Aus [1] bis [4] sind Verfahren zum Erfassen von DNA-Molekülen bekannt, bei denen zur Erfassung Biosensoren eingesetzt werden, die auf Elektrodenanordnungen basieren.

Fig. 2a und Fig. 2b zeigen einen solchen Sensor, wie er in [1] und [4] beschrieben ist. Der Sensor 200 weist zwei Elektroden 201,202 aus Gold auf, die in einer Isolatorschicht 203 aus Isolatormaterial eingebettet sind. An die Elektroden 201,202 sind Elektroden-Anschlüsse 204,205 angeschlossen, an denen das an der Elektrode 201,202 anliegende elektrische Potential zugeführt werden kann. Die Elektroden 201,202 sind als Planarelektroden angeordnet. Auf jeder Elektrode 201,202 sind DNA-Sondenmoleküle 206 immobilisiert (vgl. Fig. 2a). Die Immobilisierung erfolgt gemäß der sogenannten Gold-Schwefel- Kopplung. Auf den Elektroden 201,202 ist der zu untersuchende Analyt, beispielsweise ein Elektrolyt 207, aufgebracht.

Sind in dem Elektrolyt 207 DNA-Stränge 208 mit einer Sequenz enthalten, die zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 206 komplementär ist, so hybridisieren diese DNA-Stränge 208 mit den DNA-Sondenmolekülen 206 (vgl. Fig. 2b).

Eine Hybridisierung eines DNA-Sondenmoleküls 206 und eines DNA-Strangs 208 findet nur dann statt, wenn die Sequenzen des jeweiligen DNA-Sondenmoleküls 206 und des entsprechenden DNA- Strangs 208 zueinander komplementär sind. Ist dies nicht der Fall, so findet keine Hybridisierung statt. Somit ist ein DNA-Sondenmolekül einer vorgegebenen Sequenz jeweils nur in der Lage einen bestimmten, nämlich den DNA-Strang mit jeweils komplementärer Sequenz zu binden, d. h. mit ihm zu hybridisieren.

Findet eine Hybridisierung statt, so verändert sich, wie aus Fig. 2b ersichtlich, die Kapazität zwischen den Elektroden.

Diese Änderung der Kapazität wird als Messgröße für die Erfassung von DNA-Molekülen herangezogen.

Aus [5] ist eine weitere Vorgehensweise für die Untersuchung des Elektrolyts auf die Existenz eines DNA-Strangs mit vorgegebener Sequenz bekannt. Bei dieser Vorgehensweise werden die DNA-Stränge der gewünschten Sequenz mit einem Fluoreszenz-Farbstoff markiert und deren Existenz wird anhand der Reflexionseigenschaften der markierten Moleküle bestimmt.

Hierzu wird Licht im sichtbaren Wellenlängenbereich auf den Elektrolyten gestrahlt und es wird das von dem Elektrolyten, insbesondere von dem nachzuweisenden markierten DNA-Strang, reflektierte Licht erfasst. Aufgrund des Reflexionsverhaltens, d. h. insbesondere aufgrund der erfassten, reflektierten Lichtstrahlen wird bestimmt, ob der nachzuweisende DNA-Strang mit der entsprechend vorgegebenen Sequenz in dem Elektrolyten enthalten ist oder nicht.

Diese Vorgehensweise ist sehr aufwendig, da eine sehr genau Kenntnis über das Reflexionsverhalten des entsprechenden DNA- Strangs erforderlich ist und weiterhin eine Markierung der DNA-Stränge vor Beginn des Verfahrens notwendig ist.

Weiterhin ist eine sehr genaue Justierung des Erfassungsmittels zum Erfassen der reflektierten Lichtstrahlen erforderlich, damit die reflektierten Lichtstrahlen überhaupt erfasst werden können. Somit ist diese Vorgehensweise teuer, kompliziert sowie gegen Störeinflüsse sehr empfindlich, wodurch das Messergebnis sehr leicht verfälscht werden kann.

Ferner ist es aus der Affinitätschromatographie (vgl. [6]) bekannt, immobilisierte niedermolekulare Moleküle, insbesondere Liganden hoher Spezifität und Affinität, zu verwenden, um Peptide und Proteine, z. B. Enzyme, im Analyt spezifisch zu binden.

Ferner ist ebenfalls bekannt, dass bei Nachweisverfahren für Antigene oder Antikörper wie den sogenannten ELISA-Tests, die auf Festphasensystemen beruhen, einer der beiden Reaktionspartner an eine feste Phase (z. B. Mikrotiterplatten) gebunden wird. Die erfolgte Antikörper-Antigen-Reaktion wird durch einen markierten Reaktionspartner nachgewiesen (vgl.

[7]). Genauer gesagt wird in einem solchen Antikörper- Einfang-Test zunächst das Antigen an einen festen Träger gebunden. Danach reagiert ein markierter, sich in einer Lösung befindender Antikörper mit dem Antigen. Nach dem Auswaschen des ungebundenen Antikörpers erhält man eine qualitative oder quantitative Aussage durch Messen der Markierung am gebundenen Antikörper (vgl. [8] und [9]).

Weiterhin ist ein Reduktions-/Oxidations-Recycling-Verfahren zum Erfassen makromolekularer Biopolymere aus [2] und [3] bekannt.

Das Reduktions-/Oxidations-Recycling-Verfahren, im weiteren auch als Redox-Recycling-Verfahren bezeichnet, wird im weiteren anhand der Fig. 4a bis Fig. 4c näher erläutert.

Fig. 4a zeigt einen Biosensor 400 mit einer ersten Elektrode 401 und einer zweiten Elektrode 402, die auf einem Substrat 403 als Isolatorschicht aufgebracht sind.

Auf der ersten Elektrode 401 aus Gold ist ein Haltebereich, ausgestaltet als Halteschicht 404, aufgebracht. Der Haltebereich dient zum Immobilisieren von DNA-Sondenmolekülen 405 auf der ersten Elektrode 401.

Auf der zweiten Elektrode ist kein solcher Haltebereich vorgesehen.

Sollen mittels des Biosensors 400 DNA-Stränge mit einer Sequenz erfasst werden, die komplementär zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 405 ist, so wird der Sensor 400 mit einer zu untersuchenden Lösung 406, z. B. einem Elektrolyten, derart in Kontakt gebracht, dass in der zu untersuchenden Lösung 406 eventuell enthaltene DNA-Stränge mit der komplementären Sequenz zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle 405 hybridisieren können.

Fig. 4b zeigt den Fall, dass in der zu untersuchenden Lösung 406 die zu erfassenden DNA-Stränge 407 enthalten sind und an die DNA-Sondenmoleküle 405 hybridisiert sind.

Die DNA-Stränge 407 in der zu untersuchenden Lösung sind mit einem Enzym 408 markiert, mit dem es möglich ist, im weiteren beschriebene Moleküle in Teilmoleküle zu spalten.

Üblicherweise ist eine erheblich größere Anzahl von DNA- Sondenmolekülen 405 vorgesehen, als zu ermittelnde DNA- Stränge 407 in der zu untersuchenden Lösung 406 enthalten sind.

Nachdem die in der zu untersuchenden Lösung 406 eventuell enthaltenen DNA-Stränge 407 mit dem Enzym 408 mit den immobilisierten DNA-Sondenmolekülen hybridisiert haben, erfolgt eine Spülung des Biosensors 400, wodurch die nicht hybridisierten DNA-Stränge entfernt werden und der Biosensor 400 von der zu untersuchenden Lösung 406 gereinigt wird.

Dieser zur Spülung verwendeten Spüllösung oder in einer weiteren Phase eigens zugeführten weiteren Lösung 412 wird eine elektrisch ungeladene Substanz beigegeben, die Moleküle enthält, die durch das Enzym an den hybridisierten DNA- Strängen 407 in ein erstes Teilmolekül einer negativen ersten elektrischen Ladung und in ein zweites Teilmolekül einer positiven zweiten elektrischen Ladung gespalten werden können.

Die negativ geladenen Teilmoleküle werden, wie in Fig. 4c gezeigt ist, zu der positiv geladenen Anode gezogen, wie durch den Pfeil 411 in Fig. 4c angedeutet ist.

Die negativ geladenen ersten Teilmoleküle 410 werden an der ersten Elektrode 401, die als Anode ein positives elektrisches Potential aufweist, oxidiert und werden als oxidierte Teilmoleküle 413 an die negativ geladene Katode, d. h. die zweite Elektrode 402 gezogen, wo sie wieder reduziert werden.

Die reduzierten Teilmoleküle 414 wiederum wandern zu der ersten Elektrode 401, d. h. zu der Anode.

Auf diese Weise wird ein elektrischer Kreisstrom generiert, der proportional ist zu der Anzahl der jeweils durch die Enzyme 408 erzeugten Ladungsträger.

Der elektrische Parameter, der bei dieser Methode ausgewertet <BR> <BR> dI<BR> <BR> wird, ist die Änderung des elektrischen Stroms als dt Funktion der Zeit t, wie dies in dem Diagramm 500 in Fig. 5 dargestellt ist.

Die vorstehend genannten Verfahren zur Erfassung von makromolekularen Biopolymeren haben gemeinsam, dass vor der Durchführung des eigentlichen Nachweisverfahrens die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere markiert werden.

Dies ist nicht nur aufwendig und z. B. mit der Gefahr verbunden, dass z. B. ein Teil der zu untersuchenden Probe verloren gehen kann, oder dass die Markierung nicht quantitativ verläuft, sondern kann auch andere Nachteile mit sich bringen kann. So können im Fall von mit Fluoreszenz- Farbstoffen markierten DNA-Molekülen die Fluoreszenzmarker beispielsweise die Beweglichkeit der DNA-Moleküle reduzieren und so den Nachweisprozess verlangsamen.

Aus [15] ist darüber hinaus ein Verfahren zum Screening von Target-Liganden-Wechselwirkungen unter Verwendung einer chemischen Bibliothek von Liganden bekannt, bei dem zumindest eine Fluoreszenzeigenschaft einer an einer Festphase immobilisierten chemischen Bibliothek von Liganden, wobei an jeden Liganden ein molekularer Fluoreszenzsensor gebunden ist, vor und nach Zugabe des Targets gemessen wird.

Ferner ist aus [16] ein in situ Hybridisierungsverfahren bekannt, mit dem Transkriptionsprodukte von Proteinen der Knochenmatrix in Mausgewebezellen nachgewiesen wurden.

Des weiteren ist aus [17] ist eine selbst-addressierbare mikroelektronische Vorrichtung bekannt, die so gestaltet ist, dass sie aktiv molekularbiologische mehrschrittige Reaktionen und Multiplex-Reaktionen in mikroskopischen Formaten ausführen kann.

Aus [18] schließlich ist ein z. B. in der biochemischen oder pharmazeutischen Forschung einsetzbares Erkennungssystem bekannt, das mindestens eine immobilisierte Bindungskomponente A mit einer mindestens einer Bindestelle für eine Erkennungsspezie B sowie mindestens eine Erkennungsspezie B, die an die Bindungskomponente A binden kann, aufweist.

Der Erfindung liegt das Problem zugrunde, ein alternatives Verfahren und eine Vorrichtung für die Erfassung von makromolekularen Biopolymeren bereitzustellen.

Das Problem wird durch das Verfahren und die Vorrichtung mit den Merkmalen gemäß den unabhängigen Patentansprüchen gelöst.

Bei diesem Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren wird mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren eingesetzt.

Dabei wird die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren (zuerst) mit Fängermolekülen versehen, wobei die Fängermoleküle zum einen makromolekulare Biopolymere binden können, und zum anderen eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares Signal erzeugen kann. Bei dem Verfahren wird danach eine zu untersuchende Probe mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren in Kontakt gebracht, wobei die zu untersuchende Probe die zu erfassenden makromolekularen Biopolymere enthalten kann. Danach werden in der zu untersuchenden Probe enthaltene makromolekulare Biopolymere an den Fängermolekülen gebunden. Anschließend werden Fängermoleküle, an die keine zu erfassenden makromolekularen Biopolymere gebunden haben, entfernt und die makromolekularen Biopolymere mittels der Markierung erfasst.

Einfach ausgedrückt beruht das vorliegende Verfahren auf der Erkenntnis, dass nicht, wie bisher, die zu erfassenden makromolekulare Biopolymere mit einer Markierung versehen werden, sondern, dass die Fängermoleküle vor der Immobilisierung mit einer Markierung versehen werden. Dies hat den Vorteil, dass die zu untersuchende Probe nicht mehr einer Markierungsreaktion unterworfen werden muss, bei der möglicherweise ein Teil der Probe oder eventuell die gesamte Probe verloren geht oder bei der Markierung nicht vollständig abläuft.

Die hier offenbarte Vorrichtung zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren weist mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren und eine eine Erfassungseinheit auf. Bei der Vorrichtung ist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit Fängermolekülen versehen ist, wobei die Fängermoleküle makromolekulare Biopolymere binden können, und wobei die Fängermoleküle eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares Signal erzeugen kann. Die Erfassungseinheit ist bei der Vorrichtung derart ausgestaltet, dass sie makromolekulare Biopolymere, die an die Fängermoleküle gebunden haben, mittels der Markierung erfasst.

In einer Ausführungsform weist die Vorrichtung mehrere Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren in einer regelmäßigen Anordnung (einem Array) auf. Vorzugsweise ist bei der Vorrichtung die zumindest eine Einheit zum Immobilisieren oder die regelmäßige Anordnung der Einheiten auf einer CMOS-Kamera oder einem CCD aufgebracht.

Bei dem hier beschriebenen Verfahren wird durch die Markierung ein Signal erzeugt. In einer Ausgestaltung ist ein solches Signal ein elektrischer Strom. In einer weiteren Ausgestaltung ist das Signal sichtbares Licht oder UV-Licht.

Das Signal kann auch aus radioaktiver Strahlung oder Röntgenlicht bestehen.

Daraus wird ersichtlich, dass bei dem Verfahren verschiedene Arten der Markierung, die nachfolgend auch als Reportergruppe bezeichnet wird, eingesetzt werden können.

Zum einen kann die Markierung eine (chemische) Verbindung oder Gruppe sein, die unmittelbar in der Lage ist, ein zur Erfassung der makromolekularen Biopolymere einsetzbares Signal erzeugen. Die Erzeugung dieses Signals kann dabei extern angeregt werden, jedoch kann die Markierung das Signal auch ohne äußere Anregung abgeben. Im erstgenannten Fall ist die Markierung beispielsweise ein Fluoreszenz-Farbstoff (Fluorophor) oder ein Chemilumineszens-Farbstoff, im zweitgenannten Fall beispielsweise ein Radioisotop.

Zum anderen kann die Markierung eine Substanz sein, die nur mittelbar ein Signal zur Erfassung der makromolekularen Biopolymere erzeugt, d. h. eine Substanz, die die Erzeugung des Signals veranlasst. Beispielsweise kann eine solche Reportergruppe ein Enzym sein, welches eine chemische Reaktion katalysiert, und die chemische Reaktion zur Erfassung der Biopolymere herangezogen wird. Beispiele für solche Enzyme sind Alkalische Phosphatase, Glutathion-S- Transferase, Superoxid-Dismutase, Meerrechtich-Peroxidase, alpha-Galaktosidase und beta-Galaktosidase. Diese Enzyme sind in der Lage, geeignete Substrate zu spalten, die farbige Endprodukte oder z. B. Verbindungen ergeben, die in dem vorstehend beschriebenen Reduktions-/Oxidations-Recycling- Verfahren eingesetzt werden können. Zu der Gruppe der Markierungen, die nur mittelbar ein zum Nachweis von makromolekularen Biopolymere einsetzbares Signal erzeugen, gehören ferner Liganden für Bindungsproteine und Substrate für Enzyme. Diese Markierung werden hier allgemein als Enzym- Liganden bezeichnet. Beispiele für solche als Markierung einsetzbare Enzym-Liganden sind Biotin, Digoxigenin oder Substrate für die oben genannten Enzyme.

Unter Erfassen wird im Sinne der Erfindung sowohl der qualitative als auch quantitative Nachweis von makromolekularen Biopolymeren in einem zu untersuchenden Analyten verstanden. Dies bedeutet, dass der Begriff "Erfassen"ebenfalls einschließt, die Abwesenheit von makromolekularen Biopolymeren im Analyten festzustellen.

Unter"Einheit zur Immobilisierung"wird im Sinne der Erfindung eine Anordnung verstanden, die eine Oberfläche aufweist, auf der die Fängermoleküle immobilisiert werden können, d. h. an die die Fängermoleküle durch physikalische oder chemische Wechselwirkungen binden können. Diese Wechselwirkungen schließen hydrophobe oder ionische (elektrostatische) Wechselwirkungen und kovalente Bindungen ein. Beispiele für geeignete Oberflächen-Materialien, die für die mindestens eine Einheit zur Immobilisierung verwendet werden können, sind Metalle wie Gold oder Silber, Kunststoffe wie Polyethylen-oder Polypropylen oder anorganische Stoffe wie Siliziumdioxid, z. B. in Form von Glas.

Ein Beispiel für eine physikalische Wechselwirkung, die eine Immobilisierung der Fängermoleküle bewirkt, ist eine Adsorption an der Oberfläche. Diese Art der Immobilisierung kann beispielsweise stattfinden, wenn das Mittel zur Immobilisierung ein Kunststoffmaterial ist, das für die Herstellung von Mikrotiterplatten verwendet wird (z. B.

Polypropylen). Allerdings ist eine kovalente Verknüpfung der Fängermoleküle an die Einheit zum Immobilisieren bevorzugt, weil dadurch die Orientierung der Fängermoleküle gesteuert werden kann. Die kovalente Verknüpfung kann über jede geeignete Verknüpfungschemie (Linker-Chemie") erfolgen.

In einer Ausgestaltung des Verfahrens ist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren auf einer Elektrode oder einer Photodiode aufgebracht.

In einer weiteren Ausgestaltung ist die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren ein Nanopartikel.

Unter einem Nanopartikel wird im Sinne der Erfindung ein Partikel verstanden, der durch sogenannte Nanostrukturierungs-Verfahren erhalten werden kann.

Nanostrukturierungs-Verfahren, die zur Erzeugung solcher Nanopartikel auf geeigneten Substraten herangezogen werden können, sind beispielsweise die in [12] und [13] beschriebene Verwendung von Block-Copolymer-Microemulsionen oder die in [14] beschriebenen Verwendung von Kolloidpartikeln als Strukturierungsmasken. Das in [14] beschriebene Verfahren ist im Prinzip analog zu einem im Bereich der Substrat- Strukturierung üblicherweise eingesetzten Lithographie- Verfahren. Daher sei hier betont, das ein Nanopartikel im Sinne der Erfindung folglich nicht auf diejenigen Partikel beschränkt ist, die durch eines der hier beispielhaft genannten Verfahren erhalten werden. Vielmehr ist ein solcher Nanopartikel jeder Partikel, dessen Durchmesser im Nanometer- Bereich liegt, d. h. allgemein im Bereich von 2 bis 50 nm, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 20 nm, besonders bevorzugt im Bereich von 5 bis 10 nm.

Eine"Einheit zur Immobilisierung, die ein Nanopartikel ist", die im folgenden auch nanopartikelförmige Einheit genannt wird, ist folglich ein oben beschriebener Nanopartikel, der eine Oberfläche aufweist, auf der die Fängermoleküle immobilisiert werden können, d. h. die Oberfläche ist so beschaffen, dass an ihr die Fängermoleküle durch physikalische oder chemische Wechselwirkungen binden können.

Diese Wechselwirkungen schließen hydrophobe oder ionische (elektrostatische) Wechselwirkungen und kovalente Bindungen ein. Beispiele für geeignete Oberflächen-Materialien, die für die mindestens eine nanopartikelförmige Einheit zur Immobilisierung verwendet werden können, sind Metalle wie Gold oder Silber, halbleitende Materialien wie Silizium, Kunststoffe wie Polyethylen-oder Polypropylen oder Siliziumdioxid, z. B. in Form von Glas. Nanopartikelförmige Einheiten aus Kunststoffen und Siliziumdioxid sind dabei durch Verwendung der in [14] beschriebenen Kolloidmasken- Verfahren erhältlich. Nanopartikelförmige Einheiten aus halbleitenden Materialien wie Silizium können beispielsweise auch durch das Stranski-Krastanov-Verfahren gebildet werden.

Durch Oxidation solcher Nanopartikel aus Silizium sind weiterhin nanopartikelförmige Einheiten aus Siliziumdioxid erhältlich.

Aufgrund der oben beschriebenen Herstellungsverfahren nehmen nanopartikelförmige Einheiten zum Immobilisieren, die auf geeigneten Substratoberflächen (Halte-Bereiche), beispielweise von Photodioden oder Elektroden, aufgebracht sind, eine regelmäßige Anordnung ein, mit Abständen voneinander im Bereich einiger 10 Nanometer, beispielsweise von ca. 10 bis 30 nm auf diesen Oberflächen. Die Art der Anordnung und der Abstand der Nanopartikel voneinander hängt ebenso wie die Größe der Nanopartikel von dem jeweiligen Verfahren zur Ausbildung der Nanopartikel ab.

Ein Vorteil bei der Verwendung von nanopartikelförmigen Einheiten zum Immobilisieren besteht darin, dass auf diesen Nanopartikeln eine genau definierte Anzahl von Fängermolekülen immobilisiert werden kann. Dies ist insbesondere bei der quantitativen Erfassung von makromolekularen Biopolymeren mittels des vorliegenden Verfahrens von Vorteil. Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung von Nanopartikeln als Einheiten zum Immobilisieren bietet sich dadurch, dass durch den Abstand der Nanopartikel untereinander, d. h. die räumliche Trennung der Fängermoleküle, eine bessere räumliche Zugänglichkeit der Fängermoleküle für die daran bindenden makromolekularen Biopolymere gegeben ist und somit die Wahrscheinlichkeit einer Wechselwirkung erhöht wird. Die Ausbildung als Nanopartikel vergrößert zudem die effektive Oberfläche. Unter makromolekularen Biopolymeren werden hier Nukleinsäuren wie DNA und RNA-Moleküle oder auch kürzere Nukleinsäuren wie Oligonukleotide mit 10 bis 20 Basenpaaren (bp) verstanden.

Die Nukleinsäuren können doppelsträngig sein, jedoch auch zumindest einzelsträngige Bereiche aufweisen oder, zum Beispiel durch vorangehende thermische Denaturierung (Strangtrennung) für ihren Nachweis, als Einzelstränge vorliegen. Die Sequenz der zu erfassenden Nukleinsäuren kann dabei zumindest teilweise oder vollständig vorgegeben, d. h. bekannt sein. Weitere makromolekulare Biopolymere sind Proteine oder Peptide. Diese können aus den üblicherweise in Proteinen vorkommenden 20 Aminosäuren aufgebaut sein, aber auch natürlich nicht vorkommende Aminosäuren enthalten oder z. B. durch Zuckerreste (Oligosaccharide) modifiziert sein oder post-translationale Modifikationen enthalten. Ferner können auch Komplexe aus mehreren unterschiedlichen makromolekularen Biopolymeren erfasst werden, beispielsweise Komplexe aus Nukleinsäuren und Proteinen.

Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so werden als Fängermoleküle bevorzugt Liganden verwendet, die die zu erfassenden Proteine oder Peptide spezifisch binden können. Die Fängermoleküle/ Liganden sind vorzugsweise durch kovalente Bindungen mit dem Mittel zur Immobilisierung verknüpft.

Als Liganden für Proteine und Peptide kommen niedermolekulare Enzymagonisten oder Enzymantagonisten, Pharmazeutika, Zucker oder Antikörper oder irgendein Molekül in Betracht, das die Fähigkeit besitzt, Proteine oder Peptide spezifisch zu binden.

Wenn DNA-Moleküle (Nukleinsäuren oder Oligonukleotide) einer vorgegeben Nukleotidsequenz mit dem hier beschriebenen Verfahren erfasst werden, so werden sie vorzugsweise in einzelsträngiger Form erfasst, d. h. sie werden ggf. vor der Erfassung durch Denaturierung wie vorstehend erläutert in Einzelstränge überführt. In diesem Fall werden als Fängermoleküle dann vorzugsweise DNA-Sondenmoleküle mit einer zu dem einzelsträngigen Bereich komplementären Sequenz verwendet. Die DNA-Sondenmoleküle können wiederum Oligonukleotide oder auch längere Nukleotidsequenzen aufweisen, solange diese keine der intermolekularen Strukturen ausbilden, die eine Hybridisierung des Sondenmoleküls mit der zu erfassenden Nukleinsäure verhindern. Allerdings ist es auch möglich, DNA-bindende Proteine oder Agenzien als Fängermolekül einzusetzen.

Anzumerken ist, dass es selbstverständlich möglich ist, mit dem vorliegenden Verfahren nicht nur eine einzige Art von Biopolymeren in einer einzelnen Messreihe zu erfassen.

Vielmehr können mehrere makromolekulare Biopolymere gleichzeitig oder auch nacheinander erfasst werden. Dazu können auf der Einheit zum Immobilisieren mehrere Arten von Fängermolekülen, von denen jedes eine (spezifische) Bindungsaffinität für ein bestimmtes zu erfassendes Biopolymer aufweist, gebunden werden, und/oder es können mehrere Einheiten zum Immobilisieren eingesetzt werden, wobei an jeder von diesen Einheiten nur eine Art von Fängermolekül gebunden wird. Bei diesen Mehrfachbestimmungen wird für jedes zu erfassende makromolekulare Biopolymer vorzugsweise eine von den anderen Markierungen unterscheidbare Markierung verwendet. Beispielsweise können zwei oder mehrere Fluorophore als Markierungen verwendet werden, wobei jedes dieser Fluorophore vorzugsweise eine spezifische Anregungs- und Emissionswellenlänge besitzt.

In einem ersten Verfahrensschritt wird die zumindest eine Einheit zum Immobilisieren mit den Fängermolekülen versehen, wobei diese eine Markierung aufweisen, die ein detektierbares Signal erzeugen kann.

Eine zu untersuchende Probe, vorzugsweise ein flüssiges Medium wie ein Elektrolyt, wird dann mit der Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht. Dies erfolgt in der Weise, dass die makromolekularen Biopolymere an die Fängermoleküle binden können. Für den Fall, dass sich in dem Medium mehrere zu erfassende makromolekulare Biopolymere befinden, werden die Bedingungen so gewählt, dass diese jeweils zur gleichen Zeit oder nacheinander an ihre entsprechendes Fängermolekül binden können.

Nachdem eine ausreichende Zeitdauer gewartet worden ist, damit die makromolekularen Biopolymere an das entsprechende Fängermolekül bzw. die entsprechenden Fängermoleküle binden konnten, werden nicht gebundene Fängermoleküle von der Einheit bzw. den Einheiten zum Immobilisieren, auf der bzw. auf denen sie sich befinden, entfernt.

Sollen als makromolekulare Biopolymere Proteine oder Peptide erfasst werden, so werden die nicht gebundenen, als Fängermoleküle verwendeten Liganden von der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren entfernt werden, indem ein Material mit der mindestens einen Einheit zum Immobilisieren in Kontakt gebracht wird, wobei das Material imstande ist, die chemische Verbindung zwischen dem Liganden und der Einheit zum Immobilisieren zu hydrolysieren.

Für den Fall, dass die Fängermoleküle niedermolekulare Liganden sind, lassen sich diese, falls ungebunden, auch enzymatisch entfernen.

Hierzu sind die Liganden über eine enzymatisch spaltbare Verbindung kovalent mit der Einheit zur Immobilisierung verbunden, beispielsweise über eine Esterverbindung.

In diesem Falle kann beispielsweise eine Carboxylester- Hydrolase (Esterase) eingesetzt werden, um ungebundene Ligandenmoleküle zu entfernen. Dieses Enzym hydrolysiert diejenige Esterbindung zwischen der Einheit zur Immobilisierung und dem jeweiligen Ligandenmolekül, das nicht von einem Peptid oder Protein gebunden wurde. Dagegen bleiben die Esterverbindungen zwischen der Einheit zum Immobilisieren und denjenigen Molekülen, die eine Bindungswechselwirkung mit Peptiden oder Proteinen eingegangen sind, aufgrund der verminderten sterischen Zugänglichkeit, die durch die Raumerfüllung des gebundenen Peptids oder Proteins eintritt, unversehrt.

Für den Fall, dass die Fängermoleküle DNA-Stränge sind, erfolgt die Entfernung der nicht gebundenen Sondenmoleküle enzymatisch, beispielsweise mit Hilfe eines Enzyms mit Nukleaseaktivität. Vorzugsweise wird als Enzym mit Nukleaseaktivität ein Enzym verwendet, das selektiv einzelsträngige DNA abbaut. Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen.

Besitzt das für den Abbau nicht hybridisierter DNA- Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise auch die zu erfassende DNA, die in Form eines doppelsträngigen Hybrids mit dem Sondenmolekül vorliegt, unerwünschterweise ebenfalls abgebaut.

Insbesondere können zum Entfernen der nicht gebundenen DNA- Sondenmoleküle von der jeweiligen Elektrode DNA Nukleasen, beispielsweise eine Nuklease aus Mung-Bohnen, die Nuklease P1 oder die Nuklease S1 verwendet werden. Gleichfalls können DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5'@ 3'Exonukleaseaktivität oder ihrer 3'5'Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, verwendet werden.

Nach dem Entfernen der nicht gebundenen Fängermoleküle werden die makromolekularen Biopolymere mittels der Markierung erfasst. Dazu wird entweder ein von der Markierung spontan ausgesandtes Signal wie radioaktive Strahlung oder durch eines durch externe Anregung verursachtes Signal wie ausgesandte Fluoreszenzstrahlung gemessen.

Wenn als Signal die emittierte Fluoreszenzstrahlung gemessen wird, kann der Biosensor derart gestaltet sein, dass die Messung ortsaufgelöst direkt auf dem Sensor erfolgt, indem z. B. die Einheit zum Immobilisierung direkt auf einer zur Messung verwendeten Fotozelle aufgebracht ist und die Fotozelle mit einer entsprechenden Auswerteeinheit verbunden ist. Dies hat den Vorteil einer vereinfachten Messanordnung.

Eine solche Messanordnung kann z. B. mittels einer konventionellen CMOS-Kamera oder einem CCD realisiert werden.

Allerdings ist es selbstverständlich auch möglich, eine externe Einheit für die Erfassung der emittierten Fluoreszenzstrahlung zu verwenden.

In Abhängigkeit von der eingesetzten Markierung und dem Messverfahren kann auch eine Messung des Signals durchgeführt werden, bevor oder nachdem die mindestens eine Einheit zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren mit den Fängermolekülen versehen wird. In diesem Fall werden die ermittelten Werte aus den beiden Messung des Signals miteinander verglichen. Wenn die Signalintensität der gemessenen Werte sich in einer Weise unterscheiden, dass die Differenz der ermittelten Werte größer ist als ein vorgegebener Schwellenwert, so wird angenommen, dass makromolekulare Biopolymere an Fängermoleküle gebunden haben und dadurch die Veränderung der Intensität des am Empfänger empfangenen Signals verursacht worden ist.

Ausführungsbeispiele der Erfindung sind in den Figuren dargestellt und werden im weiteren näher erläutert.

Es zeigen Figuren la bis lc einen Biosensor zu unterschiedlichen Verfahrenszuständen, anhand denen das Verfahren gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung erläutert wird ; Figuren 2a und 2b eine Skizze zweier Planarelektroden, mittels derer die Existenz zu erfassender DNA-Stränge in einem Elektrolyt (Figur 2a) bzw. deren Nichtexistenz (Figur 2b) nachgewiesen werden können ; Figuren 3a bis 3f einen Biosensor, mit dem eine weitere Ausführungsform des hier beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden kann ; Figuren 4a bis 4c Skizzen eines Biosensors gemäß dem Stand der Technik, anhand derer einzelne Zustände im Rahmen des Redox-Recycling-Vorgangs erläutert werden ; Figur 5 einen Funktionsverlauf eines Kreisstroms gemäß dem Stand der Technik im Rahmen eines Redox-Recycling- Vorgangs ; Figuren 6a und 6b einen Biosensor, mit dem ein Redox- Recycling-Vorgang als weitere Ausführungsform des Verfahrens durchgeführt werden kann Fig. 1 zeigt einen Ausschnitt aus einem Biosensors 100, mit dem ein erstes Ausführungsbeispiel des hier beschriebenen Verfahren durchgeführt werden kann.

Fig. la zeigt den Biosensor 100 mit einer ersten Fotodiode 101 und einer zweiten Fotodiode 102, die in einer Isolatorschicht 103 aus Isolatormaterial angeordnet sind.

Die erste Fotodiode 101 und die zweite Fotodiode 102 sind über erste elektrischen Anschlüsse 104 bzw. zweite elektrische Anschlüsse 105 mit einer Auswerteeinheit (nicht dargestellt) verbunden. Die beiden Fotodioden 101,102 sind ferner mit einer Oxidschicht 106 und einer ersten Einheit 107 zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren bzw. einer zweiten Einheit 108 zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren versehen. Die Einheiten zum Immobilisieren 107 und 108 sind aus Gold hergestellt.

Alternativ können die Einheiten 107,108 zum Immobilisieren auch aus Siliziumoxid hergestellt sein und mit einem Material beschichtet werden, das geeignet ist, Fängermoleküle zu immobilisieren.

Beispielsweise können bekannte Alkoxysilanderivate verwendet werden wie <BR> 3-Glycidoxypropylmethyloxysilan,<BR> 3-Acetoxypropyltrimethoxysilan,<BR> 3-Aminopropyltriethoxysilan, 4- (Hydroxybutyramido) propyltriethoxysilan, 3-N, N-bis (2-hydroxyethyl) aminopropyltriethoxysilan, oder andere artverwandte Materialen, die imstande sind, mit ihrem einen Ende eine kovalente Bindung mit der Oberfläche des Siliziumoxids einzugehen und mit ihrem anderen Ende dem zu immobilisierenden Sondenmolekül eine chemisch reaktive Gruppe wie einen Epoxy-, Acetoxy-, Amin-oder Hydroxylrest zur Reaktion anzubieten.

Reagiert ein zu immobilisierendes Fängermolekül mit einer solchen aktivierten Gruppe, so wird es über das gewählte Material als eine Art kovalenter Linker auf der Oberfläche der Beschichtung auf der Einheit zum Immobilisieren gebunden.

Auf den Einheiten zum Immobilisieren 107 und 108 werden DNA- Sondenmoleküle 109,110 als Fängermoleküle aufgebracht.

Dabei sind auf der ersten Fotodiode 101 mittels der Einheit 107 erste DNA-Sondenmoleküle 109 mit einer zu einer vorgegebenen ersten DNA-Sequenz komplementären Sequenz aufgebracht. Die DNA-Sondenmoleküle 109 sind jeweils mit einem ersten Fluorophor 111 markiert.

Als Fluorophor kann beispielsweise Fluorescein verwendet werden. Die Markierung der Fängermoleküle 109 kann dadurch geschehen, dass ein entsprechend markiertes Nukleotid wie ChromaTide Fluorescein-12-dUTP (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, Produkt-Nr. C-7604) enzymatisch, d. h. mittels geeigneter Polymerasen wie DNA-Polymerase oder Klenow Polymerase, in die Oligonukleotide (Fängermoleküle) 109 eingebaut wird (vgl. [10]).

Auf der zweiten Fotodiode 102 sind zweite DNA-Sondenmoleküle 110 mit einer Sequenz, die komplementär ist zu einer vorgegebenen zweiten DNA-Sequenz ist, aufgebracht. Die DNA- Sondenmoleküle 110 sind jeweils mit einem zweiten Fluorophor 112 markiert. Als Markierung 112 kann dabei z.B. das Fluorophor #Oregon GreenTM 488" dienen, das ebenfalls an ein Nukleotid wie dUTP gekoppelt (Molecular Probes, Inc., Eugene, Oregon, USA, Produkt-Nr. C-7630) auf enzymatischem Wege in die DNA-Moleküle 110 eingebaut wird.

An die Pyrimidinbasen Adenin (A), Guanin (G), Thymin (T) bzw.

Uracil (U) im Falle einer oben beschriebenen Markierung, oder Cytosin (C), können jeweils zu den Sequenzen der Sondenmoleküle komplementäre Sequenzen von DNA-Strängen in der üblichen Weise, d. h. durch Basenpaarung über Wasserstoffbrückenbindungen zwischen A und T oder U bzw. zwischen C und G, hybridisieren.

Fig. la zeigt ferner einen Elektrolyten 113, der mit den Fotodioden 101,102 und den DNA-Sondenmolekülen 108,109 in Kontakt gebracht wird.

Fig. lb zeigt den Biosensor 100 für den Fall, dass in dem Elektrolyten 113 DNA-Stränge 114 enthalten sind, die eine vorgegebene erste Nukleotidsequenz aufweisen, die komplementär ist zu der Sequenz der ersten DNA-Sondenmoleküle 109.

In diesem Fall hybridisieren die zu den ersten DNA- Sondenmolekülen 109 komplementären DNA-Stränge 114 mit den ersten DNA-Sondenmolekülen 109, die auf der ersten Fotodiode 101 aufgebracht sind.

Da die Sequenzen von DNA-Strängen nur mit der jeweils spezifischen Komplementärsequenz hybridisieren, hybridisieren die zu den ersten DNA-Sondenmolekülen komplementären DNA- Stränge nicht mit den zweiten DNA-Sondenmolekülen 110.

Wie aus Fig. lb ersichtlich ist, ist das Resultat nach erfolgter Hybridisierung, dass sich auf der ersten Fotodiode 101 hybridisierte Moleküle befinden, d. h. doppelsträngige DNA-Moleküle immobilisiert sind. Auf der zweiten Fotodiode 102 sind nur die zweiten DNA-Sondenmoleküle 110 als weiterhin einsträngige Moleküle vorhanden.

In einem weiteren Schritt wird mittels eines biochemischen Verfahrens, beispielsweise durch Zugabe von DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyten 113, eine Hydrolyse der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 110 auf der zweiten Fotodiode 102 bewirkt.

Hierbei ist die Selektivität des abbauenden Enzyms für einzelsträngige DNA zu berücksichtigen. Besitzt das für den Abbau der nicht hybridisierten DNA-Einzelstränge ausgewählte Enzym diese Selektivität nicht, so wird möglicherweise die als doppelsträngige DNA vorliegende zu erfassende Nukleinsäure ebenfalls (unerwünschterweise) abgebaut, was zu einer Verfälschung des Messergebnisses führen würde.

Nach Entfernen der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle, d. h. der zweiten DNA-Sondenmoleküle 110 auf der zweiten Fotodiode 102 sind lediglich die Hybride aus den zu erfassenden DNA- Molekülen 114 und den dazu komplementären ersten DNA- Sondenmolekülen 109 (vgl. Fig. lc) vorhanden.

Beispielsweise kann zum Entfernen der nicht gebundenen einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 110 auf der zweiten Fotodiode 102, d. h. der zweiten Einheit zum Immobilisieren, einer der folgenden Stoffe zugegeben werden : Nuklease aus Mung-Bohnen, Nuklease Pl, oder Nuklease Sl.

Zu diesem Zweck können ebenfalls DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5'3'Exonukleaseaktivität oder ihrer 3'5'Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen, verwendet werden.

Nach dem Abbau der einzelsträngigen Sondenmoleküle kann der Elektrolyt von den Fotodioden 101 und 102 gegebenenfalls entfernt werden. Dies erhöht den Kontrast, d. h. reduziert den Hintergrund, bei der nachfolgenden Fluoreszenz-Messung.

Mittels eines nicht gezeigten Lasers wird daraufhin durch Pfeile 115 symbolisiertes Licht mit einer Wellenlänge eingestrahlt, die geeignet ist, das erste Fluorophor 111 und das zweite Fluorophor 112 zur Fluoreszenz anzuregen. Dabei können, je nach Art der Fluorophore, auch unterschiedliche Wellenlängen verwendet werden, entweder gleichzeitig oder auch nacheinander.

Durch das eingestrahlte Licht wird nur das an den ersten DNA- Sondenmolekülen 109 befindliche Fluorophor 111 zur Emission angeregt, da die ungebundenen zweiten DNA-Sondenmoleküle 110 samt dem Fluorophor 112 von der zweiten Fotodiode 102 durch die Nukleasebehandlung entfernt worden sind (vgl. Fig. lc).

Die durch den Pfeil 116 symbolisierte Fluoreszenzstrahlung, die von dem Fluorophor 111 emittiert wird, wird von der ersten Fotodiode 101 erfasst. An der zweiten Fotodiode 102 wird hingegen keine Fluoreszenzstrahlung detektiert.

Auf diese Weise wird die Anwesenheit der DNA-Moleküle 114 ermittelt. Die Verwendung des hier beschriebenen Biosensors 100 erlaubt eine örtlich aufgelöste Erfassung und bietet eine deutliche Vereinfachung der gesamten Messanordnung, da keine externe Einheit zur Erfassung der Fluoreszenz-Strahlung notwendig ist.

Fig. 3 zeigt einen Ausschnitt eines Biosensors 300, der mit mindestens einer Einheit zur Immobilisierung in Form von Nanopartikeln ausgestaltet ist, und mit dem eine weitere Ausführungsform des hier beschriebenen Verfahrens durchgeführt werden kann.

Der Biosensor 300 weist eine erste Fotodiode 301 und eine zweite Fotodiode 302 auf, die in einer Isolatorschicht 303 aus Isolatormaterial wie Silizium angeordnet sind. Der Biosensor 300 weist weiterhin eine Oxidschicht 304 und eine zweite darauf befindliche Schicht 305 auf. Die zweite Schicht 305 besteht dabei aus einem Metall, das nicht für die Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren geeignet ist. Die Schicht 305 kann z. B. aus Platin gebildet werden.

Auf der Schicht 305 werden die Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren, die die Form von Nanopartikeln aufweisen, durch folgendes Verfahren gebildet.

Eine Lösung von 0,5 Gew.-% Block-Copolymer Polystryol (PS)- block-poly (2-vinylpyridin) (P2VP) der allgemeinen Formel PS (x)-b-P2VP (y) wird, wie in [12] und [13] beschrieben, mit 0,5 Äquivalenten HAuCl4-H20 pro Pyridin-Einheit zur Ausbildung von monodispersen (micellar gelösten) Gold- Partikeln versetzt. x und y geben in der Formel die Anzahl der Grundeinheiten entsprechend dem Verhältnis zwischen Monomer und Initator an.

Nach der Bildung homogener Micellen wird aus dieser Lösung durch Reduktion mit Hydrazin, wie in [12] und [13] beschrieben, eine Monoschicht von Nanopartikeln aus Gold auf der Schicht 305 abgeschieden. Anschließend werden die organischen Bestandteile der abgeschiedenen Micellen, d. h. das Block-Copolymer, durch Plasmaätzen mittels eines Sauerstoffplasmas von der Schicht 305 entfernt (vgl. [13]).

Die Goldpartikel 306, die als die Einheiten zum Immobilisieren von makromolekularen Biopolymeren dienen, bleiben bei dieser Behandlung mit Plasma unversehrt und bilden, wie in der Schnittansicht von Fig. 3b und der Draufsicht von Fig. 3c veranschaulicht, eine regelmäßige Anordnung auf der Schicht 305 aus (vgl. [12]). Die Abstände zwischen den Gold-Nanopartikeln 306 betragen in der Regel einige 10 nm, z. B. ca. 20 bis 30 nm. Die Nanopartikel besitzen vorzugsweise eine Größe im Bereich von ca. 5 bis 10 nm.

Neben den oben genannten Blockpolymeren sind selbstverständlich auch weitere Blockpolymere zur Ausbildung der Nanopartikel verwendbar.

Alternativ können die Einheiten 306 zum Immobilisieren in Nanopartikel-Form auf dem Biosensor erzeugt werden, wie in [14] beschrieben, indem zunächst eine Maske für die Nanostrukturierung aus Kolloidpartikel auf der Schicht 305 ausgebildet wird und dann z. B. mittels Vakuumdeposition Goldpartikel abgelagert werden.

Nach dem Aufbringen der Nanopartikel 306 aus Gold wird der Sensor 300 derart strukturiert, dass die Schicht 305 aus Platin samt den Einheiten 306 zum Immobilisieren nur auf Bereichen zurückbleibt, die sich auf den Fotodioden 301,302 befinden, wie in der Schnittansicht von Fig. 3d und der Draufsicht von Fig. 3e gezeigt ist. Diese Strukturierung ist z. B. mit Hilfe jedes geeigneten gängigen chemischen Ätzverfahrens möglich.

Mit Hilfe des so gestalteten Biosensors 300 kann das im ersten Ausführungsbeispiel beschriebene Verfahren zum Erfassen von makromolekularen Biopolymeren durchgeführt werden. Fig. 3f zeigt ein auf einem Gold-Nanopartikel 306 mittels der Gold-Schwefel-Kopplung immobilisiertes DNA- Fängermolekül 307.

Die Verwendung des Biosensors 300 bietet den Vorteil, dass die in Nanopartikel-Form vorliegenden Einheiten 305 zum Immobilisieren es ermöglichen, eine genau definierte Anzahl von Fängermolekülen zu immobilisieren. Der Einsatz des Biosensors 300 ist daher bei einer quantitativen Erfassung von makromolekularen Biopolymeren bevorzugt.

Fig. 6 zeigt einen Biosensor 600, mit dem ein Redox-Recycling- Vorgang gemäß einem weiteren Ausführungsbeispiel des Verfahrens der Erfindung durchgeführt werden kann.

Der Biosensor 600 weist drei Elektroden auf, eine erste Elektrode 601, eine zweite Elektrode 602 sowie eine dritte Elektrode 603.

Die Elektroden 601,602,603 sind mittels eines Isolatormaterials als Isolatorschicht 604 elektrisch voneinander isoliert.

Auf der ersten Elektrode 601 ist ein Haltebereich 605 zum Halten von Sondenmolekülen, die makromolekulare Biopolymere binden können, vorgesehen. Dieser Haltebereich kann als eine einheitliche Einheit zum Immobilisieren ausgestaltet sein, möglich ist jedoch auch, diesen Haltebereich mit Einheiten zum Immobilisieren in Form von Nanopartikeln auszubilden.

Die Sondenmoleküle (Fängermoleküle) 606 gemäß diesem Ausführungsbeispiel, die an dem Haltebereich immobilisiert sind, sind DNA-Sondenmoleküle, mit denen DNA-Stränge mit zu der Sequenz der DNA-Sondenmoleküle komplementärer Sequenz hybridisieren können. Als Markierung 607 tragen die Sondenmoleküle 606 an ihrem 5-Terminus eine Biotin-Gruppe, die z. B. durch Verwendung des"FluoReporter Biotin-X-C5 Oligonucleotide Labeling Kits" (Produkt-Nr. F-6095) der Firma Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA dort angefügt werden kann (vgl. 11].

Die DNA-Sondenmoleküle 606 werden mittels der bekannten Gold- Schwefel-Kopplung an die erste Elektrode 601 aus Gold immobilisiert. Bei Einsatz eines anderen Materials zum Binden der Sondenmoleküle wird das Material mit dem entsprechenden Beschichtungsmaterial versehen, auf dem die Sondenmoleküle immobilisiert werden können.

Während der Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle auf der ersten Elektrode 601 werden an die Elektroden unterschiedliche elektrische Potentiale angelegt, so dass ein elektrisches Feld zwischen den Elektroden derart entsteht, dass eine Immobilisierung der DNA-Sondenmoleküle nur an der ersten Elektrode 601 möglich ist und an der zweiten Elektrode 602 und/oder an der dritten Elektrode 603 verhindert wird.

In analoger Weise zu dem Verfahren gemäß dem Stand der Technik, wie er oben beschrieben worden ist (vgl. Fig. 4), wird in einem weiteren Schritt eine zu untersuchende Lösung 609, beispielsweise ein Elektrolyt, mit dem eventuell zu erfassenden makromolekularen Biopolymeren, d. h. den DNA- Strängen, die mit den DNA-Sondenmolekülen hybridisieren können, mit dem Biosensor 600, d. h. insbesondere mit der ersten Elektrode 601 und den darauf befindlichen markierten DNA-Sondenmolekülen 606 in Kontakt gebracht. Dies erfolgt derart, dass eventuelle in der zu untersuchenden Lösung enthaltene DNA-Stränge 608 mit den DNA-Sondenmolekülen 606 hybridisieren können.

Anschließend werden Fängermoleküle 606, an die keine zu erfassenden DNA-Stränge hybridisiert haben, entfernt. Dies kann durch Zugabe der oben im ersten Ausführungsbeispiel genannten DNA-Nukleasen zu dem Elektrolyten 606 erfolgen.

Auch in diesem Fall kann zur Hydrolyse der einzelsträngigen DNA-Sondenmoleküle 606 einer der folgenden Stoffe eingesetzt werden : Nuklease aus Mung-Bohnen, Nuklease P1, Nuklease S1, oder DNA-Polymerasen, die aufgrund ihrer 5'9 3'Exonukleaseaktivität oder ihrer 3'5'Exonukleaseaktivität imstande sind, einzelsträngige DNA abzubauen.

Nach der Nukleasebehandlung befinden sich auf dem Biosensor lediglich die Hybride aus markierten Fängermolekülen 606 und zu erfassenden DNA-Molekülen 608. Dieser Zustand ist in Fig. 6a gezeigt.

In diesem Zustand wird der Biosensor 600 mittels einer nicht dargestellten Spüllösung gespült, d. h. es werden die Fragmente der nicht hybridisierten DNA-Stränge sowie die zu untersuchende Lösung entfernt.

In einem nächsten Schritt wird eine weitere Lösung (nicht dargestellt) mit dem Biosensor 600, insbesondere mit der ersten Elektrode 601, in Kontakt gebracht.

Dabei enthält diese weitere Lösung ein Enzym 610, das an die Markierung 607 der hybridisierten DNA-Sondenmoleküle 606 bindet, und das die im folgenden erläuterten Moleküle, die in einer weiteren Lösung 611 zugegeben werden, spalten kann.

Als Enzym 610 können gemäß diesem Ausführungsbeispiel beispielsweise alpha-Galactosidase,<BR> # beta-Galactosidase,<BR> beta-Glucosidase, alpha-Mannosidase, Alkalische Phosphatase, Saure Phosphatase, Oligosaccharid-Dehydrogenase, Glucose-Dehydrogenase, Laccase, Tyrosinase, oder artverwandte Enzyme verwendet werden.

Das Enzym 610 wird vorliegend in Form eines Avidin-Konjugats eingesetzt. Grund dafür ist, dass Avidin eine spezifische Bindung mit der hier beispielhaft verwendeten Biotin- Markierung 607 eingeht (Fig. 6b).

Es ist hierbei anzumerken, dass niedermolekulare Enzyme die höchste Umsatzeffizienz und daher auch die höchste Empfindlichkeit bei Verwendung als Enzym, das das Redox- Recyling bewirkt, gewährleisten können.

In der weiteren Lösung 611 sind Moleküle 612 enthalten, die durch das Enzym 610 in ein erstes Teilmolekül 613 mit negativer elektrischer Ladung und in ein zweites Teilmolekül mit positiver elektrischer Ladung gespalten werden können (vgl. Fig. 6b).

Als das spaltbare Molekül 612 können vor allem beispielsweise p-Aminophenyl-hexopyranoside, p-Aminophenyl-phosphate, p-Nitrophenyl-hexopyranoside, p-Nitrophenyl-phosphate, oder geeignete Derivate von Diaminen, Catecholaminen, Fe (CNfi, Ferrocen, Dicarboxylsäure, Ferrocenlysin, Osmiumbipyridyl-NH, oder 2 PEG-Ferrocen verwendet werden.

An die Elektroden 601,602,603 wird bei dieser Ausführungsform nun jeweils ein elektrisches Potential angelegt.

Dabei wird an die erste Elektrode 601 ein erstes elektrisches Potential V (E1) angelegt, an die zweite Elektrode 602 ein zweites elektrisches Potential V (E2) und an die dritte Elektrode 603 ein drittes elektrisches Potential V (E3).

Während der eigentlichen Messphase, die grundsätzlich analog der Vorgehensweise aus dem Stand der Technik, wie oben beschrieben wurde, erfolgt, wird ein abhängig von dem Vorzeichen der Ladung, jeweils folgendes Potentialgefälle der elektrischen Potentiale an die Elektroden 601,602,603 angelegt derart, dass gilt : V (E3) > V (E1) > V (E2).

Weist beispielsweise die dritte Elektrode 603 ein positives elektrisches Potential V (E3) auf, so weist die dritte Elektrode 603 das größte elektrische Potential der Elektroden 601,602,603 des Biosensors 600 auf.

Dies bewirkt, dass die erzeugten ersten Teilmoleküle 613 mit negativer Ladung aufgrund des größten elektrischen Potentials V (E3), das an der dritten Elektrode 603 anliegt, zu der positiv geladenen dritten Elektrode 603 gezogen wird, und nicht mehr, wie gemäß dem Stand der Technik, zu der ersten Elektrode 601.

Folglich wird in diesem Ausführungsbeispiel die erste Elektrode 601 nicht mehr sowohl als Halte-Elektrode zum Halten der Sondenmoleküle und als Messelektrode zum Oxidieren oder Reduzieren der jeweiligen Teilmoleküle verwendet.

Vielmehr dient die Elektrode 601 nur zum Immobilisieren der Sondenmoleküle bzw. den Komplexen aus Sondenmolekülen und zu erfassenden makromolekularen Biopolymeren.

Die Funktion der Elektrode, an der die Oxidation bzw.

Reduktion der erzeugten Teilmoleküle stattfindet, übernimmt nunmehr die dritte Elektrode 603.

Anschaulich bedeutet dies, dass mittels der dritten Elektrode 603 die erste Elektrode 601 von den gespaltenen Teilmolekülen abgeschirmt wird.

Auf diese Weise kann als weiterer Vorteil bei dieser Ausführungsform die Bedeckung der ersten Elektrode mit den DNA-Sondenmolekülen 606 erheblich erhöht werden.

An der dritten Elektrode 603 erfolgt eine Oxidation der negativ geladenen Teilmoleküle 613 und die oxidierten ersten Teilmoleküle 614 werden zu der zweiten Elektrode 602 gezogen, da diese das kleinste elektrische Potential V (E2) aller Elektroden 601,602,603 in dem Biosensor 600 aufweist.

An der zweiten Elektrode 602 erfolgt eine Reduktion der oxidierten Teilmoleküle und die reduzierten Teilmoleküle 615 werden wiederum an die dritte Elektrode 603 gezogen, wo wiederum eine Oxidation erfolgt.

Auf diese Weise ergibt sich vorliegend-analog zu der im Stand der Technik bekannten Weise-ein Kreisstrom, der ebenfalls auf bekannte Weise erfasst wird. Somit ergibt sich auch hier ein Verlauf des Kreisstroms über die Zeit als Signal. Aus diesem kann (mittels des über die Markierung 607 gebundenen Enzyms 610) aufgrund der Proportionalität des Kreisstroms zu der Anzahl der durch das Enzym 610 erzeugten Ladungsträger wiederum die Anzahl der hybridisierten DNA- Stränge 606 und somit der zu erfassenden DNA-Moleküle 608 ermittelt werden.

Allerdings sei hier angemerkt, dass dieses Redox-Recycling Verfahren im Sinne der Erfindung auch mit der bekannten"2- Elektroden-Anordnung"gemäß Fig. 4 durchgeführt werden kann.

Dann kann jedoch nicht auf den Vorteil des hier beschriebenen Biosensors 600 zurückgegriffen werden, der durch die Ausgestaltung der Elektrode 601 als Immobilisierungselektrode, eine höhere Bedeckungsdichte als die aus dem Stand der Technik bekannte Anordnung erlaubt.

In diesem Dokument sind folgende Veröffentlichungen zitiert : [1] R. Hintsche et al., Microbiosensors Using Electrodes Made in Si-Technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al., Dirk Hauser Verlag, Basel, S. 267-283,1997 [2] R. Hintsche et al, Microbiosensors using electrodes made in Si-technology, Frontiers in Biosensorics, Fundamental Aspects, edited by F. W. Scheller et al, Birkhauser Verlag, Basel, Schweiz, 1997 [3] M. Paeschke et al, Voltammetric Multichannel Measurements Using Silicon Fabricated Microelectrode Arrays, Electroanalysis, Vol. 7, Nr. 1, S. 1-8, 1996 [4] P. van Gerwen, Nanoscaled Interdigitated Electrode Arrays for Biochemical Sensors, IEEE, International Conference on Solid-State Sensors and Actuators, Chicago, S. 907- 910,16.-19. Juni 1997 [5] N. L. Thompson, B. C. Lagerholm, Total Internal Reflection Fluoresence : Applications in Cellular Biophysics, Current Opinion in Biotechnology, Vol. 8, S. 58-64,1997P.

[6] Cuatrecasas, Affinity Chromatography of Macromolecules, Advances in Enzymology, Vol. 36, S. 29-89,1972 [7] Römpp-Lexikon Biotechnologie, Gentechnik, S. 280,1999 Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2. Auflage.

[8] Römpp-Lexikon Biotechnologie, Gentechnik, S. 397,1999 Thieme Verlag, Stuttgart, Deutschland, 2. Auflage.

[9] J. Dodt et al., Skript zum biochemischem Praktikum IId (Immunchemie), ELISA, S. 1, Institut für Biochemie, Technische Hochschule Darmstadt, 10.-28. Februar 1992.

[10] Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, S. 157-160, Molecular Probes, Inc, 1996 [11] Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals, S. 83-84, Molecular Probes, Inc, 1996 [12] J. P. Spatz et al., Mineralization of Gold Nanoparticles in a Block Gold Copolymer Microemulsion, Chem. Eur. J., Vol. 2, S. 1552-1555,1996 [13] J. P. Spatz et al., Ordered Deposition of Inorganic Cluster from Micellar Block Copolymer Films, Langmuir, Vol. 16, S. 407-415,2000 [14] F. Burmeister et al., Mit Kapillarkräften zu Nanostrukturen, Physikalische Blätter, Vol. 36, S. 49- 51,2000 [15] DE 199 25 402 Al [16] Medline Abstract, DN 99128068 zu Kitazawa, S et al. In situ hybridization with polymerase chain-reaction derived single-stranded DNA probe and S1 nuclease ; Histchem. Cell Biol. 111 (1), S. 7-12,1999 [17] US 6,017,696 [18] DE 197 41 716 Al Bezugszeichenliste 100 Biosensor 101 Fotodiode 102 Fotodiode 103 Isolator 104 Elektrischer Anschluss 105 Elektrischer Anschluss 106 Oxidschicht 107 Einheit zum Immobilisieren 108 Einheit zum Immobilisieren 109 DNA-Sondenmolekül 110 DNA-Sondenmolekül 111 Markierung 112 Markierung 113 Elektrolyt 114 DNA-Stränge 115 Pfeil 116 Pfeil 200 Sensor 201 Elektrode 202 Elektrode 203 Isolator 204 Elektrodenanschluss 205 Elektrodenanschluss 206 DNA-Sondenmolekül 207 Elektrolyt 208 DNA-Stränge 300 Biosensor 301 Fotodiode 302 Fotodiode 303 Isolator 304 Oxidschicht 305 Schicht aus zur Immobilisierung von makromolekularen Biopolymeren nicht geeignetem Material 306 Nanopartikelförmige Einheiten zum Immobilisieren 307 DNA-Fängermolekül 400 Biosensor 401 Erste Elektrode 402 Zweite Elektrode 403 Isolatorschicht 404 Haltebereich erste Elektrode 405 DNA-Sondenmolekül 406 Elektrolyt 407 DNA-Strang 408 Enzym 409 Spaltbares Molekül 410 Negativ geladenes erstes Teilmolekül 411 Pfeil 412 Weitere Lösung 413 Oxidiertes erstes Teilmolekül 414 Reduziertes erstes Teilmolekül 500 Diagramm 501 Elektrischer Strom 502 Zeit 503 Kurvenverlauf Strom-Zeit 504 Offsetstrom 600 Biosensor 601 Erste Elektrode 602 Zweite Elektrode 603 Dritte Elektrode 604 Isolatorschicht 605 Haltebereich 606 DNA-Sondenmoleküle 607 Markierung 608 DNA-Stränge 609 Elektrolyt 610 Enyzm 611 weitere Lösung 612 spaltbares Molekül 613 Negativ geladenes erstes Teilmolekül 614 Oxidiertes erstes Teilmolekül 615 Reduziertes erstes Teilmolekül