Mangel an von Willebrand Faktor-spaltender Protease wurde bei Patienten mit TTP festgestellt, wahrend Patienten mit hamoly- tisch-uramischem Syndrom (HUS) eine normale Aktivitat der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease aufwiesen. Abgesehen von den bisher bereits beschriebenen verschiedenen aufwendigen Ver- fahren (Blood 1996 ; 87 : 4223) ist zur Zeit kein Bestimmungsver- fahren der Aktivität der von Willebrand Faktor-spaltenden Pro- tease verfügbar. Ein einfaches Bestimmungsverfahren wurde die Unterscheidung zwischen TTP und HUS erleichtern und so ein bes- seres Monitoring der Therapie von Patienten mit TTP erlauben.

Es wurde nun überraschenderweise gefunden, dass ein Testkit, be- stehend aus einer von Willebrand Faktor-Standardpraparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivität ist, als Substrat fur die von Willebrand Faktor-spaltende Aktivitat in einer Probe oder im Patientenplasma und einem System zur quanti- tativen Bestimmung der Bindung von von Willebrand Faktor an Col- lagen die Analytik der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease und die Differentialdiagnostik zwischen Patienten mit thrombo- tisch thrombozytopenischer Purpura und Patienten mit hamoly- tisch-uramischem Syndrom erstmals auf einfache Weise ermõglicht.

Die von Willebrand Faktor-Standardpraparation kann dabei sowohl spezifisch hinsichtlich von Willebrand Faktor-spaltender Pro- tease inaktiviert sein, es kann dabei aber ebenso eine generell Protease-inaktivierte von Willebrand Faktor-Standardpraparation verwendet werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Testkits erfolgt die quantitative Bestimmung der Collagen-Bin- dungsaktivitat an immobilisiertem aviden Collagen, welches vor- zugsweise an eine Mikrotiterplatte gebunden vorliegt.

Gunstig ist dabei, wenn das immobilisierte Collagen kovalent ge- bunden ist.

Weiters ist dabei vorteilhaft, wenn das avide Collagen ein enzy- matisch abgebautes, lösliches, humanes Collagen ist.

Vorzugsweise ist die von Willebrand Faktor-Standardpraparation ein humanes Referenzplasma, bei welchem die von Willebrand Fak- tor-spaltende Proteaseaktivitat inaktiviert ist.

Gemaß noch einer weiteren Ausfuhrungsform ist vorgesehen, dass die von Willebrand Faktor-Standardpraparation ein rekombinanter von Willebrand Faktor ist.

Günstig ist auch, wenn die von Willebrand Faktor-Standardprapa- ration ein von Willebrand-Faktor-Dimer ist.

Weiters betrifft die vorliegende Erfindung auch noch ein Verfah- ren zum Nachweis eines erworbenen oder kongenitalen Mangels der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease, wobei eine von Wille- brand Faktor-Standardpraparation, die frei von von Willebrand Faktor-spaltender Aktivität ist, als Substrat mit der von Wille- brand Faktor-spaltenden Aktivität des Patientenplasmas oder Ver- dünnungen desselben in Kontakt gebracht wird und nach Inkubation die quantitative Detektion des residualen von Willebrand Faktors durch seine Bindungseigenschaften an Collagen erfolgt.

Die beiliegenden Abbildungen zeigen das erfindungsgemaBe Test- prinzip und die Anwendung zur Diagnostik von Patientenplasmen.

Die tbereinstimmung der komplizierten SDS-Agarose gelelektropho- retischen Qualifizierung mit anschließendem Immunblotting mit der quantitativen Methode des erfindungsgemäßen Collagen-Bin- dungstests (CBA) ist ebenfalls in den beiliegenden Abbildungen dargestellt.

Erfindungsgemäß wurden Verdünnungen von Patienten-und Normal- plasmen mit Barium aktiviert und mit unverdunntem vWF-Substrat versetzt. Als Substrat wurde ein Protease-inaktiviertes Plasma benutzt. Nach zwei Stunden Verdauung in Anwesenheit von Urea wurde die Reaktion gestoppt und das Inkubationsgemisch auf eine ELISA-Platte gegeben, die zuvor mit Collagen beschichtet worden war. Die langen vWF-Multimere binden sehr stark an das Collagen, die kleinen Moleküle kaum oder gar nicht. Der Uberstand wird so- dann verworfen und die vWF-Molekule, die an das Collagen gebun- den wurden, können mittels allgemein bekannter Verfahren des Standes der Technik detektiert werden, z. B. mit Hilfe Peroxida- se-markierter Antikörper angefarbt werden.

Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die bei- liegenden Abbildungen nager erlautert.

Es zeigen : Fig. 1 das Prinzip des erfindungsgemaßen Kollagen-Bindungstests, Fig. 2 die Wirkung der Protease mit vWF-spaltender Aktivitat, Fig. 3 die Wirkung der Protease mit vWF-spaltender Aktivität auf die vWF-Untereinheit, Fig. 4 die Testkalibrierung, Fig. 5 die Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in Patienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura, Fig. 6 die Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in einem Pa- tienten mit thrombotisch thrombozytopenischer Purpura wahrend der therapeutischen Behandlung, und Fig. 7 die quantitative Bestimmung der vWF-spaltenden Protease in gereinigten Plasmafraktionen.

In dem erfindungsgemäßen Test (Fig. 1) wird die unterschiedliche Affinitat der verschiedenen langen vWF-Multimere ausgenutzt. Die langen Multimere haben eine sehr hohe Affinität zu Collagen, wahrend die kleinen Moleküle keine oder nur geringe Affinitat aufweisen.

Der vWF besteht aus verschiedenen langen Multimeren derselben Untereinheit. Die Untereinheiten sind jeweils an den Carboxy- und an den Aminotermini durch Disulfidbrücken miteinander ver- bunden (Fig. 2). Jede Untereinheit kann bei Tyrosin842-Methio- nin843 durch die vWF-Protease gespalten werden (Fig. 3).

Unter diesen Bedingungen wurde mit verschiedenen Normalplasma- verdünnungen eine Eichkurve erstellt (Fig. 4). Auf der Y-Achse ist die Extinktion bei 492 nm aufgetragen, auf der X-Achse die Normalplasmaverdunnungen. Es wird angenommen, dass eine Verdün- nung von Normalplasma von 1/20 einer Aktivität von 100% ent- spricht. Je mehr vWF-spaltende Protease im Gemisch vorhanden ist, desto stärker wird der vWF verdaut, desto weniger kann er an Collagen binden und um so kleiner wird die Extinktion.

In Fig. 5 sind die Untersuchungen an zwei Familien dargestellt, deren Mitglieder an hereditarer TTP leiden. Oben ist die Immun- blotting-Methode, unten die Werte, die mit dem erfindungsgemäßen Collagen-Bindungsassay (CBA) erhalten wurden, dargestellt. Ganz links ist der Propositus, der homozygot defizient an vWF-spal- tender Protease ist. Als nächster kommt der Bruder, ebenfalls homozygot defizient, die Schwester normal, beide Eltern obliga- torisch heterozygot. Dort, wo man in der Immunblotting-Methode einen stark verdauten vWF sieht, erhielt man auch im erfindungs- gemäßen CBA einen Wert um 100%, dort wo das Substrat nicht ver- daut wurde, konnte auch im erfindungsgemäßen CBA keine Aktivität festgestellt werden. Rechts sind Mitglieder derselben Familie, die alle homozygot defizient sind.

Außerdem wurden auch Plasmen eines Patienten mit hereditärer TTP wahrend der Therapie mit FFP untersucht (Fig. 6). Oben ist wie- derum die Immunblotting-Methode, unten sind die Werte, die mit dem erfindungsgemaßen CBA erhalten wurden, zu sehen. Ganz links ist eine Plasmaprobe aufgeführt, die vor der Therapie entnommen wurde. Die weiteren Proben sind nach einem ersten und einem zweiten Plasmaaustausch entnommen worden. Sowohl bei der Immun- blotting-Methode als auch bei dem erfindungsgemäßen Collagen- Bindungsassay kann eine Zunahme der Aktivität nach dem ersten Austausch, ein weiterer Anstieg nach der zweiten und danach eine Abnahme der Aktivität beobachtet werden.

Aus diesen Ergebnissen kann gefolgert werden, dass es möglich ist, mit Hilfe des erfindungsgemäßen Collagen-Bindungsassays die Aktivität der vWF-spaltenden Protease auf einfache und schnelle Weise zu messen. Dadurch sollte die Diagnose und das Therapiemo- nitoring von Patienten mit TTP erleichtert werden.

Der Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Möglichkeit zur quantitativen Auswertung und die einfachere und vor allem kürzere Durchführbarkeit, die in der Akutdiagnostik der lebens- bedrohlichen Krankheitsbilder von entscheidender Bedeutung ist.

Eine besonders vorteilhafte Ausführungsform des erfindungsge- mäßen Tests verwendet zur quantitativen Bestimmung des Protease- substrates von von Willebrand Faktor den Collagen-Bindungsassay gemäß AT 403 853.

Eine weitere Anwendung der vorliegenden Erfindung besteht in der quantitativen Bestimmung der von Willebrand Faktor-spaltenden Protease bei der Reinigung und Charakterisierung als therapeuti- sche Plasmafraktion oder zur Qualitatskontrolle von therapeu- tisch eingesetzten Vollplasmen. Dies wird durch das nachfolgende Beispiel (siehe Fig. 7) nager erläutert : Die von Willebrand Faktor-spaltende Protease (Multimerase) wurde gemãß AT 404 359 teilweise gereinigt. Zur weiteren chromatogra- phischen Reinigung wurde die Multimerasepraparation auf eine Saule, gefüllt mit Fractogele TSK AF-Orange (Merck), aufgetragen und mit einem Puffergradienten von pH 5,5-pH 8,5 in einem Trispuffer (10 mM Tris, 10 mM Na3. Citrat, 150 mM NaCl) eluiert.

In den Fraktionen wurde die W-Absorption bei 280nm (Gesamtpro- tein) und die Collagen-Bindungsaktivität eines von Willebrand Faktor-Standards nach erfindungsgemäßer Inkubation mit den Frak- tionen gemessen. Der Kehrwert der Collagen-Bindungsaktivitat wurde in das Elutionsdiagramm eingetragen und zeigt, dass neben einem Teil der Proteaseaktivitat, die sich im Saulendurchlauf (Fraktion 10-20) befindet, der Großteil der Aktivität zwischen Fraktion 33 und 38 eluiert werden konnte.