Memoria descriptiva

La invención se refiere a un conjunto de nanobodies para detectar, diagnosticar y neutralizar el virus SARS-CoV2

Estado de la técnica

La enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19) es el nombre que se le da a la enfermedad provocada por la infección por SARS-CoV-2, un nuevo coronavirus identificado en China y relacionado con la neumonía, que constituye una amenaza sin precedentes para los sistemas de salud y economía. Han pasado cuatro meses desde que se informó por primera vez y todavía estamos aprendiendo continuamente sobre el virus y las manifestaciones clínicas asociadas, sus implicaciones clínicas y posibles tratamientos. Hasta la fecha, más de tres millones de personas han sido infectadas y más de doscientas mil han muerto en todo el mundo, lo que refuerza la urgente necesidad de mejores procedimientos de diagnóstico y tratamiento. Actualmente, no existen vacunas o medicamentos que puedan contener eficazmente la pandemia y, como resultado, se han aplicado a nivel mundial medidas no farmacológicas de salud pública tales como el distanciamiento social, el cierre de fronteras y los encierros para aplanar la curva y evitar el colapso de los sistemas de salud.

Los estudios genéticos determinaron que el patógeno responsable de este brote pertenece al género beta-coronavirus, subgénero sarbecovirus y la familia coronaviridae. Tiene una alta homología de secuencia con el coronavirus de murciélago RaTG13, lo que proporciona evidencia de que el nuevo virus puede haberse originado en los murciélagos. Hay ocho coronavirus asociados con enfermedades humanas: HKU1, hCoV-OC43, hCoV-NL-63, hCoV- 229E y las pandemias SARS-CoV-1, MERS y SARS-CoV-2.

La secuencia de SARS-CoV-2 contiene 29903 pb, que incluye 14 marcos de lectura abiertos (ORF, por su sigla en inglés) que codifican la replicasa ORFlab, Spike (S), envoltura (E), membrana (M) y proteínas estructurales de nucleocápside (N), y varias proteínas estructurales proteínas no estructurales (nsps) y accesorias. La glicoproteína Spike (S) en la superficie del virus es responsable de la adhesión e invasión de las células huésped. Spike es una proteína de fusión de clase 1 trimérica altamente glicosilada y contiene dos subunidades, SI y S2. Los estudios de CryoEM demostraron que permanece en una conformación previa a la fusión metaestable con un movimiento en forma de bisagra de la subunidad SI, que se une al receptor de la célula huésped. Después de la unión, SI se desprende y deja la subunidad S2 en una conformación post-fusión estable. Este último media la fusión de la membrana y es responsable de la invasión de la célula huésped.

La proteína de la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) parece ser la puerta de entrada al hospedador, dado que Spike de SARS-CoV-1 se une a este receptor, el virus requiere la proteólisis de cebado por la serina proteasa TMPRRS2, que ataca a un sitio de escisión de tipo furina en la proteína S. El cambio conformacional luego estabiliza el complejo, lo cual permite que el virus infecte la célula huésped. Se confirmó la presencia de ACE2 en diferentes tejidos, lo cual puede estar relacionado con algunas manifestaciones clínicas de COV1D-19; algunas de ellas ya tienen prueba in vitro de infección por SARS-CoV- 2. Este mecanismo mediado por la glicoproteína S resalta la importancia y las propiedades antigénicas de esta proteína como objetivo para el desarrollo de terapias tales como anticuerpos neutralizantes y vacunas. El aislamiento de anticuerpos específicos podría ser fundamental para el desarrollo de un arsenal terapéutico y de diagnóstico eficaz contra el virus.

Algunos anticuerpos de origen natural carecen de cadenas ligeras, conocidas como anticuerpos de dominio único (HCAb). Son derivados de IgG y se encuentran en toda la familia Camelidae. La familia de los camélidos está compuesta por camellos, dromedarios, llamas, vicuñas, guanacos y alpacas. El fragmento de unión al antígeno de un HCAb contiene un dominio VHH variable único que consiste en 3 regiones hipervariables (CDR). Cuando se aísla, el dominio VHH también se conoce como o nanoanticuerpo. Los nanoanticuerpos específicos del objetivo derivados de los HCAb de camélidos se obtienen después de la inmunización con la proteína objetivo, más el adyuvante. Nuestra plataforma ha desarrollado un procedimiento mejorado para la producción de nanoanticuerpos por el uso de alpacas como especie donante. Para aislar las secuencias genéticas de los nanoanticuerpos específicos del objetivo producidos después de la inmunización, primero debemos aislar los linfocitos B periféricos para obtener el ARN total, seguido por la preparación del ADNc para finalmente amplificar la región del nanoanticuerpo. El fragmento de ADNc que codifica el nanoanticuerpo es tan corto como 360 nt, y se pueden obtener hasta ~ 3 x 10 ⁶ clones individuales a partir de 120 mi de sangre. Se usó un sistema de visualización de bacterias para clonar los nanoanticuerpos individuales completos. Aquí, optimizamos un método de gradiente de densidad simple, rápido y económico para seleccionar nanoanticuerpos contra el dominio de unión al receptor (RBD ) de Spike de SARS-CoV2. Nanoanticuerpos

Los nanoanticuerpos, o VHH, específicos del derivados de HCAb de camélidos por lo general se obtienen rápidamente después de la inmunización con la proteína objetivo más adyuvante. El análisis de la estructura del nanoanticuerpo revela cómo las regiones hipervariables se proyectan en bucles fuera de la estructura del núcleo. Para aislar las secuencias genómicas de los nanoanticuerpos específicos del objetivo, primero se deben obtener linfocitos B periféricos para aislar el ARN total, seguido por la preparación del ADNc para finalmente amplificar la región del nanoanticuerpo del gen V del repertorio. El fragmento que codifica el nanoanticuerpo en el gen V es tan corto como 360 nt de largo. Las secuencias de nanoanticuerpos se clonan en un vector de presentación en la superficie de bacterias (Bacterial Display), y se pueden obtener desde 50 mi de sangre hasta 1 x 10 ⁶ clones de nanoanticuerpo individuales por lo tanto, se hace posible la selección por por medio de purificación por afinidad. Este proceso se conoce como paneo. Los nanoanticuerpos aislados finales se expresan de forma recombinante en bacterias y sus capacidades de unión se pueden caracterizar por medio de ELISA y parámetros bioquímicos cuantitativos tales como 1TC. Luego, los nanoanticuerpos se producen de manera renovable y económica.

Otras ventajas de los nanoanticuerpos son su pequeño tamaño, se pueden humanizar, su estructura y comportamiento son estables en soluciones acuosas, su unión específica y de alta afinidad a una única proteína objetivo y su producción natural por los camélidos. Por lo tanto, los nanoanticuerpos son las mejores herramientas disponibles en la actualidad para diagnósticos y terapias basados en afinidad.

Aquí, se resume en detalle las ventajas y usos de los nanoanticuerpos.

Ventajas de los nanoanticuerpos o VHH

Purificación

La purificación de nanoanticuerpos es simple en comparación con cualquier otra fuente de anticuerpos. A menudo se expresan unidas a una etiqueta de afinidad, tales como etiquetas de 6x histidinas, para permitir la purificación por afinidad. El enriquecimiento a menudo se establece en el periplasma bacteriano donde el entorno oxidante permite la formación de enlaces disulfuro adecuados. Se pueden aislar varios miligramos de un litro de cultivo y los nanoanticuerpos aislados recombinantes se pueden aislar de manera adicional por medio de técnicas bioquímicas estándar. Estabilidad

Los nanoanticuerpos son polipéptidos pequeños y compactos y a menudo se expresan en el periplasma de las bacterias. Son muy estables a altas temperaturas, a partir de 6 °C en comparación con el VH humano, y también son resistentes a los agentes químicos desnaturalizantes. Además, la ingeniería molecular de la estructura del nanoanticuerpo ha demostrado que la estabilidad aumenta cuando se introduce una cisteína en las posiciones 54 y 78 para formar un enlace disulfuro adicional. Curiosamente, el nanoanticuerpo súper estable resultante también es más resistente a proteasas tales como la pepsina o la quimotripsina.

Invisibilidad inmunológica

Los nanoanticuerpos se pueden usar como balas terapéuticas contra tumores, patógenos y enfermedades crónicas, sin embargo, como proteínas extrañas, podrían desencadenar una respuesta inmune por sí mismos. De manera afortunada, el tamaño pequeño, el rápido aclaramiento de la sangre y la alta homología con la región variable humana de la cadena pesada VH los hacen poco inmunogénicos. Solo algunis pocos aminoácidos difieren entre los nanoanticuerpos y el VH humano, la sustitución de aminoácidos de camélidos por aminoácidos humanos se ha usado para humanizar los nanoanticuerpos de camélidos y hacerlos aún más seguros para las terapias.

Accesibilidad

Los nanoanticuerpos son monómeros estrictos, su afinidad por los sustratos depende de la proyección de los tres bucles hipervariables. En consecuencia, los nanoanticuerpos tienden a interactuar con las cavidades de la estructura espacial de los polipéptidos, pero no de manera eficiente con los péptidos. Por ejemplo, varios nanoanticuerpos identificados bloquean directamente los sitios enzimáticos activos. El nanoanticuerpo FC5 incluso puede cruzar la barrera hematoencefálica por medio de transcitosis y formar anticuerpos parcialmente biespecíficos usados para enfoques terapéuticos. Finalmente, la accesibilidad molecular impacta el acceso a los complejos macromoleculares.

Uso de nanoanticuerpos Diagnósticos

Los nanoanticuerpos son una herramienta superior para el diagnóstico. Su capacidad ilimitada de producción in vitro hace que los nanoanticuerpos sean más fiables que los anticuerpos convencionales e independiente de la preparación de lotes o las limitaciones del suero animal. Los nanoanticuerpos se pueden producir como una proteína fusionada con péptidos informadores o proteínas para tinción o visualización directa, incluidas etiquetas de afinidad (Flag, HA, V5 y cMyc), proteínas fluorescentes (GFP, RFP, etc.) y enzimas para mediciones colorimétricas tales como la peroxidasa de rábano picante (HRP). Por ejemplo, los ensayos de ELISA se pueden mejorar por el uso de nanoanticuerpos para la inmovilización específica o la detección por el uso de un nanoanticuerpo específico acoplado a peroxidasa de rábano picante (HRP).

Los nanoanticuerpos cumplen la mayoría de los requisitos de una sonda ideal para obtener imágenes moleculares exitosas. Varias técnicas de formación de imágenes tales como SPECT, PET, imágenes ópticas y ultrasonido se han empleado con éxito para la formación de imágenes moleculares por el uso de nanoanticuerpos in vivo. En SPECT, los nanoanticuerpos dirigidos específicos se acoplan a una fuente de irradiación g y se administran de manera sistémica. Posteriormente, los nanoanticuerpos se detectan en un escáner de cuerpo completo. La estrategia de la PET es similar a la SPECT, pero en su lugar usa nanoanticuerpos marcados con radionúclidos emisores de positrones. Estas tecnologías de formación de imágenes se usan para varias técnicas de diagnóstico de tumores en modelos animales: por ejemplo, se puede usar un nanoanticuerpo anti-EGFR para detectar carcinoma epidermoide humano y carcinoma de próstata humano. En otro caso extraordinario, han usado una combinación de nanoanticuerpos dirigidos a la anhidrasa carbónica IX (CA1X) y las proteínas del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano (HER2) conjugadas con diferentes fluoróforos. Aquí, los autores concluyen que la detección simultánea del estado de expresión de múltiples marcadores tumorales clínicamente relevantes podría conducir a una mejor detección de tumores primarios y sus metástasis.

Hoy en día, las mejores posibilidades de supervivencia al cáncer son la detección temprana y la cirugía oportuna. De este modo, la detección in vivo basada en nanoanticuerpos es una de las tecnologías futuras más prometedoras para combatir el cáncer.

Terapias

Se han desarrollado varios nanoanticuerpos en el contexto de diferentes aplicaciones terapéuticas experimentales contra diferentes virus: VIH, virus de la hepatitis B, virus de la influenza, virus sincitial respiratorio, virus de la rabia, virus de la fiebre aftosa, poliovirus, rotavirus y PERV. De manera sorprendente, los nanoanticuerpos pueden neutralizar la infección por VIH; se ha inhibido la propagación de célula a célula por el uso del VIH aislado de pacientes. Debido a la baja inmunorreactividad de los nanoanticuerpos, se pueden inyectar en pacientes con muy pocos o ningún efecto secundario. Para hacerlos más eficientes y específicos, los nanoanticuerpos se pueden vincular para producir nanoanticuerpos bivalentes, multivalentes, y/o multiespecíficos, o combinados con otros nanoanticuerpos o proteínas circulantes tales como la albúmina para incrementar su rotación y efectividad terapéutica. El virus de la rabia provoca una infección cerebral letal en las personas. Poco después de la exposición, se administra profilaxis antirrábica con inmunoglobulinas y vacunas derivadas del plasma. A menudo, esto ocurre directamente después del ataque de un animal que podría estar infectado. Los nanoanticuerpos antirrábicos pueden prolongar de manera significativa la supervivencia o incluso curar completamente la enfermedad en modelos animales. El virus respiratorio sincitial, RSV, es una de las principales causas de hospitalización en niños, cada año se infectan más de 1,9 millones de niños menores de 1 año y hay más de 0,3 millones de niños menores de 5 años hospitalizados. No se dispone de una terapia actual contra el VSR. Sin embargo, la terapia basada en nanoanticuerpos trivalentes se encuentra en ensayos clínicos de fase 11. La novedad absoluta de la terapia RSV desarrollada por Ablynx, ALX-0171, es la neutralización directa del virus en el pulmón de animales de experimentación infectados. El nanoanticuerpo se administra por nebulización y reduce el título de virus en 10.000 veces. Los nanoanticuerpos también se usan para inmunoterapias contra el cáncer.

Covid-19 y nanoanticuerpos

La infección por este nuevo coronavirus CoV genera síntomas similares a los del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV) en la pandemia de 2002-2003. Ambos virus compartían una secuencia genética altamente homologa y el mismo receptor para ingresar e infectar las células huésped humanas: la enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2) (doi: 10.1101/2020.01.26.919985). Por esta razón, el virus se denominó SARS-CoV-2 y en febrero de 2020, la OMS nombró a la infección COVID-19 y fue declarada la sexta emergencia de salud pública de importancia internacional. De acuerdo con el último informe publicado por la OMS (27 de abril de 2020), hay 2.878.196 casos confirmados y 198.668 defunciones. Los investigadores están usando todos sus recursos para generar estrategias terapéuticas rápidas que neutralicen el virus y prevengan la infección y la propagación.

Los VHH que neutralizan el virus evitan la entrada del virus al bloquear su unión al receptor. El coronavirus patógeno del síndrome respiratorio de Oriente Medio (MERS-CoV) y el coronavirus del síndrome respiratorio agudo severo (SARS-CoV- 1) ingresan a las células humanas a través de la glicoproteína de envoltura grande llamada Spike (S) que se une al receptor ACE2. Las proteínas de Spike son altamente inmunogénicas y, debido a su papel en la infección, representan un objetivo vulnerable para el desarrollo de nuevas terapias. Por lo tanto, la alta potencia y especificidad de los anticuerpos antivirales puede ser una herramienta terapéutica prometedora. Los VHH para MERS-CoV y SARS-CoV se han descrito previamente. Sin embargo, no se han reportado VHH específicos para el SARS-CoV-2. Hasta la fecha, se han usado anticuerpos policlonales de pacientes infectados con SARS-CoV-2 recuperados para tratar la COVID-19. El estudio más cercano para identificar VHH para SARS-CoV-2 fue el de Walter et al. quienes generaron bibliotecas de nanoanticuerpos sintéticos denominados "sybodies" contra el dominio de unión al receptor (RBD) del SARS- CoV-19. Sin embargo, no han llevado a cabo el análisis de los constructos para evaluar su especificidad y efecto neutralizador (Walter, Justin D., et al. "Synthetic nanobodies targeting the SARS-CoV-2 receptor-binding domain." BioRxiv, 2020).

De este modo, los nanoanticuerpos obtenidos y protegidos en esta aplicación son herramientas poderosas en la lucha contra la pandemia SARS-CoV2, se pueden aplicar en métodos de detección y también en métodos terapéuticos para neutralizar el virus tanto in vivo como ex vivo.

Descripción de las Figuras.

Figura 1. Inmunización del Spike de SARS-CoV-2 y un método de gradiente de densidad simple para la selección de VHH.

(A) gel de SDS para garantizar la integridad de las proteínas Spike de longitud completa de SARS-CoV-2 antes de la inmunización de la Alpaca.

(B) Evaluación de la respuesta inmune de la alpaca mediante dotblot. La imagen muestra la reacción a cantidades decrecientes de Spike y albúmina de suero bovino (control negativo) usando un control de preinmunización (pre-inmune), y después de una inmunización (1 semana) o dos inmunizaciones (3 semanas) con Spike de SARS-CoV-2 completa (post inmune), usando sueros de alpaca como fuente primaria de anticuerpos seguidos de un anticuerpo secundario anti-camélido IgG-HRP.

(C) ELISA antes (prei-inmune) y después de la segunda inmunización (post-lnmune) (3 semanas) n = 4 barras de error indican prueba t estadística de desviación estándar, ** P < 0,005.

(D) Representación esquemática del protocolo para el aislamiento de VHH usando separación por gradiente de densidad: la librería de presentación de bacterias (1) que expresa el VHH en la superficie de las bacterias se incuba brevemente (11) con perlas de sefarosa convencionales recubiertas con el antígeno de interés. Inmediatamente después de depositar la mezcla en un tubo cónico de gradiente de densidad Ficoll (111) y centrifugar a 200 g durante 1 min, las perlas pasan a través de la selección secuencial del gradiente de densidad hasta el fondo del tubo con las bacterias que expresan VHH específico, mientras que las bacterias no unidas permanecen en la superficie del gradiente. A continuación, se resuspenden las perlas y (V) se aíslan los clones bacterianos incubaciones en placa de agar.

Figura 2 Inmunodetección de Spike-SARS-CoV2 en una membrana de nitrocelulosa con un tamaño de poro de 0,2 pm con el VHH de la invención como anticuerpo primario, seguido de anti-Myc de ratón e IgG anti-ratón de cabra acoplado a HRP. Se incluye fotografía de cada reacción para cada nanoanticuerpo de la invención, así como la valoración cualitativa (+, ++, +++). Se muestran además los controles positivo y negativo.

Figura 3 Árbol dendrítico que agrupo los nanoanticuerpos de la invención de acuerdo al grado de identidad entre los 3 CDR de cada VHH. Se muestran las familias que tienen un 50% de identidad entre sí en el conjunto de CDR. Descripción detallada de la invención

La invención apunta a un conjunto de nanoanticuerpos que se unen específicamente la proteína Spike de SARS-CoV-2, proteína que comprende el dominio de unión al receptor (RBD) del virus.

A pesar de los esfuerzos mundiales para controlar la progresión del COV1D-19 a un síndrome respiratorio agudo severo y su impacto en los sistemas de salud, la situación sigue siendo crítica. Se requieren diagnósticos, tratamientos y medidas profilácticas efectivas en términos de costo, tiempo y mano de obra para satisfacer la demanda mundial: los anticuerpos recombinantes tales como los nanoanticuerpos de alpaca podrían contribuir a estos requisitos. Aquí, se describe un método de un solo paso para el aislamiento de nanoanticuerpos contra el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína SARS-CoV-2 Spike.

Hoy, más que en cualquier otro momento de la historia moderna, se necesitan con urgencia medidas de diagnóstico y neutralización para controlar una pandemia mundial. Los anticuerpos recombinantes, incluidos los nanoanticuerpos de alpaca, son excelentes candidatos para lograr este desafío. Sin embargo, el proceso de producción de nanoanticuerpo clásico toma meses, por ejemplo, la inmunización completa toma un promedio de 8 semanas, seguida por la construcción de la biblioteca de nanoanticuerpo y la selección de afinidad de clones, que toma alrededor de 6 meses (Pardon E, Laeremans T, Triest S, et al. A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology. Nat Protoc. 2014;9(3):674-693. doi:10.1038/nprot.2014.039). Los inventores aplicaron el método de la invención para acelerar la inmunización de una alpaca con Spike de longitud completa de SARS-CoV-2.

De este modo, los inventores obtuvieron 22 nuevos nanoanticuerpos que reconocen de manera específica Spike de SARS-CoV-2, tanto las secuencias de nucleótidos como de aminoácidos de los 22 nanoanticuerpos, se encuentran en las SEC. ID Núm. 1 a 44 Para obtener los anticuerpos de la invención se requiere el antígeno purificado, en este caso proteína S. En una forma de realización, la proteína liofilizada se obtiene con un sistema de expresión de baculovirus. A continuación, la alpaca se inmuniza una o dos veces con 50 a 500 pg del antígeno. La respuesta inmune del suero de alpaca contra el antígeno después de la inmunización se puede observar de forma rápida y cualitativa por medio de análisis de Dot Blot, por medio de la inmovilización del epítopo a una membrana de nitrocelulosa y por el uso de suero de alpaca como fuente de anticuerpos primarios; o de manera analítica y comparativa por medio de ELISA por el uso del antígeno completo que está inmovilizado en la placa de ELISA y el suero de alpaca como fuente de anticuerpos primarios. Por lo tanto, se construye rápidamente una biblioteca de presentación de bacterias de clones de nanoanticuerpos individuales.

Una vez obtenida la biblioteca, se aplicó el novedoso procedimiento para la selección de nanoanticuerpos basado en un gradiente de densidad simple por el uso de Ficoll, un reactivo económico disponible en todo el mundo usado para la fragmentación sanguínea. Los inventores desarrollaron el método inspirados en la observación principal de que los glóbulos rojos se acumulan en la parte inferior del gradiente de densidad de Ficoll, mientras que las PBMC permanecen en la fracción superior. Los inventores probaron perlas de NHS- sefarosa convencionales en un gradiente de Ficoll y demostraron que la densidad de las perlas era suficiente para precipitar en el fondo de un tubo de 15 mi. Se llevó a cabo la misma prueba de ensayo con bacterias libres, como era de esperar, las bacterias se quedaron en la fracción superior. El sistema de presentación de bacterias expresa un solo tipo de nanoanticuerpo en la membrana bacteriana externa tras la inducción de 1PTG. Por lo tanto, los inventores colocaron perlas de NHS recubiertas con el antígeno de interés para unirse a bacterias individuales que expresan nanoanticuerpos específicos en su superficie contra dicho antígeno: haciendo que las bacterias se hundan hasta el fondo del gradiente de densidad de Ficoll, mientras que las bacterias no unidas permanecerían en la fracción superior (Figura le). De hecho, los inventores demostraron que los nanoanticuerpos específicos contra un antígeno particular de una biblioteca de presentación bacteriana se pueden seleccionar con el protocolo descrito de una manera rápida y económica por el uso de reactivos comunes y una centrífuga convencional. Este procedimiento también puede ser aplicable a bibliotecas de presentación de levadura.

Para los expertos que trabajan en esta área, será evidente que los nanoanticuerpos que reconocen Spike de SARS-CoV-2 puede ser útil en el diagnóstico y terapias para la COVID- 19.

En terapia, se puede usar un nanoanticuerpo que reconoce el Spike de SARS-CoV-2 para neutralizar el virus y controlar la enfermedad en un individuo. En el diagnóstico, un nanoanticuerpo que reconoce el Spike de SARS-CoV2 se puede usar en cualquier técnica disponible, por ejemplo en ELISA, inmunotransferencia, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación, inmunofluorescencia, kits de flujo lateral, ensayos de aglutinación en látex, citometria, radiotrazadores, y otros.

La especificidad de un anticuerpo y de un nanoanticuerpo viene dada por la complementariedad estructural entre el sitio de combinación del anticuerpo y el determinante antigénico. Los sitios de combinación de anticuerpos son regiones hipervariables también conocidas como regiones determinantes de complementariedad (CDR). Los nanoanticuerpos tienen tres CDR, por lo que la especificidad de cada nanoanticuerpo (producido por esta invención) viene dada por sus 3 CDR. Normalmente, las CDR se pueden identificar por medio del análisis de la secuencia de ADN o proteína del anticuerpo o nanoanticuerpo en un sistema computacional apropiado; existen varios sistemas de última generación disponibles. Por lo tanto, identificar las 3 CDR de las secuencias de nanoanticuerpos SEC. ID Núm. 1 a 44 es un procedimiento de rutina para los expertos en la materia.

También será evidente que dado que la especificidad de los nanoanticuerpos viene dada por sus CDR, los nanoanticuerpos de esta invención podrían tener cambios en su "región marco", o "FR" (el nombre de las secuencias de aminoácidos insertadas entre las CDR). Por lo tanto, un nanoanticuerpo producido por la invención se define como un nanoanticuerpo con las mismas CDR que los nanoanticuerpos de las SEC. ID Núms.: 1 a 44. Igualmente, estos nanoanticuerpos se podrían definir como un nanoanticuerpo con por lo menos un 80% de identidad con las 3 secuencias de CDR de un nanoanticuerpo seleccionado del grupo contenido en las SEC. ID Núms.: 1 a 44. O descritas en las SEC. ID N° 45 a 110. En una realización preferida, la invención apunta a un nanoanticuerpo con por lo menos un 90% de identidad con las 3 secuencias de CDR de un nanoanticuerpo seleccionado del grupo contenido en las SEC. ID Núms.: 1 a 44, según se describen en las SEC. ID N° 45 a 110.

Los nanoanticuerpos de la invención se pueden emplear en cualquier técnica que exista que requiera de dominios de unión específica a la proteína Spyke de SARS-CoV2.

Se considera como una derivación obvia de la presente invención el uso de los nanoanticuerpos en técnicas de detección de SARS-CoV2 tales como: ELISA, inmunotransferencia, inmunohistoquímica, inmunoprecipitación y otros.

Adicionalmente, también se considera como una derivación obvia de la presente invención el uso de los nanoanticuerpos para aplicación en el cuerpo humano o animal de modo de neutralizar el virus in vivo, ya sea con los nanoanticuerpos tal como se han descrito, o anclados a una molécula portadora y o bioactiva, o que tenga como propósito aumentar la vida media del anticuerpo en el cuerpo humano o animal. Ejemplos de moléculas que pueden actuar de portadores son, albúmina, Fracción constante de anticuerpo humano (Fe), dominios de unión a albúmina, péptido beta carboxyterminal, polímeros de acido siálico, polietilenglicol, otros nanoanticuerpos, entre otros, así como combinaciones de los mismos.

Así como la humanización de los nanoanticuerpos de la invención, ya sea por modificaciones en su fracción constante o por acoplamiento con la fracción constante humana, para dar origen a un minianticuerpo. En esta última realización se puede usar dos nanoanticuerpos iguales o una combinación de cualquiera de los nanoanticuerpos de la invención.

Adicionamente, y dado que como sabemos el virus SARS-CoV2 está en constante mutación, generando nuevas variantes, puede ser conveniente emplear simultanemente 2 o más de los nanoanticuerpos de la invención, de modo de atacar el virus por varios flancos y evitar que variaciones en el virus hagan inservible el uso de un anticuerpo en particular. Esto es válido tanto en aplicaciones de detección del virus como de neutraliazación de este.

A continuación se describen algunos ejmplos donde se explica el método de obtención de los nanoanticuerpos de la invención, su análisis y aplicación en la detección del proteína Spike de Sars-CoV2. Estos ejemplos deben ser considerados como ilustrativos y no limitativos de la invención.

Ejemplos.

Ejemplo 1. El método de gradiente de densidad simple de la invención y su uso para obtener nanoanticuerpos contra la proteína Spike del SARS-CoV2

Primero, los inventores obtuvieron la proteína Spike de SARS-CoV2 liofilizado generado en un sistema de expresión de baculovirus. Antes de la inmunización, se probó la integridad de la proteína de Spike por medio de tinción de SDS-Page y Coomassie (Figura la). Una alpaca llamada Buda (Figura Ib) se inmunizó dos veces con 100 pg de la proteína Spike completa. La respuesta inmune del suero de la alpaca antes de la inmunización reveló una afortunada reacción cruzada basal contra la proteína Spike. A continuación, luego de la segunda inmunización, se observó un aumento significativo de anticuerpos IgG en el suero de alpaca de manera cualitativa rápida por análisis de Dot Blot, por medio de la inmovilización del epítopo en una membrana de nitrocelulosa y por el uso de suero de alpaca como fuente de anticuerpos primarios (Figura le). Además, los inventores comprobaron el aumento de anticuerpos IgG (de manera analítica y comparativa) por medio de ELISA por el uso de la proteína Spike completa inmovilizada en la placa de ELISA y por el uso del suero de alpaca como fuente de anticuerpos primarios (Figura Id). Por lo tanto, los inventores construyeron rápidamente una biblioteca de presentación de bacterias que consistía en 2,3 x 10 ⁶ clones de nanoanticuerpos individuales con un 0,7% de religación del vector.

Construcción de bibliotecas de inmunización y VHH

El proceso de inmunización de la alpaca siguió el protocolo "Uso animal en investigación" generado por el Comité de Bioética de la Universidad Austral de Chile. Un día antes de la inmunización, se recogieron 5 mi de sangre para las pruebas de suero preinmunes. Para la inmunización (día 1), se usaron 100 pg de proteína Spike de longitud completa de SARS- CoV2 (SINOBiological). La proteína liofilizada fría se disolvió en 2 mi de adyuvante (adyuvante de vacuna veterinaria, GERBU FAMA) diluido 1:1 en agua estéril y se inyectó de manera subcutánea en una alpaca macho ( Vicugna pacos). Se inyectó un volumen total de 4 mi en cuatro lugares diferentes de la alpaca. Se recogió una muestra de sangre de 5 mi siete días después de la primera inmunización. El día 14 se volvió a inmunizar la alpaca con 100 pg de Spike y el día 15 se recogió una muestra de 120 mi de sangre de la vena yugular en tubos que contenían citrato de sodio al 3,8% como anticoagulante. La muestra de sangre no coagulada se mezcló con el mismo volumen de medio HBSS sin calcio (Gibco), se dividió en alícuotas de 10 mi y se agregaron 5 mi de Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare) encima de cada alícuota en 15 mi de tubos de Falcon estériles. Después de la centrifugación (1.200 x rpm, 80 min, TA), la fracción de PBMC se recuperó de la interfase, se lavó dos veces en HBSS por medio de centrifugación (3.500 x rpm, 10 min), se resuspendió en 4 mi de PBS estéril (Gibco). La extracción de ARN y la producción de ADNc se llevaron a cabo por el uso del kit comercial RNeasy Mini (Qiagen) y el Kit de Transcripción Inversa QuantiTect (Qiagen), respectivamente. Aproximadamente 2 pl de cada ADNc sintetizado se usó como molde en un volumen total de reacción de PCR de 50 pl con los oligonucleótidos CALL001 (5'-GTC CTG GCT CTC TTC TAC AAG G-3') y CALL002 (5'-GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC- 3') (Conrath etal, 2001). Los fragmentos amplificados de ~0,6 kb, correspondiente a los dominios VHH- CH2, y ~0,9 kb, correspondientes a los dominios VH-CH1-CH2 convencionales, se separaron en gel de agarosa de bajo punto de fusión al 1,2% (p/v) y se purificó una banda de ~0,6 kb (kit de Extracción en Gel QIAEX II, Qiagen). Este fragmento se usó como molde en una segunda reacción de PCR con los oligonucleótidos VHH-Sfi2 (5'-GTC CTC GCA ACT GCG GCC CAG CCGGCC ATG GCT CAG GTG CAG CTG GTG GA-3') y VHH-Not2 (5'- GGA CTA GTG CGG CCG CTG AGG AGA CGG TGA CCT GGG T-3') para finalmente obtener los fragmentos amplificados de~0,4 kb, correspondiente a los dominios VHH. Los fragmentos de VHH amplificados se digirieron con enzimas de restricción Sfi I y iVotl (termocientíficas) y se ligaron en los mismos sitios del vector pNeae2 purificado (Salema et al., 2016). Las ligaciones se sometieron a electroporación en células de E. coli DH10B-T1 R logrando un tamaño de biblioteca de 2,3 ^c 10 ⁶ clones individuales, de acuerdo con lo determinado por medio de la siembra en placas de agar LB-Cloranfenicol con glucosa al 2% p/v incubadas a 30 °C. Se estimó menos del 0,7% de vectores re-ligados a partir de una ligación de control llevada a cabo en paralelo sin el inserto de ADN. Las bacterias transformadas se rasparon de las placas y se almacenaron a -80 grados en caldo LB con glicerol al 30%.

Una vez obtenida la biblioteca, los inventores aplicaron el método de la invención para la selección de nanoanticuerpos basado en un gradiente de densidad simple por el uso de Ficoll. (Figura le).

Acoplamiento de epítopos a perlas

Se lavaron 1 mi de perlas NHS Act Sepharose® 4 Fast Flow (GE Healthcare) con 2 mi de HC1 1 mM frío inmediatamente antes de su uso, luego se lavaron 5 veces con PBS (tampón fosfato salino) lXestéril frío. Se añadieron 200 pg de proteína purificada en PBS IX a las perlas y se incubaron con rotación hasta el día siguiente. Los grupos que no reaccionaron en el medio se bloquearon por medio de la adición de etanolamina a una concentración final de 0,5 M. Las perlas se lavaron 5 veces con PBS IX y se almacenaron a 4 °C.

Separación de gradiente de densidad

Se inoculó 1 mi de solución madre de glicerol de la biblioteca en un matraz que contenía 20 mi de medio LB con 25 pg/rnl de cloranfenicol y glucosa al 2%. El matraz se incubó (pre- inóculo) hasta el día siguiente a 37 °C con agitación de 200 rpm. Se repitió el mismo procedimiento con bacterias de control transformadas con un plásmido resistente a kanamicina (control). El preinóculo se sedimentó y resuspendió en medio LB con 25 pg/ mLde cloranfenicoly luego se diluyó a 0,02 DO (densidad óptica) 600 nm en 100 mi de medio LB fresco con 25 pg/mLcloranfenicol sin glucosa, se incubó a 37 °C con agitación de 200 rpm hasta alcanzar una DO 600 nm de 0,45 a 0,6. Se añadió 1PTG a una concentración final de 50 mM para inducir la expresión de proteínas durante 3 horas a 30 °C y 200 rpm. Se midió la absorbancia DO 600 nm de la biblioteca y los cultivos de bacterias de control. Se lavaron 50 mL de ambos cultivos tres veces con 10 mL de PBS IX filtrado. La centrifugación fue siempre a 3000 x g durante 5 min. Ambos cultivos se resuspendieron en un volumen final de 10 mi de PBS1X. Se mezclaron 2 mi de cultivo de biblioteca y 2 mi de cultivo de control (si la DO 600 nm final era la misma, si no, el volumen de las bacterias de control se ajustó en función de la DO para garantizar una cantidad igual de bacterias) y se incubó con 300 pL de perlas NHS acopladas al epítopoen un tubo cónico de 15 mi en una plataforma oscilante durante 30 min a temperatura ambiente. La mezcla se añadió a Ficoll de 6 mi (Ficoll-PaqueTM PLUS GE Healthcare) en un tubo cónico de 15 mi y se centrifugó a 200xg durante 1 min. La fracción no unida se descartó (fracciones superiores), para dejar un sedimento visible de perlas que se resuspendió en 4 mi de PBS IX y se rotó durante 5 min a temperatura ambiente. Este paso se repitió seis veces. Finalmente, se agregó 1 mL de medio LB y se incubó durante 5 min a temperatura ambiente, luego se sembraron 50 pL en placas de agar LB con 500 pg/mL de kanamicina y glucosa al 2%, se sembraron 50 pL en placas de agar LB con 25 pg/mL cloranfenicol y 2% de glucosa y el resto en por lo menos dos placas de agar LB cloranfenicol/glucosa, incubadas a 37 °C hasta el día siguiente (> 20 hs recomendadas). Se contó el número de colonias de las dos primeras placas para controlar la falta de especificidad (el número de colonias en la placa de cloranfenicol debe ser por lo menos 5 veces mayor que en la placa de kanamicina).

Se secuenciaron los clones seleccionados, la alineación de las secuencias de aminoácidos muestro que los nanoanti cuerpos originados todos en la misma alpaca, comparten un origen común y mantienen una identidad de aproximadamente un 50% de sus secuencias, mientras que al mismo tiempo son diferentes y muy probablemente reconocen diferentes epítopos de Spike.

De este modo los anticuerpos de la invención pueden usarse en conjunto para detectar o neutralizar SARS-CoV2. Esta realización es especialmente conveniente dado las constantes mutaciones que ha presentado el virus. El emplear un solo nanoanticuerpo puede tener una efectividad disminuida en caso de una variación puntual del virus, problema que disminuye al emplear combinaciones de estos. Ejemplo 2. Pueba de unión de los VHH seleccionados a Spike de SARS-CoV-2

Para comprobar que los nanoanticuerpos de la invención se unen a la proteína Spike, se realizó un inmunoblot para los 22 nanoanticuerpos, los que se enfrentaron a Spike-GFP expresado en condiciones naturales virales en células humanas (Figura 2).

Para esto las colonias individuales de bacterias que expresan VHH (cepa DHlOb) obtenidas en el ejemplo anterior se inocularon en 2 mi de medio LB y se incubaron durante la noche a 37 ^Q C con agitación de 200 rpm. Luego 100 pL de de los 2ml de medio LB crecido durante la noche o“Pre-inóculo” fueron añadidos a 1,9 mL de medio LB fresco con 25 pg/mL de cloranfenicol, incubados a 37 ^Q C con agitación de 200 rpm hasta alcanzar 0,45-0,6 OD600nm. Se añadió IPTG (Isopropil- -D-l-tiogalactopiranósido) a una concentración final de 50 pM para inducir la expresión de proteínas y se incubó durante 3 horas a 30 ^Q C y 200 rpm.

El cultivo se sedimentó por centrifugación a 3000xg por 10 min y resuspendió en 1 mi de PBS IX 0,2% TritonXlOO, se sonicó durante 10 segundos al 40% en hielo, luego se centrifugó a 14.000 xg, 30 min, a 4 ° C y se recuperó el sobrenadante para obtener un extracto de proteína total de cada clon.

Se colocó 1 pl de proteína SARS-CoV2 Spike (200 ng / ul) y un extracto de proteína total de E. coli dentro de una cuadrícula premarcada en una membrana de nitrocelulosa de 0,2 pm de tamaño de poro (Merk Millipore). A continuación, se dejó secar la membrana para fijar las proteínas durante 30 min a temperatura ambiente. Los sitios inespecíficos se bloquearon con solución de bloqueo (PBS-T con albúmina de suero bovino al 5%) durante 30 min a temperatura ambiente con agitación. La solución de bloqueo se descartó y cada membrana se incubó 1 hora a temperatura ambiente con agitación con una dilución de 1:10 de extracto de proteína total, donde cada extracto bacteriano se evaluó de forma separada y expresa un clon individual de un VHH especifico, la incubación se realiza en 5 mi de PBS-T que contiene 5% de BSA, por separado para cada clon, seguido de 3 x 5 minutos de lavado con PBS. T. Como control negativo se utiliza una proteina no relacionada.

Posteriormente, se realizó una incubación con un anticuerpo secundario, específicamente se empleó anticuerpo anti-Myc de ratón (9B11, Cell Signalling) 1: 3000 en PBS-T que contiene 5% de BSA, por 1 hora a temperatura ambiente, seguido de 3 x 5 minutos de lavado con PBS- T. Después de esto, la membrana se incubó con anticuerpo IgG de cabra anti-ratón acoplada a HRP (Invitrogen) 1: 5000 en PBS-T que contenía BSA al 5%, 1 hora a temperatura ambiente, seguido de 3 x 5 minutos de lavado con PBS-T y se desarrolló utilizando reactivo ECL. Se observó que todos los nanoanticuerpos de la invención se unieron al antígeno Spike de SARS-CoV-2. Los resultados se muestran en la Figura 2.

Ejemplo 3. Análisis de secuencia de los VHH seleccionados.

Del ejemplo 1 se obtuvieron 22 clones que expresan VHH o nanoanticuerpos que, de acuerdo al ejemplo 2, sabemos que se unen específicamente a Spike de SARS-CoV2. Se considera que todos estos nanoanticuerpos o VHH tienen un alto potencial para detectar y neutralizar el virus SARS-CoV2. El siguiente paso fue obtener sus secuencias aminoacídicas y nucleotídicas, las que se muestran en las secuencias 1 a 44.

Adicionalmente se identificaron, por medio de programas computacionales los 3 CDR de cada VHH o nanoanti cuerpo. Específicamente se trabajó con las secuencias aminoacídicas derivadas a partir del primer codón ATG en el vector pNAE2. Se procedió a anotar los Framework y CDR de acuerdo a Brochet, X. et al., Nucí. Acids Res. 36, W503-508 (2008) y luego curadas a mano mediante alineamientos individuales con secuencias de Vicugna pacos (Acc. Number: AM773548, AM939756, AM939765, AM939763, AM939739).

Los distintos CDRs se incluyen en las SEQ ID N° 45 a 110.

La Tabla 1, a continuación, muestra la correlación entre la nomenclatura interna dada a cada Nanoanticuerpo en el laboratorio, identificado según el numero de fantasía de la colonia o clon que lo expresa y los números de las secuencias incluidas en el listado de secuencias.

Tabla 1

La correspondencia entre las secuencias peptídicas de los 3 CDR de cada anticuerpo con el número de las secuencias incluidas en el listado de secuencias se muestra en la Tabla 2.

Tabla2

Los 22 nanoanticuerpos de la invención, originados todos en un mismo individuo, la misma alpaca Buda, comparten un origen común y mantienen una identidad de aproximadamente un 69% de sus secuencias aminoacídicas completas, mientras que al mismo tiempo son diferentes y muy probablemente reconocen diferentes epítopos de Spike.

Analizando sólo los CDR de estos 22 anticuerpos los inventores encontraron que al cortar por un 50% de identidad de las 3 secuencias aminoacídicas de los CDR como conjunto se puede observar que existen 13 familias dentro de los 22 nanoanticuerpos estudiados, algunos tienen una variabilidad mayor que hace que no puedan agrupar con ningún otro de los VHH en estudio, mientras que se detectaron 3 familias que agrupan a más de un nanoanticuerpo, donde cada familia comparte más de un 50% de identidad en sus CDRs.

La Tabla 3 a continuación identifica las distintas familias, y la Figura 3 muestra el árbol dendrítico.

Tabla 3. Familias de VHH con más de un 50% de identidad en sus 3 CDR

Para el experto en la técnica será evidente que los VHH descritos pueden tener muchas aplicaciones, todas las cuales se consideran dentro del ámbito de protección de la invención y según se define en las reivindicaciones adjuntas.