CAMPO TÉCNICO

La presente invención se encuentra en el campo de la medicina, en particular, ésta se refiere a métodos para la evaluación y detección de bio-marcadores que permiten determinar o predecir tempranamente el riesgo de padecer preeclampsia. Más particularmente, se refiere a ácidos nucleicos y kits que los comprenden para detectar ARN mensajero de trombomodulina en sangre materna.

DESCRIPCIÓN DEL ESTADO DE LA TÉCNICA

La preeclampsia (PE) es un desorden sistémico de etiología desconocida que ocurre durante la segunda mitad del embarazo (después de la semana 20) y es la principal causa de muerte materna en países de Latinoamérica y el Caribe (25,7%), siendo un poco mayor esta frecuencia en Colombia (mayor al 30%) (Khan, K.S., et al. WHO analysis of causes of maternal death: a systematic review, 2006). Aunque la enfermedad empieza en una etapa temprana del embarazo, sus manifestaciones clínicas solo se detectan usualmente después de la semana 20 y no existe actualmente alguna manera de identificar la mujer embarazada que estaría en riesgo de desarrollarla.

Las manifestaciones clínicas que permiten diagnosticar la PE incluyen el incremento de la tensión arterial, proteinuria, insuficiencia renal, función hepática alterada, edema pulmonar y síntomas cerebrales o visuales. Se ha sugerido que dichas manifestaciones son secundarias a la existencia de un estado de disfunción endotelial, e hipoperfiisión causado por la presencia de trombos en la microcirculación placentaria y una formación excesiva de depósitos de fibrina, lo que se ha probado mediante la presencia de depósitos de fibrina en el subendotelio de los glomérulos renales y arterias espirales, lesiones vasculares en la placenta e infartos parenquimales en mujeres con PE (Ayala-Ramirez, P. et al. Increased tissue factor and thrombomodulin expression and histopathological changes in placentas of pregnancies with preeclampsia., 2016). Aunque existen vanas teorías sobre los cambios histopatológicos que se observan en la placenta de mujeres con PE, se requiere mayor información sobre otras manifestaciones que permitan una mejor comprensión de la fisiopatología de esta enfermedad. La prueba que eventualmente se utiliza en la práctica clínica actualmente para el tamizaje de la PE es la medición del flujo sanguíneo en las arterias espirales uterinas por medio de la ecografía doppler principalmente entre las semanas 11 a 14 del embarazo. Sin embargo, el desempeño de esta prueba no es claro, ya que depende del operador y del equipo utilizado. Según los reportes, esta prueba presenta una sensibilidad de 48% y una especificidad del 92% para la presencia de muesca bilateral. Adicionalmente, en un meta- análisis, se describe que la medición del índice de pulsatilidad de arterias uterinas (UtA- IP) en el primer trimestre tiene una sensibilidad del 47,8% para la identificación de PE de inicio temprano, con una tasa de falsos positivos del 6,1%, y para PE de inicio tardío presenta una tasa de detección del 21,5%, con una tasa de falsos positivos del 2,2% (Velauthar, L. First-trimester uterine artery Doppler and adverse pregnancy outcome: A meta-analysis involving 55 974 women, 2014). Debido a esto, existe un debate en la actualidad acerca de la utilidad de esta prueba en la práctica clínica.

La trombomodulina (TM) es una glicoproteína transmembrana que se expresa principalmente en las células endoteliales hacia la luz vascular y tiene una función anticoagulante natural ya que altera la especificidad de sustrato de la trombina. Adicionalmente, se ha encontrado una expresión incrementada de esta proteína en miofibroblastos de placentas, así como en el plasma de pacientes con PE severa, en comparación con mujeres con embarazos normales. De igual manera, se ha demostrado que las mujeres con PE presentan un estado de coagulación anormal, como lo indica una expresión incrementada de TM, inhibidor del activador de plasminógeno tipo I, factor tisular y fosfolípido pro-coagulante en el plasma y la placenta, en comparación con mujeres con gestaciones normales.

Existen estudios relacionados con la detección y el diagnóstico temprano de la PE, por ejemplo, la patente US2005/0255114, divulga métodos terapéuticos o de diagnóstico que se basan en secuencias de nucleótidos que codifican una diversidad de biomarcadores relacionados con la PE. En particular, este documento describe que la detección de los niveles de expresión de los genes que corresponden a dichas secuencias de nucleótidos, individualmente o combinados, provee un medio para la detección de la preeclampsia durante el embarazo. Adicionalmente, describe kits para el diagnóstico de pacientes con alto riesgo de desarrollar preeclampsia.

En el artículo "Increased Tissue Factor and Thrombomodulin Expression and Histopathological Changes in Placentas of Pregnancies with Preeclampsia" (Ayala- Ramirez P, et al, 2016), se estudió la relación entre los niveles de TM y la patogénesis de la preeclampsia y se encontraron diferencias significativas entre los niveles de ARN mensajero (ARNm) de TM entre las placentas de mujeres con PE y las de mujeres con gestaciones normales, de donde se concluyó que tanto los factores pro-coagulantes como anticoagulantes están involucrados con la fisiopatología de esta enfermedad.

Por otra parte, en el artículo “Expression of Tissue Factor and Thrombomodulin in Placentas of Pregnancies Affected by Early-Onset and Late-Onset Preeclampsia" (Ayala-Ramirez P, et al, 2021), los resultados obtenidos coinciden con la evidencia que soporta un rol del factor tisular (F3) y la TM en la fisiopatología de la preeclampsia en la placenta, lo que representa un incentivo para llevar a cabo más estudios que permitan elucidar el rol de estas moléculas en la fisiopatología de la preeclampsia y generar mayor conocimiento acerca de esta enfermedad. Por ejemplo, se ha observado que la TM presente en el plasma materno se deriva de la placenta o de las células endoteliales subsecuente a alteraciones vasculares, es decir, que esta proteína puede ser un marcador de las alteraciones endoteliales que muestra un incremento significativo en el plasma.

Así, los avances obtenidos hasta el momento han permitido identificar moléculas que podrían ser marcadores de predicción de la PE antes de las 20 semanas de gestación, lo cual es relevante dado que la identificación temprana de gestantes en riesgo permitiría eventualmente estrategias de prevención, diagnóstico oportuno, seguimiento y manejo adecuado, que impactarían de manera positiva en la salud de la madre y su descendencia.

Así, aunque hay varios autores que proponen la medición de TM a nivel de proteína como un método para establecer mujeres en riesgo de desarrollar preeclampsia, únicamente se ha reportado en un estudio niveles elevados de TM a nivel de proteína en los tres trimestres (Prochazka, M. et al. Markers of endothelial activation in preeclampsia, 2015) y no se ha reportado en otros trabajos que la medición de los niveles de TM puedan ser de utilidad en la predicción temprana de la preeclampsia. Muchos biomarcadores proteicos han sido relacionados con la preeclampsia, sin embargo, hasta el momento no se ha encontrado un marcador específico proteico para la predicción de preeclampsia.

La presente divulgación proporciona una solución prometedora a través de la medición de los niveles de ARNm de TM en sangre materna a partir de la semana 5 y antes de la semana 20 del embarazo, lo que permitiría identificar madres gestantes que posteriormente pueden desarrollar PE con una sensibilidad del 100% y una especificidad del 62%. Este tipo de tamizaje constituiría una herramienta valiosa para la promoción y prevención de la salud materna en la primera etapa del embarazo y para políticas y programas de salud pública dirigidos a esta población. Asimismo, la predicción de la preeclampsia en períodos tempranos del embarazo como el primer trimestre, permitiría intervenciones efectivas para la prevención de la enfermedad. La identificación de gestantes con alto riesgo de desarrollar preeclampsia en dichos periodos, permitiría un seguimiento adecuado que eventualmente mejoraría la atención materna y el desenlace del embarazo, que busca ayudar a disminuir la principal causa de muerte materna en países de Latinoamérica y el Caribe.

Los ensayos realizados incluyeron población gestante en general sin tener en cuenta antecedentes de riesgo para preeclampsia, por lo que el kit que se describe en la presente divulgación puede ser utilizado en población de bajo y alto riesgo para preeclampsia.

BREVE DESCRIPCIÓN

La presente divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico de tipo ARNm, kits para la detección de ARNm de TM en sangre materna por PCR en tiempo real que comprenden dichas moléculas y un método de evaluación de la preeclampsia mediante la detección de niveles de ARNm de TM en plasma por PCR en tiempo real con dichos kits.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIG. 1. Representación de la hibridación en el gen de la trombomodulina (TM) (Genebank ID NM_000361.2). FIG. 2. Diagrama de Cajas y bigotes que muestra la 1 concentración de ARNm de trombomodulina (TM) obtenido de plasma, representado en logio del MoM. Mediana de ARNm de trombomodulina (TM) en las gestantes que desarrollaron preeclampsia MoM=4,95 rango mínimo y máximo MoM=l,21-66,29. Mediana de ARNm de trombomodulina (TM) en las gestantes que no desarrollaron preeclampsia MoM=0,84 rango mínimo y máximo MoM=0, 05-852, 10. Valor de p=0,042.

FIG. 3. Correlación entre los niveles de MoM de ARNm de trombomodulina (TM) y la semana de toma de muestra. Correlación de Spearman -0,10 (p=0,267)

FIG. 4. Curva ROC para ARNm de trombomodulina (TM) con área bajo la curva 0,745; error estándar 0,055; intervalo de confianza del 95% 0,637 a 0,854 y valor de p=0,043

DESCRIPCIÓN DETALLADA

Para propósitos de interpretar los términos usados a lo largo del presente documento se debe tener en cuenta su significado usual en el campo técnico, a menos que se incorpore una definición particular o el contexto indique claramente lo contrario. Adicionalmente, los términos utilizados en forma singular también incluirán la forma plural.

La presente divulgación se refiere a moléculas de ácido nucleico de tipo ARNm diseñadas para hibridarse con regiones específicas del gen de la trombomodulina (TM) (Genebank ID NM_000361.2), que se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID No. 1, SEC ID No. 2 y SEC ID No. 3 como se establecen en la Tabla 1.

Tabla 1. Secuencias de nucleótidos de las moléculas de ARNm diseñadas

En otro aspecto de la presente divulgación, se describe un kit para la detección de ARNm de TM en sangre materna por PCR (siglas en inglés que representan la reacción en cadena de la polimerasa) en tiempo real que comprende los iniciadores que se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, y la sonda que consiste en SEC ID No. 3

En una modalidad particular, la sonda de hidrólisis está marcada en los extremos 5’ y 3’ con diferentes tipos de moléculas radioactivas o fluorescentes, seleccionadas entre, pero sin limitarse a, nucleótidos marcados con ³² P o tritio, digoxigenina, derivados de la fluoresceína que comprenden fluoresceína isotiocianato (FITC) y 5 -(6) carboxifluoresceina-N-hidroxisuccimida ester (FAM); derivados de la rodamina que comprenden tetrametil rodamina isotiocianato (TRITC) y el rojo Texas (cloruro de sulfonilo de sulforodamina 101); colorantes de cianina de amplia longitud de onda que comprenden Cy5.5 - Cy7; partículas de cristal nanométricas llamadas "puntos cuánticos", 5'-dicloro-dimetoxi-fluoresceína (JOE), 6-VIC, hexacloro-fluoresceína (HEX), 5- TAMRA-5-carboxitetrametilrodamina, NED, carboxirodamina (ROX), carboxi-2,4,7,7- tetraclorofluoresceina (TET) y desactivadores de fluorescencia o “quenchers” seleccionados entre BlackBerry (9-[4-nitro-2',5'-dimetoxi-azobenz-4'-il)-diazo]- julolidina-8]-O-hexyl-[2-cianoeil-(N,N-diisopropil)]-fosfora midita), Deep Dark, Dabey, 4-N-methyl-N-(4'-nitro-2'-cloroazobenzen-4-il)-aminobutanami do-1-(2-O- dimetoxitritiloximetil)-pirrolidin-4-il-O-(2-cianoetil)-(N,N -diisopropil)-fosforamdita (Eclipse), Iowa Black® FQ, Iowa Black® RQ , Black Hole Quencher®- 1, Black Hole Quencher®-2, éster de succinimidilo del ácido QSY 7, ácido dimetilaminoazobenzenesulfónico (Dabsyl) entre otros.

En una modalidad particular, la sonda está marcada con 6-carboxifluoresceína (6-FAM) en el extremo 5’ y BlackBerry Quencher (BBQ) en el extremo 3’.

La ventaja de utilizar este fluorocromo y este “quencher”, es que la mayoría de equipos en los que se realiza la PCR, termocicladores en tiempo real, tienen canales para excitar y leer a la longitud de onda de emisión de estos compuestos. Además, son económicos y con buen desempeño en la mayoría de los equipos.

En un aspecto adicional, la presente divulgación se refiere a un método de tamizaje temprano de la preeclampsia que comprende extraer ARNm de plasma materno y detectar niveles de ARNm de trombomodulina mediante PCR en tiempo real con un kit que comprende los iniciadores que se seleccionan del grupo que consiste en SEC ID No. 1, SEC ID No. 2, y la sonda que consiste en SEC ID No. 3.

El ARNm se extrae del plasma materno por cualquier método conocido en la técnica. La muestra de sangre se toma de madres gestantes con menos de 20 semanas de progresión del embarazo, más específicamente entre la semana 8 y 18. Se realiza PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR) con una mezcla de reacción que contiene un primer forward (5 μM) entre 0,125 μM y 0,5 μM de concentración final (entre 0,25 a 1 microlitros en un volumen final de 10 microlitros); primer reverse (5 μM) entre 0,125 μM y 0,5 μM de concentración final (entre 0,25 a 1 microlitros en un volumen final de 10 microlitros)); sonda (2 μM) entre 0,062 μM y 0,25 μM de concentración final (entre 0,125 a 0,25 microlitros con volumen final de 10 microlitros); activador entre 2,5 mM y 3,75 mM de concentración final (entre 0,5 a 0,75 microlitros en un volumen final de 10 microlitros); máster mix 3,7 microlitros (en volumen final de 10 microlitros) y ARN entre 5 y 28 nanogramos por microlitro (5 microlitros en volumen final de 10 microlitros).

En una modalidad particular, la mezcla de reacción contiene primer forward (5 μM) 0,5 microlitros; primer reverse (5 μM) 0,5 microlitros; sonda (2 μM) 0,25 microlitros; activador 0,65 microlitros; máster mix 3,7 microlitros y ARN 5 microlitros.

Las condiciones del termociclador para la QRT-PCR son

En una modalidad particular, la QRT-PCR se realiza en las siguientes condiciones:

Los fragmentos obtenidos de la amplificación se purifican y se detectan por cualquier método conocido en la técnica. En una modalidad particular los fragmentos se purifican utilizando un kit comercial como el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, Wisconsin) siguiendo el protocolo del fabricante. En otra modalidad, los fragmentos se detectan por espectrofotometría, por ejemplo, en un espectrofotómetro Nanodrop 2000® utilizando como blanco agua libre de nucleasas.

El número de copias por μl se determina utilizando la fórmula:

Fórmula 1 : μg/pmol de ARN = (Tamaño en pb del DNA o ARN ds)x(649 g/mol)x(10 ^-12 mol/pmol)x(10 ⁶ μg/g)

Fórmula 2:

Copias/ μl = (ng/ μl de ARN / μg/pmol de ARN)x(10 ^-12 mol/pmol)x(10 ^-3 mg/g)x(6,022 x10 ²³ )

La presente invención será presentada en detalle a través de los siguientes ejemplos, los cuales son suministrados solamente con propósitos ilustrativos y no con el objetivo de limitar su alcance.

EJEMPLOS

Ejemplo 1. Diseño de iniciadores y sondas para detección de ARNm de trombomodulina El diseño de los iniciadores y las sondas se realizó utilizando el programa Primer 3 (https://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/) y Primer-blast https://www.ncbi.nlm, nih _: gov/tools/primer -blast/ utilizando la secuencia con el código de acceso del genebank NM_000361.2. Con base en los parámetros anteriores se obtuvieron las secuencias que se listan en la Tabla 2, las cuales se hibridan con las regiones del gen de la TM ID1 como se observa en la Figura 1.

Para la realización de los ensayos, la sonda de hidrólisis fue marcada con 6- carboxifluoresceína (6-FAM) en el extremo 5' y BlackBerry® Quencher (BBQ®) (9-[4- nitro-2',5'-dimetoxi-azobenz-4'-il)-diazo]-julolidina-8]-O-h exil-[2-cianoetil-(N,N- diisopropil)]-fosforamidita) en el extremo 3'.

Tabla 2. Secuencias de sondas e iniciadores

Ejemplo 2. Detección de ARNm de TM

2.1 Toma de muestra y procesamiento inicial

Se emplearon los iniciadores y la sonda del kit descrito anteriormente. Se recolectaron muestras de 106 gestantes de menos de 20 semanas de gestación a las cuales se les siguió hasta su desenlace.

La toma de la muestra se realizó mediante el método convencional, utilizando aguja venoject® unida a una camisa vacutainer®; también puede realizarse la toma de muestra de sangre utilizando jeringa teniendo la precaución de adicionar anticoagulante EDTA inmediatamente después de la extracción. Se tomaron 4 mi de sangre en el tubo con anticoagulante (EDTA). La muestra de sangre se procesó antes de 4 horas de la recolección. Se centrifugó a 3000 rpm por 15 minutos a temperatura ambiente, se tomaron 2 mi de plasma y se pasaron a un tubo de fondo cónico de 15 mililitros. Se adicionaron 2 ml de tiocianato de guanidina/fenol (QIAzol Lysis Reagent (Qiagen)) a la muestra, se mezcló con vórtex y se almacenó a -20 C hasta su procesamiento (máximo 1 semana).

2.2 Extracción de ARNm

Para la extracción de ARNm del plasma obtenido en 2.1, se utilizó el kit miRNeasy serum/plasma kit® de Qiagen (Cat. No. / ID: 217184). A la mezcla de 4 ml de plasma/ tiocianato de guanidina/fenol (QIAzol Lysis Reagent (Qiagen)) se adicionaron 400 microlitros de cloroformo y se mezcló con vortex por 10 segundos. Se centrifugó a 4.000 rpm por 15 minutos a 4°C. Se transfirió el sobrenadante a otro tubo y se adicionó etanol 70 % correspondiente a la misma cantidad de sobrenadante y se mezcló con vortex. Se adicionaron 700 microlitros de la mezcla obtenida a la columna de Qiagen y se continuó el procesamiento de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

2.3 PCR en tiempo real cuantitativa (QRT-PCR)

Para la amplificación del fragmento de interés, la PCR en tiempo real (QRT-PCR) se realizó en un termociclador LightCycler® Nano de Roche® utilizando el LightCycler® 480 ARN master hydrolysis probes kit de Roche®, con una mezcla de reacción de 60 μl como se muestra en la Tabla 3 y con las condiciones de la Tabla 4. Posteriormente se procedió a purificar el fragmento obtenido utilizando el kit Wizard® SV Gel and PCR Clean -Up System (Promega, Wisconsin) siguiendo el protocolo del fabricante.

Tabla 3. Mezcla de reacción de amplificación del fragmento de interés para un volumen final de 60 μl: Tabla 4. Condiciones de termociclador

2.4 Elaboración de la curva estándar

Para la elaboración de la curva estándar de ARNm, se utilizó ARN extraído de tejido de placenta. La extracción se realizó de la siguiente manera: Se pesaron aproximadamente 80 mg de tejido de parénquima placentario en un tubo de 2 mililitros, se agregaron 500 μl de solución de lisis celular [0,025M de EDTA; 0,069M SDS] y 16 μl de proteinasa K [25 mg/ml]. Se homogenizó la muestra con un macerador eléctrico, se incubó el tejido macerado en baño serológico a 65°C por 24 horas. Se agregó 1 mi de trizol (tiocianato de guanidina/fenol) (Invitrogen®) y se mezcló con vórtex por 10 segundos. Se incubó por 5 minutos a temperatura ambiente. Se agregaron 200 μl de cloroformo, se mezcló con vórtex por 10 segundos y se incubó a temperatura ambiente por 3 minutos. Se centrifugó a 12.000 rpm por 15 minutos, se pasó la fase acuosa a un tubo de 2 mi, se agregaron 500 μl de isopropanol puro y se mezcló, se incubó por 10 minutos a temperatura ambiente. Se centrifugó a 12.000 rpm por 10 minutos, se descartó el sobrenadante y se adicionaron 500 μl de etanol al 70%, se mezcló por inversión. Se centrifugó a 7500 rpm por 5 minutos, se descartó el sobrenadante, se adicionaron 50 μl de agua libre de ARNasas. Se incubó por 10 minutos a 56°C en baño serológico y se almacenó a -20 °C hasta su procesamiento (máximo 24 horas). Se amplificó el fragmento de interés de acuerdo con la QRT-PCR del punto 2.3 y se cuantificó el ARNm en un espectrofotómetro Nanodrop 2000® utilizando como blanco agua libre de nucleasas y 2 μl de muestra (entre 5,7 y 28 ng/μl de ARN).

Para realizar la curva estándar se realizaron 6 diluciones seriadas en un volumen final de 100μL. Las diluciones fueron 10 ¹¹ , 10 ⁹ , 10 ⁷ , 10 ⁵ , 10 ³ y 10 ¹ copias/ μl y se realizó una QRT-PCR por duplicado utilizando las diluciones preparadas. Para la realización de la curva estándar, la mezcla de reacción es la siguiente:

Tabla 5. Mezcla de reacción de amplificación para las diluciones de ARNm de la curva estándar:

Con los datos obtenidos se construyó la gráfica utilizando la fórmula de la ecuación lineal y=mx+b, donde y es el valor de ct (ciclo umbral) y x la concentración en copias / μl. Se validó la curva con un valor de rho por encima de 0,9, con un valor de p<0,05 y una eficiencia por encima de 1,9.

2.5 Determinación de ARNm en las muestras

Se realizó la QRT-PCR a partir de la muestra de ARNm extraída de plasma según lo descrito en el punto 2.2, junto con 2 muestras que corresponden a diluciones de la curva estándar. Se utilizó como control intemo un amplificado del gen GAPDH y como control negativo agua grado molecular. La mezcla de reacción que se utilizó fue la siguiente, y las condiciones del termociclador descritas en la Tabla 3. Tabla 6. Mezcla de reacción para amplificación de la muestra y el control negativo

Los parámetros de validación de la amplificación son:

Control negativo: no amplifica

Control intemo: amplifica con un ct menor a 25 ciclos

Diluciones: amplifican 10 ⁵ copias / μl con un ct no mayor a 30 ciclos, 10 ⁷ copias / μl con un ct no mayor a 25 y /o 10 ⁹ copias / μl con un ct no mayor a 20 ciclos.

Ejemplo 3. Resultados de cuantificación de ARNm

Para establecer la cantidad de copias / μl de ARN de trombomodulina (TM) de cada una de las muestras, se extrapolaron los valores de ct a la curva estándar. Con estas concentraciones se halló la mediana de todas las muestras evaluadas y a cada una de las muestras se le calculó el múltiplo de la mediana (MoM). El punto de corte para establecer riesgo de desarrollar preeclampsia es de 1,20. Es decir que mujeres con MoM igual o superior de 1,20 tienen un riesgo elevado de desarrollar preeclampsia, por el contrario, valores por debajo de MoM 1,20 tienen bajo riesgo de desarrollar preeclampsia.

En la Tabla 7 y la Figura 2 se muestran los resultados de la cuantificación presentando los valores de MoM. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas, comparando las medianas con la prueba de U Mann Whitney, entre los grupos encontrándose mayor concentración en las pacientes que desarrollaron PE con un aumento de 5,8 veces sobre las mujeres que no desarrollaron PE. Tabla 7. MoM de la cantidad de ARNm (ARN mensajero) de trombomodulina obtenido de plasma

Adicionalmente se analizaron las concentraciones de ARNm de TM en las gestantes que desarrollaron hipertensión inducida por el embarazo (HIE) para saber si el aumento de los niveles era específico de la PE o de los trastornos hipertensivos del embarazo, por ese motivo se realizó el análisis de los niveles de TM entre las mujeres que desarrollaron HIE (n=10) y las que no, excluyendo las 6 mujeres con PE. No se evidenciaron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (p=0,705).

De la misma manera, se analizaron los niveles de TM en las pacientes que desarrollaron RCIU (n=9), sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticamente significativas (p=0,606), lo que indica que el aumento de los niveles de ARNm de TM antes de la 20 semana podría ser específico de la PE.

Para establecer el comportamiento de los niveles de MoM de ARNm de TM a lo largo de las semanas de gestación, se realizó un análisis de coeficiente de correlación de Spearman, como se observa en la Figura 3. No se encontró una correlación entre el MoM de TM y la edad gestacional.

De acuerdo con los resultados obtenidos, se observó un aumento significativo en los niveles de ARNm de TM en pacientes que desarrollaron preeclampsia. Por lo tanto, para valorar el grado de especificidad y sensibilidad a varios puntos de corte se construyó una curva ROC (Receiver Operating Characteristic), como se observa en la Figura 4 y en la Tabla 8. Adicionalmente, se calculó el VPP (valor predictive positivo), VPN (valor predictive negativo) y los falsos positivos. Se estableció MoM >1,20 como el mejor punto de corte, con un 100% de sensibilidad y una especificidad de 62,6%.

Tabla 8. Tabla de contingencia para establecer valores predictivos del MoM del ARNm de trombomodulina

Valores predictivos de ARNm de TM:

VPP (valor predictive positivo) = 6/ (6+37) * 100= 14% VPN (valor predictive negativo) = 62/ (0+62) * 100= 100%

Falsos positivos: 37,4%

La utilización de los niveles del múltiplo de la mediana (MoM) para el establecimiento del riesgo, es un método más comúnmente utilizado en el estudio de los biomarcadores, ya que es de fácil interpretación por el clínico y permite controlar la variabilidad entre los laboratorios. También es posible utilizar el reporte de valores absolutos.