Campo da Invenção

A presente invenção se refere a um processo de produção de linhagens mutantes atenuadas, capazes de promover imunização, a vetores vacinais e vacinas para o tratamento de salmonelose e a seu uso no combate a tal infecção. Especificamente, tais mutantes são nulos para os genes hupA e hupB de HU e foram testados quanto a atenuação da virulência e capacidade de desencadear resposta imune efetiva e protetora contra a salmonelose.

Fundamentos e Antecedentes da Invenção

Sal onella

O género Salmonella sp pertence à família Enterobacteriaceae e é formado por bacilos gram-negativos, anaeróbios facultativos e geralmente flagelados (Mastroeni e Maskell, 2006) . A classificação sorológica dessa bactéria fundamenta-se na identificação de antígenos somáticos (O) , flagelares (H) e capsulares (Vi) , este último quando presente .

Estudos de hibridação de DNA sugerem a existência de duas espécies de Salmonella: S. entérica e S. bongori. A espécie S. entérica é subdividida em 7 subgrupos, sendo que a grande maioria das sorovariedades patogênicas para o homem está incluída no subgrupo I (Boyd et al. 1996).

As sorovariedades de S. entérica patogênicas podem causar, em mamíferos, infecções com diferentes graus de gravidade, desde gastroenterites localizadas na mucosa intestinal até infecções sistémicas graves, dependendo da sorovariedade bacteriana e do tipo de hospedeiro envolvido (Bãumler et al., 1998).

S. entérica Typhi é o agente causador da febre tifóide, uma infecção sistémica grave no homem (Guzman et al.,2006). S. entérica Choleraesuis causa infecções sistémicas graves, principalmente em suínos, embora também possa causar infecções em humanos (Mastroeni e Maskell, 2006; Salyers e Whitt, 2002) . Salmonella entérica Dublin é uma sorovariedade associada principalmente a bovinos. Como S. entérica Thyphi em humanos, a sorovariedade Dublin é invasiva e pode causar gastroenterites e septicemia nesses animais (Mastroeni e Maskell, 2006) . S. entérica Typhimurium e Enteritidis são causas comuns de gastroenterites em humanos, mas também podem estar associadas a infecções extra-intestinais (Mastroeni e Maskell, 2006) . Em camundongos, S. entérica Typhimurium e Enteritidis causam um tipo de infecção muito semelhante à febre tifóide humana. Desta forma, camundongos BALB/c são utilizados como o modelo murino de infecção sistémica por S. entérica .

Salmonelose e doença

A salmonelose é uma das doenças infecciosas mais frequentes tanto em humanos quanto em outros animais. A infecção por S. entérica inicia-se com a ingestão de água ou alimentos contaminados, particularmente alimentos derivados de aves e suínos. Estes microrganismos são patógenos intracelulares facultativos e, uma vez ingeridos, apresentam a capacidade de aderir e invadir células da mucosa intestinal, preferencialmente células M (Jones et al., 1994) . Uma vez ultrapassada a mucosa intestinal, S. entérica invade, persiste e prolifera no interior de vacúolos de células do sistema retículo endotelial podendo assim, alcançar diferentes órgãos e tecidos do hospedeiro, causando infecção sistémica (Salyer e Whitt, 2002) . Estas infecções representam, ainda hoje, um grave problema de saúde pública, devido sua alta incidência e gravidade, principalmente em áreas subdesenvolvidas do mundo, onde as condições de higiene e saneamento básico são ainda precárias (Woc-Colburn e Bobak, 2009; Boyle et al . , 2007; Coburn et al. 2007; Figueroa-Ochoa e Verdugo-Rodrigues, 2005; Graham, 2002) . No Brasil a salmonelose é um problema sério de saúde pública especialmente em regiões mais pobres (Fernandes et al. 2006, Ghilardi et al., 2006).

A dose infectante média (DI5 ₀ ) de S. entérica capaz de produzir infecções clinicas ou subclinicas em humanos está entre 10 ⁵ -10 ¹⁰ organismos ingeridos. O processo infeccioso é localizado no íleo, cólon e linfonodos mesentéricos após a ingestão de alimento contaminado, com o aparecimento de sintomas tais como diarréia, vómito e dores abdominais (revisado por Darwin e Miller, 1999) . A maioria dos casos de gastroenterites ocorre em crianças com menos de 10 anos de idade, e os sintomas tendem a ser mais severos neste grupo, podendo a infecção tornar-se sistémica.

Uma importante barreira encontrada por S. entérica no processo infeccioso, após sua passagem pelo epitélio intestinal, são os macrófagos da submucosa (Mastroeni e Maskell, 2006; Salyers e Whitt, 2002) . Os macrófagos detectam e internalizam o patógeno bacteriano a fim de eliminá-lo do hospedeiro.

As sorovariedades de S. entérica , capazes de causar infecção sistémica, invadem os macrófagos e então ativam mecanismos de virulência que permitem a evasão das funções microbicidas do fagócito, permitindo a sobrevivência e replicação no ambiente intracelular (Mastroeni e Maskell, 2006; Salyers e hitt, 2002; Alpuche-Aranda, et al., 1994) . A migração de macrófagos infectados para outros órgãos do sistema monocitico fagocitário facilita a disseminação da bactéria no hospedeiro.

Salmonella e Vacinas

A busca por uma vacina efetiva contra a febre tifóide compõe um importante capitulo na história da Microbiologia. Várias estratégias e formulações vacinais foram testadas tais como bacterianas, vacinas de subunidades e linhagens vivas atenuadas (revisado por Bueno et al . , 2009; Galen et al . , 2009; Guzman et al., 2006) . O antigeno capsular Vi purificado, livre ou conjugado com proteínas carreadoras é imunogênico quando administrado por via intramuscular ou subcutânea e tem se mostrado eficaz em alguns estudos

(Guzman et al., 2006; Strugnell e Wijburg, 2006) . Contudo, devido a suas características e modo de administração, é incapaz de induzir o sistema imune ao nível de mucosa

(MALT, do inglês mucosal associated lymphoíd tissue) . Desta maneira, esforços foram canalizados no desenvolvimento de vacinas constituídas por linhagens vivas atenuadas, ideais para induzir resposta imune ao nível do MALT.

A primeira vacina viva atenuada desenvolvida contra a febre tifóide é composta pela linhagem S. entérica Typhi Ty21a. Esta linhagem foi obtida por mutagênese química da linhagem parental Ty2 (Germanier e Furer, 1983) . Esta vacina oral é segura, mas devido a sua grande atenuação, requer várias doses para induzir imunidade, que frequentemente é de curta duração (Guzman et al., 2006; Strugnell e Wijburg, 2006) .

Os resultados alcançados com a linhagem Ty21a levaram vários grupos a construírem novas linhagens vacinais de S. entérica, contendo deleções em genes alvo específicos que atenuaram a virulência. Adicionalmente, essas linhagens apresentam uma característica fundamental para vacinas vivas, a estabilidade da atenuação, uma vez que a mesma foi alcançada por deleção de um ou mais genes (revisado por Guzman et al., 2006). Esses mutantes foram construídos inicialmente em S. entérica Typhimurium, devido à disponibilidade do modelo murino de infecção, sendo as mutações promissoras transferidas para linhagens de S. entérica Typhi, muitas vezes a própria Ty2 (revisado por Guzman et al., 2006). Sendo assim, linhagens ÁaroA, AaroC, AaroD de S. entérica, deficientes na via biossintética dos aminoácidos aromáticos (Tacket et al., 1997), mutantes Acya Ácrp, incapazes de expressar adenilato ciclase e o receptor para cAMP (Curtiss e Kelly, 1987; Tacket et al., 1997), mutantes phoP-phoQ (Hohmann et al., 1996) entre outros, foram construídos e demonstraram-se imunogênicos, apesar da atenuação da virulência. No entanto, com frequência, testes em voluntários humanos indicaram a ocorrência de bacteremia e/ou a necessidade de várias doses para a indução de imunidade (Guzman et al., 2006; Strugnell e Wijburg, 2006). De fato, diversos estudos têm demonstrado o desafio de se ajustar o grau de atenuação da linhagem vacinai para, de um lado, não comprometer a resposta imune e de outro, ser livre de efeitos colaterais.

A capacidade de invadir, sobreviver e proliferar no interior de macrófagos, polimorfonucleares e células dendríticas, aliada à disponibilidade de mutantes atenuados fazem de S. entérica um excelente carreador de antígenos a células do sistema imune. Assim, linhagens atenuadas de S. entérica podem ser manipuladas geneticamente de tal forma a expressar antígenos heterólogos, construindo-se linhagens vacinais multifatoriais . Diferentes antígenos derivados de outras bactérias, vírus, fungos, parasitas e mesmo de células ^■ de mamífero foram expressos em linhagens vacinais de S. entérica . Estas linhagens foram capazes de induzir resposta imune protetora não somente contra a salmonelose, mas também contra o organismo doador do antígeno heterólogo (Cheminay e Hensel, 2007; Kwon et al., 2007; Loessner et al., 2007; Mahoney et al., 2007; Atkins et al., 2006). Uma característica fundamental de tais linhagens é, além de ser muito improvável a reversão da atenuação, a capacidade de expressar o antígeno heterólogo de forma estável e em quantidades suficientes para induzir o sistema imune.

No início, a clonagem e expressão de antígenos em S. entérica eram alcançadas através da utilização de plasmídeos carregando genes de resistência a antibióticos

(Cárdenas e Clements, 1992) . Alguns estudos demonstraram, no entanto, que na ausência de pressões seletivas, tais plasmídeos eram instáveis e, portanto, perdidos após poucos ciclos de replicação in vivo (Cárdenas e Clements, 1992; Dunstan et al . , 2003) ou até mesmo durante o cultivo in vitro (Everest et al., 1995).

Para resolver tais problemas, estratégias como a utilização de promotores induzidos in vivo no controle de expressão do antígeno (Cheminay e Hensel, 2007; Marshall et al., 2000), construção de sistemas letais balanceados

(Curtiss et al., 1990; Everest et al., 1995) ou a integração do gene heterólogo no cromossomo de S. entérica

(Hone et al., 1988; Strugnell et al., 1990; Everest et al., 1995) foram descritos.

O nucleóide bacteriano e os genes-alvo: hupA e hupB

Bactérias contêm proteínas que compõem o nucleóide bacteriano ("nucleoid-associates proteins", Nap) juntamente com o DNA cromossômico . Diferente das histonas de eucariotos, as proteínas bacterianas parecem não formar com o DNA complexos análogos aos nucleossomas (Thanbichler et al . , 2005). Dentro deste grupo encontram-se 12 proteínas sendo que as mais estudadas são HU, FIS, IHF, HNS e DPS (Dorman, 2009; Dorman e Kane, 2009; Cróinín e Dorman et al, 2007; Dorman et al., 2006; Drlica e Rouviere-Yaniv, 1987).

HU é uma proteína heterodímérica codificada por dois genes, sendo eles hupA e hupB. Esta proteína parece não reconhecer nenhuma sequência específica para a ligação ao DNA, mas apresenta grande afinidade a regiões supercoiled ou que apresentem distorções na estrutura do DNA (Pinson et al., 1999). Swinger et al. (2004) demonstraram que essa proteína é capaz de induzir e estabilizar curvaturas de diferentes ângulos no DNA. Alguns estudos sugerem que HU participe do reparo do DNA por recombinação (Swinger et al., 2004) .

Há poucos dados na literatura sobre a proteína HU e Salmonella especificamente (Mangan et al., 2011), embora haja mais relatos entre essa proteína e Escherichia coli. Ainda assim, os estudos descritos focaram-se no funcionamento da proteína demonstrando a regulação de fatores de patogenicidade, mas não investigaram a possível atenuação promovida pela deleção dos genes hupA ou hupB e a indução de proteção no modelo murino.

O gene hupA de Salmonella foi comparado ao gene hupA de E.coli por clonagem e sequenciamento, o que revelou que as subunidades HUa dessas bactérias são idênticas e que as sequências fora das ORFs são altamente conservadas (Higgins & Hillyard, 1988) .

Esses estudos revelam que a proteína HU afeta processos celulares como compactação do DNA, replicação, recombinação, regulação gênica, além de participar no crescimento termo sensível, adaptação na fase estacionária de crescimento, lisogenia e transposição do bacteriófago Mu e é capaz de se ligar inespecificamente ao DNA (Bi et al . , 2009) . Em S. entérica HU coordena a expressão de genes envolvidos no metabolismo central e virulência (Mangan et al., 2011) .

O gene hupB já foi descrito como sendo um modulador negativo na expressão de hilA, que é um gene crucial na expressão do fenótipo invasivo de Salmonella (Fahlen et al., 2000) . No entanto, há controvérsias sobre a ação de hupB, pois estudos posteriores realizados por outro grupo de pesquisa apontaram que esse gene tem uma ação positiva na regulação de hilA (Schechter et al., 2003).

Berger et al. (2009) construíram um duplo mutante áhupAAhupB de E.coli para verificar as alterações na estrutura genômica promovida pela ausência da proteína HU. Por esse estudo, foi possível observar que a ausência de HU provoca um rearranjo espacial no padrão de transcrição, causando uma perturbação da homeostase topológica que é compensada por uma maior acessibilidade de sítios de DNA pela topoisomerase .

O sistema de recombinação λ Red

Em bactérias entéricas, a obtenção de recombinantes utilizando moléculas lineares de DNA é um evento altamente raro, devido à instabilidade da molécula de DNA linear, que uma vez no interior da célula é rapidamente degradada pela atividade de nucleases do sistema de recombinação RecBCD. Para contornar esta dificuldade, um sistema baseado no uso da maquinaria de recombinação do bacteriófago λ (o sistema Red) foi proposto.

Datsenko e Wanner (2000) descreveram a construção e o emprego, de um sistema baseado no bacteriófago λ para a construção de linhagens mutantes de bactérias entéricas. Este sistema é composto por plasmídeos acessórios, sendo o plasmídeo pkD3 utilizado na construção de cassetes de recombinação por PCR (Datsenko e Wanner. 2000) .

Durante a busca de anterioridade, o documento US 2004/101531 reivindica a deleção dos genes cya e crp de Salmonella . Embora a estratégia da presente invenção tenha sido similar, a deleção ocorreu em outros genes, hupA e hupB, o que conferiu atenuação da bactéria e consequente aplicação da mesma como vetor vacinai. Portanto, nota-se que uma estratégia de imunização baseada no silenciamento gênico de HU não foi descrita nem sequer sugerida pelo referido documento.

O pedido de patente brasileiro PI 0006291-0, depositado em 27 de dezembro de 2000 em nome de Intervet International B.V. e intitulado: "Bactéria do Género Salmonella , Vacina para a Proteção de Animais contra a Salmonelose, Uso de uma Bactéria _r e, Processo para a Preparação de uma Vacina", se refere a bactérias de Salmonella para uso como uma vacina. A invenção também diz respeito a vacinas com base nas ditas bactérias, que são úteis para a prevenção da patogênese microbiana. Além disso, o referido documento diz respeito ao uso de tais bactérias ou à fabricação de tais vacinas.

Como pode ser observado, o referido documento PI 0006291-0 diz respeito somente à atenuação promovida pela deleção de outro gene, isto é, o gene recA.

A patente americana US 7,045,122, depositada em 15 de novembro de 2001, em nome de AKZO NOBEL N.V e intitulada: "Salmonella Vaccine" refere-se a cepas vivas atenuadas de Salmonella compreendendo uma primeira mutação atenuante, que não são capazes de produzir RecA funcional. A invenção também relata que estas bactérias são para uso em vacinas.

Como pode ser observado, o referido documento US

7,045,122 também diz respeito somente a atenuação promovida pela deleção de um gene, isto é, o gene recA.

O pedido de patente internacional WO/2010/096888 , depositado em 25 de fevereiro de 2010, em nome de Universidade Estadual de Campinas - UNICAMP e intitulado: "Vacinas Compreendendo Linhagens Atenuadas, Processo de Construção de Linhagens Atenuadas, Vetores Vacinais e seu Uso no Tratamento da Salmonelose" revela uma nova alternativa para a prevenção de salmonelose, a partir de mutantes capazes de promover imunização do hospedeiro. Em especial tais mutantes são nulos para os genes himA e himD de IHF e foram testados quanto a atenuação da virulência e capacidade de desencadear resposta imune efetiva e protetora contra a salmonelose, em especial a salmonelose murina.

Como pode ser observado, no referido documento WO/2010/096888 a atenuação é promovida pela deleção dos genes ihfA ou ihfB.

O documento de patente americano US 2004/101531 descreve vacinas e composições imunogênicas que utilizam bactérias patogênicas vivas atenuadas, tal como Salmonella, para distribuir antigenos ectópicos para o sistema imune da mucosa dos animais vertebrados. As bactérias patogênicas atenuadas são preparadas para secretar o antigeno para o espaço periplasmico das bactérias ou para dentro das bactérias .

Como pode ser observado, no referido documento US 2004/101531 é descrito a deleção dos genes cya e crp de Salmonella .

O emprego de linhagens bacterianas vivas atenuadas como vacina está historicamente associado à indução de resposta imunológica efetiva e persistente. O vetor vacinai é constituído por uma bactéria que expressa antigenos (proteínas) de outras espécies de microorganismos obtidos através do método de DNA recombinante . Quando apresentados ao sistema imune do hospedeiro (organismo alvo) estes microorganismos estimulam a produção de anticorpos contra a doença de interesse, sem que ela cause sintomas ou danos graves ao hospedeiro.

Embora estudos venham demonstrando estratégias de imunização baseada no silenciamento gênico, em nenhum dos casos foi revelado e nem sequer sugerido um processo que permita uma estratégia de imunização baseada no silenciamento gênico de HU.

É sabido que mutações atenuadoras diferentes conferem propriedades biológicas, como imunogenicidade, diferentes. Sumário da Invenção

Para solucionar os problemas acima mencionados, a presente invenção propiciará vantagens significativas em relação aos processos de imunização baseada no silenciamento gênico de HU, possibilitando um aumento do seu desempenho e apresentando uma relação custo/beneficio mais favorável.

A presente invenção se refere em um primeiro aspecto, a construção de mutantes nulos de S. entérica para os genes (hupA e/ou hupB) codificadores de HU (Heat Unstable Protein) com o intuito de desenvolver linhagens atenuadas quanto a virulência, mas capazes de causar infecção transitória e induzir o sistema imune de forma efetiva, constituindo-se em potenciais linhagens vacinais.

É um objeto da presente invenção uma bactéria atenuada compreendendo pelo menos um gene codificador de HU silenciado em uma bactéria patogênica.

A presente invenção refere-se também a uma vacina baseada em bactérias atenuadas compreendendo pelo menos um gene codificador de HU silenciado em uma bactéria patogênica, capaz de induzir e estimular uma resposta imune no hospedeiro vertebrado.

Breve Descrição dos Desenhos

A estrutura e operação da presente invenção, juntamente com vantagens adicionais da mesma podem ser mais bem entendidas mediante referência aos desenhos em anexo e a seguinte descrição:

A Figura 1 é um gel de agarose 1% mostrando o cassete de recombinação gerado por PCR utilizando os primers hupA-f e hupA-r;

A Figura 2a e 2b é um gel de agarose 1% mostrando o produto de amplificação por PCR do gene cat presente em ST662AhupA: cat e ST662AhupB: cat, com os iniciadores hupADTlf e hupADTlr e hupBDTf e hupBDTr, respectivamente;

A Figura 3 é um gel de agarose 1% demonstrando a excisão do gene cat das linhagens ST662AhupA: cat e ST662AhupB: cat para a construção do duplo mutante ST662AhupAÂhupB;

A Figura 4 é um gel de agarose 1% demonstrando os produtos de amplificação por PCR das regiões referentes aos genes hupA e hupB, respectivamente;

A Figura 5 é um esquema demonstrando a deleção dos genes hupA e hupB e a posição dos iniciadores de detecção, representados como setas. Descrição Detalhada da Invenção

Embora a presente invenção possa ser suscetivel a diferentes modalidades, é mostrada nos desenhos e na seguinte discussão detalhada, uma modalidade preferida com o entendimento de que a presente modalidade deve ser considerada uma exemplificação dos princípios da invenção e não pretende limitar a presente invenção ao que foi ilustrado e descrito aqui.

A Figura 1 é um Gel de agarose 1% com o fragmento gerado por PCR, correspondente ao cassete de recombinação do gene hupA para a construção da linhagem mutante . Da esquerda para a direita, as amostras referem-se ao Marcador de Peso Molecular 1 kb DNA ladder (Fermentas) ; controle negativo e o cassete de recombinação do gene hupA, com cerca de 1200 pb, compreendendo o gene cat e regiões flanqueadoras compostas por sítios FRT (FLP Recognition Targets) e regiões adjacentes aos gene-alvo.

As Figuras 2a e 2b é uma construção dos mutantes AhupA e AhupB de S. entérica . Gel de agarose 1% com os produtos de PCR utilizando-se respectivamente os primers hupAD e hupBOT (primers de detecção) para confirmação da mutagênese. O controle positivo corresponde à linhagem selvagem 662ST, com amplificação do gene íntegro e regiões flanqueadoras , gerando fragmento de 396 pb para hupA e 371 pb para hupB, enquanto os mutantes apresentam .banda de aproximadamente 1.2 kb, equivalente ao gene cat e regiões flanqueadoras . MPM: Marcador de Peso Molecular 1 kb DNA ladder (Fermentas) ; CN: Controle Negativo (sem DNA) ; CP: Controle Positivo (DNA genômico da linhagem selvagem) .

A Figura 3 . mostra a eliminação do cassete de resistência ao cloranfenicol em mutantes ΔηιιρΑ e AhupB de S. entérica, demonstrando as "cicatrizes" de cerca de 100 pb, correspondentes também aos sítios FRT. Foram utilizados os primers hupAO l para as linhagens mutantes AhupA e hupBOT para os mutantes AhupB. MPM - Marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder (Fermentas) ; CN - Controle negativo; CmR - linhagens portadoras do gene cat.

A Figura 4 é um gel de agarose 1% demonstrando os produtos de PCR para regiões flanqueadoras ao gene hupA e hupB, respectivamente. Da esquerda para a direita: Marcador de peso molecular 1 kb DNA ladder (Fermentas) ; Controle negativo; Controle positivo para hupA, composto por DNA genômico da linhagem selvagem 662ST, com fragmento referente ao gene íntegro hupA (importante salientar que neste caso os iniciadores hupADT2 foram utilizados, gerando fragmento de 702 pb para hupA) ; Linhagem 662STA.hupA, com fragmento amplificado pelos primers hupAD 2, referente ao gene cat e regiões flanqueadoras; Linhagem duplo mutante 662STAhupAAhupB, amplificado pelos primers hupADT2 ; Controle positivo, composto pelo DNA genômico da linhagem selvagem 662ST, com fragmento referente ao gene íntegro hupB; Linhagem 662STAhupB, com fragmento amplificado pelos primers hupBOT, referente ao gene cat e regiões flanqueadoras ; Linhagem duplo mutante 662STAhupAAhupB, amplificado pelos primers hupBOT.

A Figura 5 é um esquema demonstrativo das etapas de construção das linhagens mutantes AhupA e AhupB e posição dos primers de detecção hupAOT e hupBOT, representados como setas. Inicialmente o gene-alvo está íntegro, demonstrado em branco. Posteriormente, o gene-alvo é substituído pelo gene cat (cloranphenicol acetyl transferase) , também demonstrado em branco. Na última etapa, o gene de resistência ao antibiótico cloranfenicol é eliminado, restando apenas uma "cicatriz" composta por sítios FRT (região hachurada) .

Modalidade Preferencial da Invenção

Bactéria Patogênica

As bactérias patogênicas de acordo com a presente invenção são bactérias capazes de provocar doenças e/ou morte em seus hospedeiros. Exemplos de bactérias patogênicas incluem, sem limitações, bactérias gram negativas, em especial membros das famílias Enterobacteriaceae, Vibrionaceae, Francisellaceae,

Legionallales, Pseudomonadacea ou Pasteurellaceae, incluindo os géneros Salmonella spp., Shigella spp., Escherichia spp., Yersinia spp., e Vibrio spp.

Em especial, bactérias patogênicas da presente invenção são escolhidas dentre as espécies que possuem em seu genoma pelo menos um gene codificador de HU, preferencialmente, mas não exclusivamente, S. entérica sorovar Typhimurium (662ST) .

Gene codificador de HU

O gene codificador de HU da presente invenção é uma sequência de DNA que apresenta homologia de pelo menos 80% com pelo menos uma sequência escolhida dentre hupA ou hupB, as quais são escolhidas dentre as espécies que possuem em seu genoma pelo menos um gene codificador de HU, preferencialmente, mas não exclusivamente, S. entérica sorovar Typhimurium (662ST).

Bactéria Atenuada

Para efeitos da presente invenção, entende-se como bactéria atenuada uma bactéria patogênica que possui pelo menos um gene codificador de HU silenciado. Por "silenciamento" entende-se um processo de deleção de determinada sequência do genoma de uma bactéria. Em especial, o silenciamento foi proporcionado por um cassete de recombinação.

Cassete de recombinação

O cassete de recombinação, de acordo com a presente invenção, é um cassete compreendendo pelo menos uma sequência capaz de silenciar pelo menos um gene codificador de HU em uma bactéria patogênica.

0 cassete de recombinação é composto por iniciadores, que possuem 2 partes continuas, sendo a primeira uma sequência de aproximadamente 40 bases homólogas ao gene alvo e a segunda aproximadamente 20 bases homólogas a uma região presente nos plasmideos a serem utilizados.

As regiões de homologia com o gene codificador de HU foram selecionadas a partir da sequência do banco de dados do projeto Genoma S. entérica (NC_003197) (Washington University, St. Louis, USA) e escolhidas de modo que fossem próximas aos códons de iniciação e terminação do gene.

O cassete de recombinação compreende ainda genes acessórios, como genes de resistência a antibióticos.

Processo de Transformação e Recombinação

O processo de recombinação das bactérias da presente invenção é um processo que se baseia no sistema de recombinação Red. O sistema de recombinação XRed do bacteriófago λ inclui 3 genes: γ, β e exo (presentes no plasmideo pKD46) , que codificam respectivamente as proteínas Gam, Bet e Exo.

Gam inibe o sistema ExoV do hospedeiro, enquanto Bet e Exo promovem a recombinação de fragmentos lineares no DNA alvo .

Os plasmídeos acessórios contêm genes de resistência a antibióticos (Km ^R ou Cm ^R ) flanqueados por sítios FRT (FLP recombinase recognition targets) , formando o módulo de recombinação. Assim, estes plasmídeos são utilizados na criação do cassete de recombinação.

Para a geração do cassete de recombinação, sequências de aproximadamente 40 pb homólogas ao gene alvo são geradas nas extremidades desse módulo por PCR. Assim, o cassete de recombinação é o módulo flanqueado por sequências homólogas ao gene alvo.

Para a geração de mutantes, o plasmideo p D46 é transformado por eletroporação na linhagem hospedeira e os transformantes são submetidos à eletroporação com o cassete de recombinação. A expressão dos genes γ, β e exo inibe a degradação da fita linear de DNA, permitindo a recombinação do cassete. Esta recombinação obedece à homologia de DNA conferida pelas sequências flanqueadoras , de tal forma que a recombinação envolverá sequências homólogas.

Os recombinantes são então selecionados utilizando-se as marcas de resistências carreadas pelo módulo de recombinação. Essas construções permitem uma subsequente remoção do cassete de resistência pela FLP recombinase expressa por um gene plasmidial, no caso o plasmideo pCP20. Desta forma, é possível construir deleções ou inserções de genes em bactérias entéricas, utilizando fragmentos de DNA lineares, gerados por PCR.

. Em especial, o processo de transformação da presente invenção compreende as etapas de:

a) expressão das proteínas Gam, Bet e Exo do bacteriófago λ presentes no plasmideo pKD46, promovendo a recombinação de fragmentos lineares no DNA alvo; e

b) troca alélica do gene codificador de HU pelo cassete de recombinação compreendendo um gene acessório; c) eliminação do gene acessório presente no cassete de recombinação .

Linhagens bacterianas selecionadas para mutagênese

Para este estudo foi selecionada uma linhagem selvagem virulenta de S. entérica, da sorovariedade Typhimurium (662ST) .

As amostras selecionadas foram estocadas em glicerol 2,5 M, segundo protocolo descrito por Sambrook e Russell (2001) e incorporado aqui, por referência, em sua totalidade .

Teste de sensibilidade das linhagens de S. entérica Typhimurium a antibióticos

A susceptibilidade das linhagens selecionadas foi testada para os antibióticos ampicilina, canamicina, cloramphenicol , estreptomicina e tetraciclina . Para isso, foi utilizado o método de microdiluição .

Neste teste foi possível observar uma Concentração Inibitória Mínima (MIC) inferior a 10ug/mL para os antibióticos ampicilina, cloranfenicol, estreptomicina e tetraciclina e MIC num intervalo de 10-25 g/mL para canamicina. Este teste indicou que plasmídeos com marcas de resistência a ampicilina e ao cloranfenicol podem ser utilizados .

Sistema utilizado para mutagênese

A mutagênese dos genes hupA e hupB foi obtida pelo sistema λ Red conforme descrito por Datsenko e anner (2000) e incorporada aqui, em sua totalidade, por referência. Este sistema é constituído das linhagens e plasmídeos demonstrados na Tabela 1.

Tabela 1 - Linhagens bacterianas com seus respectivos plasmídeos pertencentes ao sistema λ Red.

Extração e purificação de plasmídeos

Do estoque à -80°C foi retirada uma amostra de cada cepa contendo os plasmideos. A linhagem BW25113/pKD46 foi semeada em meio LB ágar contendo ampicilina (100ug/mL) ; BW25141/pKD3 e BT340/pCP20 foram semeadas em meio LB ágar contendo ampicilina (100ug/mL) e cloranfenicol (25μg/mL) .

Para extração e purificação dos plasmideos pKD46 e pCP20, a temperatura de incubação utilizada foi 30° C, uma vez que tais plasmideos contêm origem de replicação termo- sensivel. Após a extração, os mesmos foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 0,8% segundo o protocolo de Sambrook e Russell (2001) , incorporada aqui, por referência, em sua totalidade.

Iniciadores utilizados para gerar os cassetes de recombinação

Os iniciadores para essa metodologia são compostos de 2 partes continuas, sendo a primeira uma sequência de aproximadamente 40 bases homólogas ao gene alvo e a segunda 20 bases homólogas a uma região presente no plasmideo pKD3.

A região utilizada para amplificar a sequência contida no plasmideo foi selecionada através do programa Primer 3 (http : //frodo . wi .mit . edu/cgi-bin/primer3/primer3_www . cgi) , baseado na sequência do plasmideo pKD3 (AY048742) (Datsenko e Wanner, 2001) . Desse modo, foram desenhados os iniciadores hupA-f , hupA-r , hupB-f e hupB-r, descritos na Tabela 2.

Tabela 2. Iniciadores utilizados na construção do cassete de recombinação

Construção do cassete de recombinação por PCR

Para a construção do cassete de recombinação foram utilizados os iniciadores descritos anteriormente, para a amplificação de uma região do plasmideo pKD3. As reações foram realizadas em volume final de 50 iL contendo 20 pmol de cada iniciador, 20 a 30 ng de DNA plasmidial, lmM de cada dNTP, 2U de Taq DNA polimerase e 2 mM de MgCl ₂ em tampão apropriado provido com a enzima.

Para a reação de PCR, o DNA plasmidial foi desnaturado por aquecimento a 94° C por 2 minutos, e a amplificação realizada em 30 ciclos constituída dos seguintes passos: (1) denaturação a 94° C por 30 segundos; (2) "anelamento" a 56° C por 30 segundos; (3) extensão a 72° C por 1 minuto e 30 segundos. Procedeu-se uma extensão final por 5 minutos. O produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1% (Sambrook e Russell, 2001) .

Assim, os primers hupA-f, hupA-r, hupB-f e hupB-r foram utilizados para amplificar uma região de aproximadamente 1,2 Kbp (Figura 1) do plasmídeo pKD3. A região amplificada foi utilizada para compor o cassete de recombinação com os genes hupA e hupB, respectivamente. Para fins ilustrativos, demonstra-se na figura 1 o cassete de recombinação gerado por PCR utilizando os primers hupA-f e hupA-r.

Sequenciamento de nucleotideos

O sequenciamento de nucleotideos foi realizado conforme protocolos padrões. Os resultados são apresentados abaixo.

Sobreposição do sequenciamento do duplo mutante AhupAAhupB com os primers hupBDT "forward" e "reverse": TCGTACTTCGAAGGATTCAGGTGCGATATAAATTATAAAGAGGAAGAGAAGAGTGAATA AAGTGTAGGC GGAGC GC TCGAAGTTCCTATACTTTCTAGAGAATAGGAACTTCGGA

ArAGGAACTAAGGAGGATATTCATATGGCGGTAAACTAAGCGTGATCCCCTCGGGGG AT GTGACAAAGTACAAGGGCGCATCAAC (SEQ IP No. 1)

A sobreposição das bases sequenciadas a partir dos primers hupBDT f e r (sublinhados) condizem a regiões flanqueadoras do gene hupB, não mais existente na linhagem duplo recombinante AhupAAhupB, conforme confirmado pela presença de uma cicatriz do plasmidio pKD3 no lugar desse gene (Box cinza) .

Duplo mutante AhupAAhupB sequenciado com primer hupADT2f:

GGCTCAGGGCAGACCTGCGCGAGGCTGGCGAGAGCA-TATCGGTATAAATTTTCAGCAA TGACACCAGAAAACGTGATTTACGTCTGATTTGTCGTGCCATAAGGCTTCCCTTATGCC CCCCGTCTGGTCTACATTTGGGAGGC-AAAAAAAGTGGCTATCGGTGCGTGTATGCAGG AGAGTGCTTTTCTGGCATTTCC-TCGCACTC-ATGCTTAGCAAGCGATAAACACATTGT AAGGATAACTTATGAACAAGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGAAGTTCCTATACTTTC A GAGAATAGGAACTTCGGAATAGGAACTTCATTTAAATGGCGCGCCTTACGCCCCGCCCT GCCACTCATCGCAGTACTGTTGTAATTCATTAAGCATTCTGCCGACATGGAAGCCATCA CAAACGGCATGATGAACCTGAATCGCCAGCGGCATCAGCACCTTGTCGCCTTGCGTATA ATATTTGCCCATGGTGAAAACGGGGGCGAAGAAGTTGTCCATATTGGCCACGTTTAAAT CAAAACTGGTGAAACTCACCCAGGGATTGGCTGAGACGAAAAACATATTCTCAATAAAC CCTTTAGGGAAATAGGCCAGGTTTTCACCGTAACACGCCACATCTTGCGAATATATGTG TAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTCAGTTT GCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCACCGTCT TTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAGATG-GAATAA-GC CG-ATAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGTCTTAAAAGGCGTATATCA (SEQ ID No. 2) Neste caso a sequência é maior, pois no local do gene hupA foi inserido o gene cat e regiões plasmidiais flanqueadoras (~1,2 kb) . No box cinza, está destacada a sequência correspondente à região flanqueadora ao gene hupA de Salmonella, que logo em seguida é interrompida por sequências presentes no plasmidio pKD3, correspondentes ao PI e ao gene cat. Os traços simbolizam bases não identificadas no sequenciamento .

Duplo mutante ÁhupAAhupB sequenciado com o primer hupADT2r (sequência complementar e invertida) :

CAAACCCTTTAGG-AAATAGGCCAGGTTT-CACCGTAACACG—ACATCTTGCGAATAT ATGTGTAGAAACTGCCGGAAATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATGAAAACGTTTC AGTTTGCTCATGGAAAACGGTGTAACAAGGGTGAACACTATCCCATATCACCAGCTCAC CGTCTTTCATTGCCATACGTAATTCCGGATGAGCATTCATCAGGCGGGCAAGAATGTGA ATAAAGGCCGGATAAAACTTGTGCTTATTTTTCTTTACGGTCTTTAAAAAGGCCGTAAT ATCCAGCTGAACGGTCTGGTTATAGGTACATTGAGCAACTGACTGAAATGCCTCAAAAT GTTCTTTACGATGCCATTGGGATATATCAACGGTGGTATATCCAGTGATTTTTTTCTCC ATTTTAGCTTCCTTAGCTCCTGAAAATCTCGACAACTCAAAAAATACGCCCGGTAGTGA TCTTATTTCATTATGGTGAAAGTTGGAACCTCTTACGTGCCGATCAACGTCTCATTTTC GCCAAAAGTTGGCCCAGGGCTTCCCGGTATCAACAGGGACACCAGGATTTATTTATTCT GCGAAGTGATCTTCTGTC-CAGGTAGGCGCGCCGAAGTTCCTATAC (SEQ ID No 3) .

Nesse sequenciamento foram detectadas apenas bases referentes ao plasmidio pKD3, já que o inicio e o final da sequência apresentaram baixa qualidade no eletroferograma e por isso foram desconsideradas. As regiões de alinhamento com o plasmidio correspondem a uma região do gene cat

(nucleotideos 263 a 993 do plasmidio) .

Transformação das linhagens de S. entérica Typhimurium com o plasmídeo pKD46

A transformação das linhagens selecionadas com o plasmídeo pKD46 foi realizada por eletroporação, seguindo protocolo descrito em Ausubel et al. (2007), incorporado aqui, por referência, em sua totalidade.

O eletroporador (Eletroporador Bio Rad. Gene Pulser

II, Hercules - CA, USA) foi ajustado para 1,5 KV, 25 \iF e

200 ohms e cubetas de 0,1 cm foram utilizadas. As amostras foram eletroporadas então incubadas por 1 hora em meio SOC. Posteriormente as culturas foram plaqueadas em meio LB ágar provido de ampicilina (100 g/mL) e incubadas -à 30°C durante a noite.

A presença do plasmídeo foi avaliada pela análise do perfil plasmidial por eletroforese em gel de agarose. As linhagens selecionadas foram estocadas em glicerol 2,5 M segundo protocolo proposto por Sambrook e Russell (2001) .

Troca alélica dos genes hupA e hupB pelo cassete de recombinação

Para a etapa de recombinação gênica foi utilizada a linhagem 662ST/pKD46, como descrito anteriormente, e o cassete de recombinação gerado por PCR.

O preparo das células competentes foi feito partindo- se de um pré-inóculo com 5 mL de meio LB provido de ampicilina (100 pg/mL) , que foi incubado durante a noite à 30 °C. Desta cultura 0,5 mL foram inoculados em 50 mL de meio LB com o mesmo antibiótico e lmM de L-arabinose (Sigma) , usado como indutor da expressão dos genes γ, β, e exo, sendo esta nova cultura crescida à 30 °C sob agitação (150 rpm) até atingir ϋ.Οεοο de 0,7. Os frascos foram resfriados em banho de gelo por 15 minutos e as culturas foram centrifugadas por 10 minutos à 5000 g (4 ^o C) . O precipitado foi ressuspendido em 4 mL de água deionizada esterilizada previamente resfriada a 4 °C e centrifugado novamente nas mesmas condições. Esta etapa de lavagem foi repetida três vezes utilizando-se glicerol 10% e o sedimento formado após a última lavagem foi ressuspendido em 400 L e distribuído em alíquotas de 90 μL pelo protocolo de Sambrook e Russell (2001) e incorporado aqui, por referência, em sua totalidade.

Foram selecionados três tubos contendo as alíquotas aos quais foram adicionados 10 μL do produto gerado pela PCR; esses foram colocados em gelo por 1 minuto. O eletroporador foi ajustado para 1,5 KV, 25 \iF e 200 ohms e as amostras eletroporadas e recolhidas em meio SOC, onde foram incubadas à 37° C por 1 hora e depois plaqueadas em meio LB-ágar com cloranfenicol (25 g/mL) . As culturas foram incubadas durante a noite à 37 °C. Das colónias crescidas, foram selecionadas algumas para a confirmação por PCR, sendo denominadas 662STÁhupACm ^R e 662STAhupBCm ^R . As colónias selecionadas foram estocadas em glicerol 2,5 M segundo protocolo proposto por Sambrook e Russell (2001) , e incorporado aqui, por referência, em sua totalidade. Em seguida, o plasmidio pKD46 foi curado.

Eliminação do gene cat de resistência ao antibiótico

Para a eliminação do gene de resistência ao antibiótico, foram utilizadas células competentes preparadas das linhagens 662STAhupACm ^R e 662STAhupSCm ^R e o plasmideo pCP20. A eletroporação foi feita conforme descrito anteriormente e os transformantes foram selecionados em placas de LB-ágar com ampicilina (100 μg/mL) . As placas foram incubadas durante a noite à 30 ° C. Algumas das colónias crescidas foram selecionadas para confirmação por PCR e denominadas 662STàhupA e 662STAhupB. Estas linhagens foram estocadas em glicerol 2,5M como descrito anteriormente por Sambrook e Russell (2001) e incorporado aqui, por referência, em sua totalidade. Detecção e caracterização das mutações em hupA e hupB por PCR

Detecção do gene cat

O gene cat (chloramphenicol acetyl transferase) nos mutantes de S. entérica foi inicialmente detectado por PCR. Foi desenhado um par de iniciadores internos a este gene, tendo-se como base a seguência do plasmideo pKD3 (AY048742) (Datsenko e Wanner, 2001) e constituinte do cassete de recombinação. Estes foram desenhados com o software Primer 3 (http : 111rodo . i .mit . edu/cgi-bin/primer3/primer3_www . cgi) . Os iniciadores estão demonstrados na Tabela 3.

Tabela 3 - Sequência dos iniciadores utilizados para detecção do gene cat

* Estes primers já constaram de vima publicação.

As reações foram realizadas em volume final de 50 ]iL contendo 20 pmol de cada iniciador, 20 a 30 ng de DNA genômico de cada transformante, lmM de cada dNTP, 2U de Taq DNA polimerase e 2 mM de MgCl ₂ em tampão apropriado provido com a enzima. Para a reação de PCR, o DNA genômico foi desnaturado por aquecimento a 94 °C por 2 minutos e a amplificação realizada em 35 ciclos constituída dos seguintes passos: (1) denaturação a 94 °C por 30 segundos; (2) "anelamento" a 55 °C por 30 segundos; (3) extensão a 72 °C por 1 minuto. Procedeu-se uma extensão final por 5 minutos. O produto da PCR foi analisado por eletroforese em gel de agarose 1% utilizado o protocolo descrito por Sambrook e Russell (2001) , incorporado aqui, por referência, em sua totalidade.

Detecção das mutações por iniciadores externos aos genes hupA e upB

Foram construídos dois pares de iniciadores externos aos genes hupA e um par a hupB para a detecção das mutagêneses (Tabela 4) . Esses foram desenhados com o auxílio do software Primer 3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi- bin/primer3/primer3_www. cgi) , baseado na sequência de S. entérica Typhimurium LT2 (NC_003197) .

Tabela 4 - Sequência dos iniciadores externos aos genes hupA e hupB

Primers Sequência (5' -3')

upADTl-f AGTGCTTTTCTGGCATTTCC

(SEQ ID 4) hupJJDTl-r ACAGACAAAAGGGGCTGATG

(SEQ ID 5)

hupADT2-f CGACTGCGAAGAACGTGATA

(SEQ ID 6)

hupADT2-r AAAGCCGCTGGCAGTAAAC

(SEQ ID 7)

hupEDT-f TCGTACTTCGAAGGATTCAGG

(SEQ ID 8)

upBDT-r GTTGATGCGCCCTTGTACTT

(SEQ ID 9)

Transdução com bacteriófago P22

A seleção de recombinantes de . S. entérica por eletroporaçao muitas vezes seleciona. linhagens contendo LPS (lipopolissacarideos) incompletos, já que estes são mais facilmente transformáveis, mas são mais sensíveis ao sistema imune e muitas vezes incapazes de estabelecer uma infecção sistémica em camundongos.

Para realizar a transdução a bactéria recombinante doadora foi cultivada em 3 ml de LB sem antibiótico durante a noite a 37 °C. No dia seguinte, uma alíquota de 100 μ1_ do fago foi adicionada a 900 μΐ, de LB fresco, atingindo a densidade de aproximadamente IO ⁹ UFC/mL. Essa alíquota de 1 ml foi adicionada ao pré-inóculo cultivado, com uma densidade bacteriana de aproximadamente IO ⁹ UFC/mL.

A cultura foi então novamente cultivada na estufa a 37 °C durante a noite. Nesse mesmo dia, a linhagem selvagem 662ST também foi cultivada em 3 ml de LB na estufa a 37 °C durante a noite. Como controle, o bacteriófago foi plaqueado em LB Ágar, para verificação de contaminação bacteriana .

No terceiro dia, a cultura com a bactéria doadora e o fago foi centrifugada a 5000 g por 10 minutos a 4 °C, para que as bactérias sedimentassem, separando-se do fago. Para garantir o isolamento de fagos e bactérias, o sobrenadante foi cuidadosamente filtrado e armazenado em um novo recipiente. Como controle o sobrenadante foi estriado em LB Ágar para verificar se não houve resquício de bactérias.

Alíquotas de fagos e bactérias selvagens receptoras foram misturadas, seguindo-se as seguintes proporções: 10 μΐ de fago + 100 μΐ de bactéria; 50 μΐ de fago + 100 μΐ de bactéria; 50 μΐ de fago + 50 μΐ de bactéria e 10 μΐ de fago + 50 μΐ de bactéria. Os recipientes contendo fagos e bactérias foram incubados a 37 °C por 20 minutos para a adsorção. Após esse período, as alíquotas foram plaqueadas em LB Ágar com cloranfenicol para a seleção das bactérias transduzidas . No dia seguinte, as colónias crescidas foram repicadas para os meios seletivos SS, MacConkey com cloranfenicol e novamente para LB com cloranfenicol e novo PCR de confirmação com os primers Cmdt e hupAdt ou hupBdt foi realizado.

Caracterização dos mutantes AhupA, AhupB e AhupAÁhupB de S. entérica

Curva de crescimento in vitro

As linhagens recombinantes foram inoculadas em 5 mL de meio LB e incubadas à 37 °C durante a noite. No dia seguinte, 500 μ]_. do pré-inóculo foi adicionado à 50 mL de meio LB 1% glicose e a nova cultura incubada à 37 °C sob agitação (150 rpm) , sendo retiradas aliquotas a cada hora, durante cinco horas e diluições seriadas foram plaqueadas em triplicata sobre LB-ágar para contabilização no dia seguinte .

A comparação das curvas exibidas pelas linhagens apresentou algumas diferenças no crescimento.

Determinação da Dose Letal Média (DL ₅₀ ) por via oral em Camundongos

Para determinação da DL ₅₀ por via oral, as linhagens 662ST, 662STAhupA, 662STAhupB e 662STbhupAàhupB foram cultivadas em meio LB a 37°C durante a noite. No dia seguinte, 0,5 mL dessas culturas foram inoculados em 50 mL de meio LB-glicose 1% e incubado a 37°C sob agitação (150rpm) até que atingissem o título desejado. As células foram sedimentadas por centrifugação (5000g por 5 min) e lavadas no mesmo volume de tampão salina-fosfato (PBS, pH 7,4) . Este passo foi repetido uma segunda vez e o sedimento ressuspendido em PBS (mesmo volume inicial) . Diluições seriadas foram preparadas em PBS e usadas para infectar camundongos BALB/c fêmeas com 6 a 8 semanas. As diluições foram plaqueadas em meio LB-ágar para a determinação da UFC. O inoculo via oral foi feito utilizando agulha de gavagem modelo IC800 (INSIGHT, Ribeirão Preto-SP, Brasil) .

A quantidade de bactérias inoculadas variou de acordo com cada grupo, de IO ² à IO ⁹ UFC/mL, sendo utilizados três camundongos por diluição. Os animais foram acompanhados por 30 dias após a administração do inoculo.

Os valores de DL ₅ o por via oral em camundongos BALB/c foram calculados pelo método "Moving Average Interpolation" (Welkos e 0 ^' Brien, 1994) .

Tabela 5 - DL ₅₀ de linhagens de S. entérica inoculadas por via oral em camundongos BALB/c

Linhagem DL ₅₀ (CFU.mL- ¹ ) Referência

662ST 1,5 x IO ⁴ Presente invenção 662STAhupA 3,2 x 10' Presente invenção

662STàhupB 3,5 x 10 Presente invenção

662STAhupAÁhupB > IO ⁸ Presente invenção

É importante salientar que de experimento para experimento existe alguma variação nos valores de DL50, uma vez que este é um experimento que envolve várias variáveis biológicas .

Desafio via oral

A capacidade de desencadear resposta imune contra S. entérica foi testada em dois momentos: No primeiro, os animais foram imunizados com uma única dose de S. entérica e desafiados 28 dias após a mesma.

Em. um segundo experimento, animais foram imunizados oralmente com duas doses da linhagem duplo mutante nos dias 0 e 14 e desafiados com a linhagem selvagem no 30° dia após a segunda dose. Os experimentos posteriores de desafio prosseguiram para a linhagem duplo mutante, já qμe esta apresentou os resultados mais promissores.

A dose (UFC) utilizada foi de IO ⁸ para a linhagem duplo mutante, dose esta estabelecida a partir dos ensaios prévios. Os animais foram desafiados com doses de IO ⁷ CFU de linhagem ST662.

Para estes experimentos foram utilizados 7 camundongos BALB/c fêmeas com 6 a 8 semanas de idade por grupo. Os animais foram acompanhados por 30 dias após o desafio e avaliados quanto à sua sobrevivência.

Nas imunizações duplas com 662STÁhupAÁhupB todos os animais sobreviveram ao desafio com a linhagem selvagem enquanto que o grupo com imunização única apresentou uma taxa de 85% após 30 dias de experimento. Os animais do grupo placebo, inoculados com PBS, morreram entre o 5° e o 10° dia após serem desafiados com as linhagens selvagens. Algumas variações na taxa de sobrevivência dos camundongos com imunização dose única foram observadas entre diferentes experimentos.

Como pode ser observada, a presente invenção possibilita o uso de um vetor vacinai vivo para o desenvolvimento de vacinas contra a salmonelose e outras doenças, com propriedades imunogênicas próprias, já que as linhagens atenuadas desenvolvidas podem ser empregadas na entrega de antigenos heterólogos ao sistema imune do hospedeiro .

Adicionalmente, a presente invenção possibilita a utilização como vacina viva para induzir proteção contra salmonelose; um potencial uso como vetor vacinai multifatorial , ou seja, as linhagens atenuadas podem expressar antigenos de outras doenças; alem da utilização na terapia contra o câncer.

Salmonella entérica vem sendo utilizada como agente biológico no tratamento de alguns tipos de tumores sólidos. Isso porque esta bactéria apresenta tropismo para massas tumorais. O tratamento de diferentes tumores com S. entérica tem resultado em diminuição ou mesmo desaparecimento da massa tumoral . No entanto, para este tipo de emprego, a linhagem deve ser atenuada. Assim, as linhagens mutantes desenvolvidas da presente invenção apresentam o potencial de serem utilizadas na terapia de tumores. No entanto, estudos específicos são necessários para verificar este potencial e indicar outras modificações nas linhagens de S. entérica que eventualmente sejam necessárias .

A linhagem duplo mutante ( 662S AhupAAhupB) ainda apresenta a vantagem adicional de menor probabilidade de reversão da atenuação para os níveis de patogenicidade da linhagem selvagem, já que dois genes foram nocauteados. Essa vantagem não está presente em linhagens com mutação única, já que a reaquisição do gene perdido poderia recuperar a virulência total da linhagem.

A presente invenção tem utilização como vacina viva para induzir proteção contra salmonelose ou como potencial uso como vetor vacinai multifatorial, ou seja, as linhagens atenuadas podem expressar antígenos de outros patógenos.

Adicionalmente a presente invenção pode ser utilizada na terapia contra o câncer. Salihonella entérica vem sendo utilizada como agente biológico no tratamento de alguns tipos de tumores sólidos. Isso porque esta bactéria apresenta tropismo para massas tumorais. O tratamento de diferentes tumores com S. entérica tem resultado em diminuição ou mesmo desaparecimento da massa tumoral . No entanto, para este tipo de emprego, a linhagem deve ser atenuada. Assim, as linhagens mutantes desenvolvidas da presente invenção apresentam o potencial de serem utilizadas na terapia de tumores.

Assim, embora tenham sido mostradas apenas algumas modalidades da presente invenção, será entendido que várias omissões, substituições e alterações no processo de construção da linhagem atenuada de Salmonella entérica podem ser feitas por um técnico versado no assunto, sem se afastar do espirito e escopo da presente invenção.

É expressamente previsto que todas as combinações dos elementos que desempenham a mesma função substancialmente da mesma forma para alcançar os mesmos resultados estão dentro do escopo da invenção. Substituições de elementos de uma modalidade descrita para outro são também totalmente pretendidos e contemplados. Também é preciso entender que. os desenhos não estão necessariamente em escala, mas que eles são apenas de natureza conceituai. A intenção é, portanto, ser limitada, tal como indicado pelo escopo das reivindicações anexas. Referências

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