Wenn DGR1 für eine 2-DOG-6-P Phosphatase codieren würde, so sollte diese Akkumulation sowohl während des"Pulses"als auch während des "Chases"unterbleiben oder doch mindestens deutlich niedriger sein als bei dem DGR1-freien Kontrollstamm. Da dies jedoch nicht der Fall ist, ist ein anderer als der bekannte Phosphatase- mechanismus für DGR1 bzw. sein Genprodukt naheliegend.