Les semences sont d'une extrme importance pour l'alimentation humaine et animale car non seulement elles y entrent en proportions considérables mais, de plus, elles constituent le matériel de base de toutes nos cultures. Il est donc capital d'obtenir les meilleurs rendements possibles et des plantes vigoureuses pouvant résister aux agressions extérieures.

Or, le rendement des cultures dépend de la capacité des semences à germer, et toutes n'ont pas la mme vigueur germinative, du fait de l'hétérogénéité intrinsèque des lots de semences, mme s'il s'agit d'une variété pure. Cette hétérogénéité provient le plus souvent d'événements antérieurs au semis. La récolte, par exemple, intervient à un moment où le niveau de maturation des semences sur la plante mère peut tre variable. A ce défaut de synchronisme peut s'ajouter une altération de la capacité germinative des semences lors de leur stockage.

La germination est un processus de différenciation dans lequel les cellules de l'embryon passent d'un état de repos caractéristique de la semence mature sèche à un état métabolique intense caractérisant l'émergence et le développement de la plantule. Elle se met en place essentiellement au cours de la phase d'imbibition, et se termine au sens physiologique par la percée radiculaire au travers des enveloppes de la semence. La germination comprend trois phases : la première est la phase d'imbibition, qui correspond à une prise d'eau des tissus ; elle n'affecte pas la dormance ou l'activité cellulaire. Dès la fin de cette phase, les réserves de l'albumen ou des cotylédons sont mobilisées et les enzymes nécessaires à cette mobilisation sont alors synthétisées en abondance. Lui succède la phase de germination sensu stricto, durant laquelle le poids frais des semences est constant et qui est caractérisée par une activité métabolique intense pour aboutir à la percée radiculaire. Durant cette phase, la graine peut tre réversiblement déshydratée ou réhydratée sans dommages apparents pour sa viabilité. La dernière phase ou phase de croissance est caractérisée par une reprise de l'absorption d'eau et

une élévation de la consommation d'oxygène. Cette croissance affecte la radicule puis la tigelle (Bewley et Black, 1994).

Pour résoudre les problèmes posés par l'hétérogénéité germinative des semences individuelles constituant un lot, les firmes semencières pratiquent des conditionnements de semences dits physiologiques, nommés prégermination ( « priming » en anglais), qui permettent d'amener les semences au mme stade physiologique vis-à-vis du moment de la levée (Heydecker et al., 1973 ; Heydecker, 1978 ; Taylor et al., 1998). Ces procédés de prégermination doivent tenir compte de plusieurs paramètres pouvant influer sur le développement de la semence, tels que : l'état physiologique de la semence, la quantité d'eau utilisée pour le traitement (quantité suffisante pour déclencher un certain nombre de transformations biochimiques et moléculaires, mais insuffisante pour que la radicule perce les téguments), la durée du traitement, la température à laquelle est conduite le traitement, ou la nature de la méthode utilisée pour prégermer les semences (osmo-ou hydro-prégermination par exemple) (Ôzbingol et al., 1998). L'utilité de tels traitements pour améliorer le rendement des cultures est bien connue (Bradford, 1986). Ces techniques sont basées sur le fait que la germination peut tre divisée en plusieurs étapes et qu'elle peut tre interrompue par divers procédés juste avant l'émergence radiculaire au travers des téguments de la semence. La méthode la plus utilisée consiste en une hydratation contrôlée des semences, réalisée grâce à des agents osmotiques tels que le polyéthylène glycol (PEG) ou les sels (KNO3) [pour une revue, voir Bradford (1986)], avec de l'eau simplement (Tarquis et Bradford, 1992 ; Job C. et al., 1997) ou bien avec une atmosphère humide ( « drum priming ») (Rowse, 1996). A un certain seuil d'hydratation de l'embryon, le traitement engendrerait les phénomènes prégerminatifs requis pour la percée radiculaire ultérieure, lors du semis. Le traitement se termine par une déshydratation pour ramener les semences à leur taux d'humidité initial, ce qui permet de les stocker à nouveau (Heydecker et al., 1973 ; Heydecker, 1978 ; Taylor et al., 1998). Ce traitement s'avère efficace dans de nombreux cas, mais le problème majeur de la technique est de savoir comment contrôler précisément l'hydratation de l'embryon au cours de la prégermination. En effet, le point critique consiste à stopper le traitement avant la percée radiculaire, car si celui-ci est trop poussé, la déshydratation ultérieure des semences, nécessaire pour leur conservation, entraînera la mort des semences traitées. En effet, dès que la radicule apparaît, la plantule n'est plus tolérante à la déshydratation (Bewley et Black, 1994 ; Kermode, 1997). Si, au contraire, le traitement n'est pas assez intense, la reprise de

l'activité métabolique cellulaire ne sera pas amorcée et, par conséquent, la faculté germinative des semences ne sera pas significativement améliorée.

Actuellement, la seule technique utilisée pour mettre au point les conditions de prégermination des semences compatibles avec leur stockage repose sur la conduite de tests de germination nécessitant plusieurs jours d'expérimentation. De nombreuses publications traitent des méthodes d'amélioration des cultures et des applications concernant la prégermination, mais peu de documents décrivent le rôle que tient la prégermination au niveau cellulaire et moléculaire [pour une revue, voir Bradford (1986)]. Ce traitement semble avoir des conséquences quant à la synthèse d'ADN, d'ARN et de protéines (Dell'Aquila et Bewley, 1989 ; Karssen et al., 1989 ; Davison et Bray, 1991 ; Fujikura et Karssen, 1992 ; Bray, 1995). Toutefois, les phénomènes biochimiques et physiologiques intervenant au cours de la prégermination restent peu connus. Des études récentes montrent cependant qu'il existe des marqueurs moléculaires qui permettraient de mettre en évidence la prégermination et d'en assurer le contrôle. Ces marqueurs se manifestent à plusieurs niveaux : au cours de la mobilisation des réserves, lors de l'altération physique des tissus entourant la pointe racinaire, ou au cours de la reprise de l'activité cellulaire. La disponibilité de marqueurs moléculaires permettrait de définir plus facilement les conditions optimales de la prégermination des semences et de suivre en continu le déroulement du procédé. Quelques marqueurs ont été récemment décrits : -la p-tubuline, un marqueur de la reprise du cycle cellulaire chez la tomate susceptible de caractériser la prégermination des semences de tomate (De Castro et al., 1995).

Cette protéine entre dans la composition des microtubules liant les centromères et intervient donc dans la division cellulaire. Dans le cas de la semence de tomate, la néosynthèse de cette protéine est détectée principalement dans l'apex racinaire des cellules embryonnaires lors d'un traitement de prégermination. L'utilisation d'anticorps anti-tubuline commerciaux permet de distinguer par méthode ELISA ou test immunoblot les semences de tomate prégermées des semences témoins. Mais la mesure des variations quantitatives de p-tubuline au cours de la prégermination des semences nécessite la dissection des semences et la récupération des pointes racinaires. La reprise du cycle cellulaire peut également tre caractérisée par la technique de cytométrie en flux, mesurant le doublement de la quantité d'ADN des cellules de l'apex racinaire (phase replicative allant de G, à G2 du cycle cellulaire) durant la prégermination (Bino et al., 1992). Là encore, cette technique exige l'isolement des

pointes racinaires, car le phénomène de reprise de l'activité du cycle cellulaire se manifeste principalement dans cet organe.

-l'endo-p-mannanase, un marqueur de germination précoce lié à la dégradation localisée de l'albumen lors de la percée racinaire (Still et Bradford, 1997 ; Toorop et al., 1998). La résistance mécanique de l'albumen englobant la pointe racinaire serait, chez les semences de tomate, un facteur limitant de la germination. L'endo-p-mannanase est synthétisée au moment de l'imbibition ; des tests enzymatiques mesurant l'activité enzymatique ont été utilisés pour caractériser la cinétique des premières étapes de la germination des semences de tomate et pour suivre la prégermination de ces semences.

-une nouvelle protéine susceptible d'tre biotinylée chez les semences matures de plantes appartenant à des espèces de légumineuses, de carotte et de betterave et son utilisation comme marqueur moléculaire de la germination de ces semences (Duval et al., 1994 ; EP 0658625A2).

-un marqueur correspondant à un événement précoce mobilisant une protéine de réserve (globuline 11 S) chez les semences de betterave sucrière, nommée SIP (pour Seed Imbibition Protein), et permettant de caractériser biochimiquement (méthode immunoenzymatique) la prégermination à partir de semences entières (Job et al., 1997 ; WO 97/43418 ; Chareyre et al., 1998). C'est une protéine spécifique des semences, localisée dans tous les territoires de l'embryon, c'est-à-dire les cotylédons, l'apex racinaire et la tige ; elle n'est jamais détectée dans les organes végétatifs de la plante. Cette protéine présente le mme profil d'expression dans diverses variétés de semences. Il a été montré par ailleurs que sa solubilisation représente l'événement primaire de la mobilisation de la globuline qui s'achève par sa dégradation complète alors qu'elle sert de source de carbone et d'azote à la plantule naissante (WO 97/43418). Les globulines 11 S sont des complexes protéiques hexamériques de 320 à 400 kDa composés de six sous-unités différentes (52-65 kDa). Chaque sous-unité renferme un polypeptide acide d'environ 33 à 44 kDa (également nommé sous- unité A) et un polypeptide basique d'environ 19 à 23 kDa (également nommé sous-unité B). A l'intérieur de chaque sous-unité, les deux polypeptides acide et basique sont reliés par un pont disulfure. Les polypeptides A et B proviennent de la protéolyse (lors de la maturation de la graine sur la plante mère et de l'adressage des globulines dans les corps protéiques) d'une forme précurseur contenant en position N-terminale la sous-unité A et en position C-terminale la sous-unité B (Bewley et Black, 1994 ; Shewry et al., 1995). Par définition, les globulines

sont insolubles dans l'eau (Bewley et Black, 1994 ; Shewry et al., 1995). Lors de la prégermination des semences de betterave sucrière, la sous-unité A de la globuline 11 S subit une attaque protéolytique, ce qui libère un complexe composé d'un fragment de sous-unité A et de la sous-unité B, complexe qui devient soluble dans l'eau ou les solutions tampons de faible force ionique (Job C. et al., 1997). La prégermination des semences de betterave sucrière est ainsi quantifiable par un test ELISA reposant sur l'utilisation d'anticorps spécifiquement dressés contre la sous-unité B de la globuline 11 S de betterave sucrière (Job C. et al., 1997 ; WO 97/43418).

Finalement, peu de marqueurs existent pour caractériser la prégermination des semences. L'un correspond à un événement précoce mobilisant une protéine de réserve (globuline 11 S) chez la betterave sucrière, un autre correspond à la reprise du cycle cellulaire caractérisée chez la tomate (synthèse de-tubuline). Le dernier concerne l'activité endo-p- mannanase qui, en dégradant les parois de l'albumen, relâche les contraintes imposées sur la pointe racinaire. Il convient d'insister sur le fait que ces deux derniers types de marqueurs, contrairement au premier, exigent pour leur détection une dissection de la semence : les phénomènes d'induction de la p-tubuline, de reprise de l'activité du cycle cellulaire et d'induction de l'activité endo-p-mannanase ne se manifestent en effet majoritairement que dans la pointe racinaire lors de la prégermination. Aucun marqueur moléculaire n'a été détecté jusqu'à ce jour permettant d'analyser sur semences entières de tomate les techniques de prégermination.

La présente invention a pour but de fournir des sondes moléculaires protéiques ou nucléiques, et plus particulièrement des anticorps, permettant la détection ou la quantification de la sous-unité A chez des plantes avant la prégermination des semences, ou au cours de la prégermination, ainsi que la détection ou la quantification d'une protéine ou d'un fragment peptidique de cette dernière, qui sont spécifiques des semences prégermées.

La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux procédés de suivi de la prégermination des semences à l'aide des sondes moléculaires protéiques ou nucléiques susmentionnés, ainsi que les semences obtenues selon ces procédés, et les kits pour la mise en oeuvre de ces procédés.

La présente invention a pour objet l'utilisation : * d'une protéine correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S de semences de plantes,

* ou d'un fragment peptidique de la protéine susmentionnée, * ou d'anticorps dirigés contre la protéine ou le fragment peptidique susmentionnés, * ou d'une séquence nucléotidique codant pour la protéine ou le fragment peptidique susmentionnés, en tant que sondes moléculaires protéiques ou nucléiques utilisables comme marqueurs pour la détection de la sous-unité A de la globuline 11 S de semences, ou de fragments peptidiques de cette sous-unité A, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre de procédés de suivi de la phase de prégermination de semences.

Avantageusement les protéines correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S utilisées dans le cadre de la présente invention sont celles extraites de semences de plantes choisies parmi les solanacées, les cucurbitacées, les ombellifères, les valérianacées, les composées, les brassicacées et les chénopodiacées, ou sont les protéines recombinantes correspondantes obtenues par voie du génie génétique (notamment par transformation de celles appropriées avec les séquences nucléotidiques codant pour lesdites protéines et récupération desdites protéines recombinantes ainsi produites).

Les protéines correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S décrites ci-dessus et ci-après, présentent un poids moléculaire d'environ 33 à 44 kDa.

De préférence, la protéine susmentionnée correspondant à la sous-unité A, est celle extraite de semences de tomate, et plus particulièrement de Lycopersicon esculentum, notamment selon le procédé d'extraction et de purification détaillé ci-après.

Avantageusement encore la protéine définie ci-dessus, correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S de semences de plantes, est une protéine de poids moléculaire d'environ 37 kDa.

De préférence, la sous-unité A susmentionnée est celle comprenant les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK (peptide 1), QGDIIAFPAGAAH (peptide 2), IESEGGYTEVWD (peptide 4), GLISVINPGCAE (peptide 5) et RFESEAGVVEFWDATQ (peptide 6), ou toute séquence dérivée des séquences précédentes par substitution, élimination, ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée étant susceptible d'engendrer la formation d'anticorps reconnaissant la sous-unité A susmentionnée, et/ou reconnaissant un fragment de ladite sous-unité A, ledit fragment étant

présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, tel qu'un fragment d'environ 23 kDa.

Les fragments peptidiques des protéines définies ci-dessus correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S, utilisés dans le cadre de la présente invention, sont des fragments d'environ au moins 5 acides aminés desdites sous-unités, et permettant d'obtenir par immunisation d'un animal approprié des anticorps reconnaissant spécifiquement la sous-unité A de la globuline 11 S des semences de plantes, ou reconnaissant spécifiquement des fragments peptidiques de ladite sous-unité A, tel qu'un fragment peptidique d'environ 23 kDa de la sous-unité A présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination.

Avantageusement, les fragments peptidiques définis ci-dessus sont des fragments peptidiques d'au moins environ 5 acides aminés de la protéine d'environ 37 kDa définie ci- dessus, tels qu'obtenus par traitement de cette protéine à l'aide d'enzymes de restriction appropriées, et purification des fragments obtenus.

Parmi les fragments peptidiques utilisés dans le cadre de la présente invention, figure le fragment peptidique défini ci-dessus, correspondant à un polypeptide de poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : -est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, -est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées.

En outre, le polypeptide de 23 kDa environ défini ci-dessus, est caractérisé en ce qu'il comprend les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK (peptide 1), QGDIIAFPAGAAH (peptide 2) et GFYGIMNSGCPETFQ (peptide 3), ou toute séquence dérivée des séquences précédentes par substitution, élimination, ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée étant susceptible d'engendrer la formation d'anticorps reconnaissant la sous-unité A telle que définie ci-dessus, et/ou reconnaissant un fragment de ladite sous-unité A, ledit fragment étant présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, tel que le fragment d'environ 23 kDa susmentionné.

Le polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné est davantage caractérisé en ce qu'il représente un fragment de la protéine d'environ 37 kDa définie ci-dessus, ce fragment étant tel

qu'obtenu par extraction à partir de semences prégermées de plantes telles que définies ci- dessus.

L'invention a également pour objet l'utilisation susmentionnée de fragments d'environ au moins 5 acides aminés tels que définis ci-dessus, du polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné.

Les fragments peptidiques utilisés dans le cadre de la présente invention, sont également choisis parmi ceux correspondant à l'une des séquences peptidiques internes (voir peptides 1, 2,3, 4, 5 et 6) définies ci-dessus, ou à un fragment d'au moins environ 5 acides aminés de l'une de ces séquences peptidiques internes.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée de sondes moléculaires choisies parmi les anticorps définis ci-dessus dirigés contre la sous-unité A de la globuline 11 S de semences, ou contre un fragment de cette sous-unité A, notamment dans le cadre de tests enzymatiques de type ELISA (Enzyme Linked Sorbent Assay).

A cet égard, l'invention concerne plus particulièrement l'utilisation susmentionnée d'anticorps dirigés contre la protéine d'environ 37 kDa définie ci-dessus, ou contre des fragments peptidiques de ladite protéine tels que définis ci-dessus.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation susmentionnée d'anticorps dirigés contre le polypeptide d'environ 23 kDa défini ci-dessus, ou contre des fragments susmentionnés de ce dernier.

L'invention concerne également l'utilisation susmentionnée d'anticorps dirigés contre les séquences peptidiques internes (voir peptides 1, 2, 3, 4, 5 et 6) susmentionnées, ou de fragments tels que définis de ces dernières.

L'invention a encore pour objet l'utilisation susmentionnée de sondes moléculaires choisies parmi les séquences nucléotidiques codant pour une protéine telle que définie ci- dessus, correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S, ou codant pour un fragment peptidique de ladite sous-unité A tel que défini ci-dessus.

Les séquences nucléotidiques susmentionnées sont utilisées en tant que sondes, de préférence marquées, capables d'hybrider spécifiquement avec la séquence codant pour la sous-unité A de la globuline 11 S des semences de plantes, ou la séquence codant pour le fragment peptidique d'environ 23 kDa défini ci-dessus.

L'invention a plus particulièrement pour objet l'utilisation des sondes moléculaires protéiques ou nucléiques définies ci-dessus, pour la mise en oeuvre de procédés de détection,

et, le cas échéant, d'extraction de la protéine correspondant à la sous-unité A de la globuline IlS dans les semences, ou de fragments peptidiques de cette dernière, notamment dans le cadre de la mise en oeuvre de méthodes permettant de déterminer si des semences sont en phase de prégermination ou non, et le cas échéant, le suivi de la prégermination de semences par détermination du stade de prégermination et de la capacité germinative de ces dernières.

A cet égard, l'invention concerne l'utilisation des sondes moléculaires protéiques ou nucléiques définies ci-dessus, pour la détection de la sous-unité A de la globuline 11 S, ou de fragments peptidiques de cette dernière, dans les semences de plantes choisies parmi les solanacées, les cucurbitacées, les ombellifères, les valérianacées, les composées, les brassicacées et les chénopodiacées, et plus particulièrement chez la tomate, notamment chez Lycopersicon esculentum.

L'invention concerne plus particulièrement l'utilisation des sondes moléculaires susmentionnées, pour la détection de la sous-unité A de la globuline 11 S d'environ 37 kDa définie ci-dessus, ou de fragments peptidiques de cette sous-unité A spécifiques des semences prégermées, tels que le polypeptide d'environ 23 kDa défini ci-dessus.

L'invention a également pour objet un procédé de détection, et le cas échéant d'extraction, de la sous-unité A de la globuline 11 S chez les semences de plantes, ou d'un fragment tel que défini ci-dessus de cette dernière, caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'extraction des protéines des semences de ces plantes, suivie d'une étape de détection de la sous-unité A de la globuline 11S, ou d'un fragment peptidique de cette dernière, effectuée au moyen de sondes moléculaires définies ci-dessus et, le cas échéant, l'extraction et la purification de ladite sous-unité A ainsi détectée, ou d'un fragment de cette dernière.

L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de suivi de la phase de prégermination de semences de plantes, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de détection de la sous-unité A de la globuline 11 S de semences de plantes, ou de fragments peptidiques tels que définis ci-dessus de cette dernière, dans les semences au cours de la phase de prégermination de ces dernières, à l'aide d'un marqueur moléculaire défini ci-dessus.

L'invention concerne plus particulièrement les procédés susmentionnés, caractérisés en ce qu'ils comprennent une étape de détection de la protéine d'environ 37 kDa telle que décrite ci-dessus, et/ou d'un fragment peptidique de cette protéine, et plus particulièrement une étape de détection du polypeptide d'environ 23 kDa tel que décrit ci-dessus.

Avantageusement les procédés susmentionnés permettent de déterminer si des semences sont en phase de prégermination ou non, et, le cas échéant, permettent le suivi de la prégermination de semences par détermination du stade de prégermination et de la capacité germinative de ces dernières.

Un procédé avantageux dans le cadre de la présente invention, est caractérisé en ce qu'il comprend une étape d'extraction en phase aqueuse des protéines des semences des plantes, suivie d'une étape de détection de la présence éventuelle du polypeptide d'environ 23 kDa de la sous-unité A de la globuline 11 S dans la phase aqueuse d'extraction susmentionnée, et le cas échéant, de quantification dudit polypeptide par rapport à la quantité totale de ladite sous- unité A présente dans lesdites semences, ladite détection ou quantification étant effectuée au moyen de sondes moléculaires définies ci-dessus.

Un procédé préféré selon la présente invention, est caractérisé en ce que la détection, et le cas échéant, la quantification de la sous-unité A de la globuline 11 S, ou d'un ou des fragments de ladite sous-unité A, sont effectuées au moyen d'anticorps dirigés contre la protéine d'environ 37 kDa définie ci-dessus, ou contre des fragments peptidiques de ladite protéine tels que définis ci-dessus, et notamment contre le polypeptide d'environ 23 kDa défini ci-dessus et/ou contre les séquences peptidiques internes définies ci-dessus, dans le cadre d'un test ELISA.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation de semences prégermées, ledit procédé comprenant la mise en oeuvre d'un procédé de prégermination de semences, selon les méthodes classiques dans ce domaine mentionnées ci-dessus, en association avec un procédé de suivi de la phase de prégermination tel que décrit ci-dessus.

L'invention a plus particulièrement pour objet un procédé de préparation de semences prégermées tel que décrit ci-dessus, dans lequel le procédé de prégermination des semences est arrté, notamment par déshydratation des semences, lorsque l'on détecte, dans le cadre du procédé de suivi de la phase de prégermination, une quantité de sous-unité A de la globuline 11 S, ou de fragments peptidiques de cette sous-unité A solubles en phase aqueuse, notamment une quantité du polypeptide de 23 kDa susmentionné, représentant environ 25% à environ 30% de la quantité de sous-unité A susmentionnée initialement présente dans les semences avant prégermination.

L'invention concerne également les procédés tels que décrits ci-dessus, mis en oeuvre à partir de semences de plantes listées ci-dessus, et plus particulièrement à partir de semences de tomate, notamment de Lycopersicon esculentum.

L'invention a également pour objet les semences prégermées telles qu'obtenues par un procédé décrit ci-dessus.

L'invention concerne plus particulièrement un lot homogène de semences prégermées à un stade déterminé tel qu'obtenu par mise en oeuvre d'un procédé susmentionné, dans lequel la prégermination est arrtée à un stade déterminé, le lot étant caractérisé en ce que lesdites semences sont à un mme stade déterminé de prégermination.

Le terme « lot homogène de semences » désigne des semences proches dans leur caractéristiques germinatives, à potentiel élevé de germination, et dont la germination est synchrone en conditions d'utilisation.

A titre d'exemple la prégermination est notamment arrtée au stade où la quantité de fragments polypeptidiques de la sous-unité A de la globuline 11 S solubles en phase aqueuse, notamment la quantité du polypeptide de 23 kDa susmentionné, représente environ 25% à environ 30% de la quantité de sous-unité A susmentionnée initialement présente dans les semences avant prégermination.

L'invention concerne plus particulièrement les semences prégermées susmentionnées, notamment sous forme déshydratée, telles qu'obtenues selon les procédés susmentionnés mis en oeuvre à partir de semences de plantes listées ci-dessus, et plus particulièrement à partir de semences de tomate, notamment de Lycopersicon esculentum.

L'invention a également pour objet une protéine correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S de semences, ayant un poids moléculaire d'environ 37 kDa, et comprenant au moins une des séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK (peptide 1), QGDIIAFPAGAAH (peptide 2), IESEGGYTEVWD (peptide 4), GLISVINPGCAE (peptide 5) et RFESEAGWEFWDATQ (peptide 6), ou toute séquence dérivée des séquences précédentes par substitution, élimination, ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence dérivée étant susceptible d'engendrer la formation d'anticorps reconnaissant la sous-unité A susmentionnée, et/ou reconnaissant un fragment de ladite sous-unité A, ledit fragment étant présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, tel qu'un fragment d'environ 23 kDa.

L'invention a plus particulièrement pour objet une protéine telle que définie ci-dessus correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S de semences de plantes choisis parmi les solanacées, les cucurbitacées, les ombellifères, les valérianacées, les composées, les brassicacées et les chénopodiacées, et notamment de semences de tomate, telles que Lycopersicon esculentum.

L'invention a également pour objet les fragments peptidiques susmentionnés d'environ au moins 5 acides aminés des protéines définies ci-dessus correspondant à la sous-unité A de la globuline 11S, permettant d'obtenir par immunisation d'un animal approprié des anticorps reconnaissant spécifiquement la sous-unité A de la globuline 11 S des semences de plantes, ou reconnaissant spécifiquement des fragments peptidiques de ladite sous-unité A, tel qu'un fragment peptidique d'environ 23 kDa de la sous-unité A présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination.

L'invention concerne plus particulièrement les fragments peptidiques susmentionnés d'au moins environ 5 acides aminés de la protéine d'environ 37 kDa définie ci-dessus, tels qu'obtenus par traitement de cette protéine à l'aide d'enzymes de restriction appropriées, et purification des fragments obtenus.

L'invention a plus particulièrement pour objet le fragment peptidique défini ci-dessus, correspondant à un polypeptide de poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : -est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, -est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées.

En outre, le polypeptide de 23 kDa environ défini ci-dessus, est caractérisé en ce qu'il comprend les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK (peptide 1), QGDIIAFPAGAAH (peptide 2) et GFYGIMNSGCPETFQ (peptide 3) ou toute séquence dérivée des séquences précédentes par substitution, élimination, ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, telle que définie ci-dessus.

Le polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné est davantage caractérisé en ce qu'il représente un fragment de la protéine d'environ 37 kDa définie ci-dessus, ce fragment étant tel qu'obtenu par extraction à partir de semences prégermées de plantes telles que définies ci-

dessus, et plus particulièrement par extraction à partir de semences de tomate, notamment de Lycopersicon esculentum.

L'invention a également pour objet les fragments d'environ au moins 5 acides aminés tels que définis ci-dessus, du polypeptide d'environ 23 kDa susmentionné.

L'invention concerne également les fragments peptidiques choisis parmi ceux correspondant à l'une des séquences peptidiques internes (voir peptides 1, 2, 3, 4, 5 et 6) définies ci-dessus, ou toute séquence dérivée des séquences précédentes par substitution, élimination, ou addition d'un ou plusieurs acides aminés telle que définie ci-dessus, ou tout fragment d'au moins environ 5 acides aminés de l'une de ces séquences peptidiques internes ou de leurs séquences dérivées, lesdits fragments définis ci-dessus étant susceptibles d'engendrer la formation d'anticorps reconnaissant une protéine d'environ 37 kDa telle que définie ci-dessus, ou un fragment peptidique tel que défini ci-dessus.

L'invention a également pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux dirigés contre la sous-unité A de la globuline 11 S de semences, et plus particulièrement contre la protéine d'environ 37 kDa ou les fragments peptidiques définis ci-dessus.

L'invention concerne plus particulièrement les anticorps reconnaissant une protéine telle que définie ci-dessus correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S de semences de plantes, telles que les solanacées, les cucurbitacées, les ombellifères, les valérianacées, les composées, les brassicacées et les chénopodiacées, et notamment de semences de tomate, et/ou les anticorps reconnaissant un ou des fragments susmentionnés de ladite protéine.

A cet égard, l'invention a plus particulièrement pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux caractérisés en ce qu'ils reconnaissent : * une protéine correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S de semences, présentant un poids moléculaire d'environ 37 kDa, et comprenant les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK (peptide 1), QGDIIAFPAGAAH (peptide 2), IESEGGYTEVWD (peptide 4), GLISVINPGCAE (peptide 5) et RFESEAGVVEFWDATQ (peptide 6) et/ou * un fragment peptidique d'au moins environ 5 acides aminés de la protéine correspondant à la sous-unité A d'environ 37 kDa ci-dessus définie, et/ou * un fragment peptidique correspondant à l'une des séquences peptidiques internes ci- dessus définies, ou à un fragment d'au moins environ 5 acides aminés desdites séquences peptidiques internes.

Les anticorps décrits ci-dessus sont tels qu'obtenus par immunisation d'un animal approprié à l'aide d'une protéine d'environ 37 kDa telle que définie ci-dessus, ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ou à l'aide d'une séquence peptidique dérivée de ladite protéine ou dudit fragment peptidique par substitution, élimination ou addition d'un ou plusieurs acides aminés, ladite séquence peptidique dérivée étant capable d'engendrer la formation d'anticorps reconnaissant spécifiquement la sous-unité A de la globuline 11 S des plantes, ou reconnaissant spécifiquement des fragments peptidiques de ladite sous-unité A, tel qu'un fragment peptidique d'environ 23 kDa de la sous-unité A présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination..

L'invention a également pour objet les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, caractérisés en ce qu'ils reconnaissent : * un fragment peptidique de la protéine d'environ 37 kDa telle que définie ci-dessus, ledit fragment correspondant à un polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, ledit polypeptide étant caractérisé en ce qu'il : -est présent dans les semences prégermées de plantes, mais pas dans les semences témoins avant prégermination, -est soluble dans l'eau, et est retrouvé dans la fraction des protéines solubles extraites dans l'eau à partir des semences prégermées, -comprend les séquences peptidiques internes suivantes : IQAEAGVTELWDK (peptide 1), QGDIIAFPAGAAH (peptide 2) et GFYGIMNSGCPETFQ (peptide 3) et/ou, * un fragment peptidique d'au moins environ 5 acides aminés du polypeptide d'environ 23 kDa tel que défini ci-dessus et/ou, * un fragment peptidique correspondant à l'une des séquences peptidiques internes ci- dessus définies, ou à un fragment d'environ au moins 5 acides aminés desdites séquences peptidiques internes.

Les anticorps décrits ci-dessus sont tels qu'obtenus par immunisation d'un animal approprié à l'aide d'un polypeptide d'environ 23 kDa tel que défini ci-dessus ou d'un fragment peptidique tel que défini ci-dessus, ou à l'aide d'une séquence peptidique dérivée telle que définie ci-dessus dudit polypeptide ou dudit fragment peptidique.

Avantageusement, les anticorps polyclonaux susmentionnés sont obtenus par immunisation d'un animal avec une protéine telle que définie ci-dessus, ou un fragment peptidique de ladite protéine, ou une séquence peptidique dérivée de ladite protéine ou dudit

fragment, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, notamment par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixée un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment une protéine ou un fragment peptidique de ladite protéine, ou une séquence peptidique dérivée de ladite protéine ou dudit fragment, tels que définis ci-dessus selon l'invention.

Les anticorps monoclonaux selon l'invention peuvent tre obtenus par la technique des hybridomes dont le principe général est rappelé ci-après.

Dans un premier temps, on immunise un animal, généralement une souris (ou des cellules en culture dans le cadre d'immunisations in vitro), avec une protéine telle que définie ci-dessus, ou un fragment peptidique de ladite protéine, ou une séquence peptidique dérivée de ladite protéine ou dudit fragment, ou un fragment de ces dernières séquences, tels que définis ci-dessus selon l'invention, contre lesquels les lymphocytes B de l'animal sont alors capables de produire des anticorps. Ces lymphocytes producteurs d'anticorps sont ensuite fusionnés avec des cellules myélomateuses"immortelles" (notamment murines) pour donner lieu à des hybridomes. A partir du mélange hétérogène des cellules ainsi obtenu, on effectue alors une sélection des cellules capables de produire un anticorps particulier et de se multiplier indéfiniment. Chaque hybridome est multiplié sous la forme de clones, chacun conduisant à la production d'un anticorps monoclonal dont les propriétés de reconnaissance vis-à-vis de ladite protéine, ou d'un fragment peptidique de ladite protéine, ou d'une séquence peptidique dérivée de ladite protéine ou dudit fragment, pourront tre testées par exemple en ELISA, par immunotransfert en une ou deux dimensions, en immunofluorescence, ou à l'aide d'un biocapteur. Les anticorps monoclonaux ainsi sélectionnés, sont par la suite purifiés notamment selon la technique de chromatographie d'affinité décrite ci-dessus.

L'invention concerne également toute séquence nucléotidique codant pour une protéine ou un fragment peptidique tels que définis ci-dessus.

L'invention a également pour objet une trousse ou kit pour la mise en oeuvre d'un procédé tel que défini ci-dessus, contenant : * une protéine définie ci-dessus correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S de semences, notamment la protéine ayant un poids moléculaire d'environ 37 kDa, et comprenant les séquences peptidiques internes suivantes IQAEAGVTELWDK (peptide 1),

QGDIIAFPAGAAH (peptide 2), IESEGGYTEVWD (peptide 4), GLISVINPGCAE (peptide 5) et RFESEAGVVEFWDATQ (peptide 6), et/ou * un fragment peptidique tel que défini ci-dessus de la protéine susmentionnée, ledit fragment correspondant à un polypeptide présentant une taille d'au mois environ 5 acides aminés, notamment un fragment susmentionné correspondant au polypeptide ayant un poids moléculaire d'environ 23 kDa, * et/ou des anticorps tels que décrits ci-dessus, dirigés contre la protéine susmentionnée ou le fragment peptidique susmentionné, * et/ou une séquence nucléotidique telle que définie ci-dessus codant pour la protéine susmentionnée ou pour un fragment peptidique susmentionné, en association avec un ou plusieurs réactifs nécessaires à la mise en oeuvre dudit procédé.

L'invention sera davantage illustrée à l'aide des exemples qui suivent de détection de la protéine correspondant à la sous-unité A de la globuline 11 S de la tomate (protéine d'environ 37 kDa), ainsi que du polypeptide d'environ 23 kDa issu de cette dernière, et à l'aide des figures suivantes.

LEGENDE DES FIGURES Figure 1 : Germination des semences de tomate témoins et prégermées.

Les expériences de germination sont conduites avec cent semences témoins et cent semences prégermées, comme indiqué dans le texte, à une température de 15°C et à l'obscurité. Trois répétitions sont réalisées.

Semences témoins (+) ; semences prégermées (+).

Figure 2 : Analyse par électrophorèse SDS-PAGE des protéines solubles extraites dans l'eau des semences de tomate témoins et prégermées.

La séparation des protéines solubles dans l'eau est effectuée en gel homogène (15% d'acrylamide). Les extraits déposés dans les pistes correspondent à une quantité fixe de semences (7 1 d'extrait correspondant à 0, 41 semence). Les flèches indiquent la migration de la protéine de tomate de 23 kDa environ. Les pistes M correspondent à la migration des

marqueurs moléculaires Bio-Rad précolorés dont les poids moléculaires sont indiqués au centre en kDa. Pistes 1, semences témoins. Pistes 2, semences prégermées. (A) Révélation des protéines au bleu de Coomassie. (B) Immunoblot du gel présenté en (A) et révélation avec les anticorps dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ.

Figure 3 : Test ELISA utilisant les anticorps dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ pour caractériser les extraits de protéines solubles dans l'eau des semences de tomate témoins et prégermées.

Figure 3A : Analyse de la variété Elko.

Les tests ELISA sont réalisés comme indiqué dans le texte en présence de dilutions successives des extraits protéiques de semences de tomate cv Elko (indiquées sur la figure sur la base du nombre de semences utilisé), des anticorps primaires de cobaye dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ et des anticorps secondaires (anticorps anti- immunoglobulines de cobaye faits dans la chèvre) couplés à la peroxydase. La révélation de l'antigène est suivie à 405 nm après ajout des substrats de la peroxydase. Semences témoins (+) ; semences prégermées ().

Figure 3B : Test de présence de la protéine de 23 kDa environ, par méthode ELISA, sur 8 lots de semences de tomate (nommés lots A, B, C, D, E, F, G, H), tous de variétés différentes. Les tests ELISA sont conduits comme indiqué en (A), mais en utilisant une quantité fixe d'extrait de protéines solubles dans l'eau correspondant à 0, 00125 semence.

Semences témoins (D) ; semences prégermées (D).

Figure 4 : Analyse, par test ELISA, de l'évolution de la quantité de protéine de tomate de 23 kDa environ en fonction de la durée de prégermination. Les semences de tomate analysées correspondent à un des lots présentés en Figure 3B (c'est-à-dire les semences du lot D). Elles sont soumises au traitement de prégermination décrit dans le texte pendant 1, 2, 3 et 4 jours. Les semences au temps zéro sont les semences contrôles non traitées.

() Test ELISA utilisant les anticorps dirigés contre la protéine de 23 kDa environ.

Les tests sont conduits comme indiqué dans le texte et dans la Figure 3, en utilisant une quantité fixe d'extrait de protéines solubles dans l'eau correspondant à 0, 00125 semence.

(~) Vitesse de germination. Les semences contrôles et traitées sont mises à germer comme indiqué dans le texte à une température de 15°C. La vitesse de germination est exprimée sur la base du pourcentage de semences germées après 6 jours.

(cri) Germes de taille supérieure à 1 cm dénombrés à 6 jours de germination à 15°C des semences contrôles et traitées.

Figure 5 : Test ELISA utilisant les anticorps dirigés contre la sous-unité B de la globuline 11 S de betterave sucrière pour caractériser les extraits de protéines solubles extraites des semences de betterave sucrière témoins et prégermées et de semences de tomate témoins et prégermées. Les tests ELISA sont réalisés comme indiqué dans le texte en présence de dilutions successives des extraits protéiques (indiquées sur la figure sur la base du nombre de semences utilisé), des anticorps primaires de lapin dirigés contre sous-unité B de la globuline 11 S de betterave sucrière (Job C. et al., 1997 ; WO 97/43418) et des anticorps secondaires (anticorps anti-immunoglobulines de lapin faits dans la chèvre) couplés à la peroxydase. La révélation de l'antigène dans les extraits est suivie à 405 nm après ajout des substrats de la peroxydase.

Semences de betterave sucrière témoins (O) ; semences de betterave sucrière prégermées (N) ; semences de tomate témoins (+) ; semences de tomate prégermées ().

Figure 6 : Test ELISA utilisant les anticorps dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ pour caractériser les extraits de protéines totales extraites en présence de SDS des semences de tomate témoins et prégermées. Les tests ELISA sont réalisés comme indiqué dans le texte en présence de dilutions successives des extraits protéiques (indiquées sur la figure sur la base du nombre de semences utilisé), des anticorps primaires de cobaye dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa et des anticorps secondaires (anticorps anti-immunoglobulines de cobaye faits dans la chèvre) couplés à la peroxydase. La révélation de l'antigène dans les extraits est suivie à 405 nm après ajout des substrats de la peroxydase.

Semences témoins (+) ; semences prégermées (+).

EXEMPLES 1. MISE EN EVIDENCE D'UNE PROTEINE MARQUEUR DE PREGERMINATION CHEZ LA SEMENCE DE TOMATE 1.1 Matériel végétal Les semences témoins et prégermées de tomate (cv Elko) ont été utilisées. La qualité de ces semences est appréciée par des expériences de germination, conduites en boîtes de Pétri carrées de 12 cm (trois répétitions de cent semences par boîte). Dans chaque boîte, les cent semences sont posées sur trois épaisseurs de papier absorbant, imbibées par 8 ml d'eau déminéralisée, et recouvertes d'une quatrième épaisseur de papier absorbant. Puis les boîtes sont recouvertes d'un papier d'aluminium et sont placées en armoire de germination, à l'obscurité, dans une atmosphère à humidité constante de 80% et à une température de 15°C.

Dans ces conditions, les semences témoins et les semences prégermées ont germé à plus de 98% après 6 jours. Les différences observées entre ces deux types de semences portent sur leur profil de germination (Fig. l) : les semences prégermées germent beaucoup plus rapidement (85% au bout de 67 h) que les semences témoins (1, 7% au bout de 67 h). Ce gain de temps traduit l'efficacité du traitement de prégermination utilisé, et représente l'effet physiologique recherché par les semenciers et les agriculteurs.

1.2 Extractions protéiques 1.2. 1 Protéine soluble dans l'eau Des extractions protéiques sont réalisées sur les semences sèches témoins et prégermées (les semences sont prégermées par une méthode classique, connue par l'homme du métier) : cent semences (environ 0, 34 g) sont broyées le plus finement possible à l'aide d'un broyeur Retsch ISO-9001 pendant 1 minute. La poudre est reprise dans 1, 7 ml d'eau distillée (c'est-à- dire cinq fois le poids des semences au départ) et mise sous agitation à 4°C pendant 15 minutes. Ceci permet d'extraire les protéines solubles dans l'eau. L'échantillon est ensuite centrifugé à 9000 g pendant 10 minutes à la température de 5°C. Le surnageant, qui contient les protéines solubles est récupéré, clarifié par une nouvelle centrifugation de 10 minutes à 35000 g et à 5°C, puis conservé sous forme de fractions aliquotes à-20°C. La réalisation

d'une extraction dans les mmes conditions mais en présence de SDS 2% (agent dénaturant des protéines et des macromolécules) permet d'obtenir les protéines totales.

La quantité de protéines contenues dans les extraits solubles est dosée suivant la méthode colorimétrique de Bradford (1976).

Les protéines sont séparées par électrophorèse SDS-PAGE selon la méthode de Laemli (1970) avec appareillage Mighty Small II SE250 (Hoefer Scientific Instruments, San Fransisco). Les échantillons sont mélangés avec le tampon de charge [Tris-HCl 10 mM, pH 7, 8, EDTA 1 mM, 2. 5% (v/v) SDS, dithiothreitiol (DTT) 50 mM et bleu de bromophénol 0.01% (p/v)], chauffés à 100°C pendant 5 minutes et chargés sur les gels de polyacrylamide (gels homogènes à 15% de polyacrylamide).

1.2. 2 Protéine totale Les protéines totales sont extraites comme décrit ci-dessus au paragraphe 1. 2. 1, pour les protéines solubles dans l'eau, mais en reprenant la poudre dans de l'eau, en présence d'un agent dénaturant des protéines, le SDS (sodium dodécyl sulfate) à 2% (p/v).

Les protéines sont ensuite soumises à une électrophorèse en gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes en présence de SDS et d'un agent réducteur des ponts disulfures, le DTT. Après séparation électrophorétique, les protéines du gel sont colorées à l'aide du colorant spécifique des protéines, le GelCode (Interchim).

1.3 Résultats Les résultats obtenus sont décrits ci-dessous.

1.3. 1 Protéine soluble dans l'eau L'analyse des extraits protéiques par électrophorèse SDS-PAGE montre une protéine de 23 kDa environ présente en plus grande quantité dans les extraits de semences prégermées (Fig. 2A). Ces données ont été vérifiées sur plusieurs variétés de semences de tomate, pour confirmation.

1.3. 2 Protéine totale Une protéine d'environ 37 kDa, très abondante, a été repérée puis électroéluée du gel.

1.4 Prégermination des semences en présence de PEG

La méthode utilisée est celle de Bino et al. (1992). Elle est réalisée en utilisant une solution de polyéthylène glycol (PEG-6000) à un potentiel osmotique de-1, 0 MPa (Michel et Kaufmann, 1973). Deux cents semences de tomate sont placées dans deux boîtes de Pétri (12 x 12 cm x 1, 2 cm) sur trois épaisseurs de papier absorbant imbibées de 8 ml de la solution de PEG-6000. Les semences sont recouvertes par une quatrième épaisseur de papier absorbant, puis quatre ml de solution de la solution de PEG-6000 sont rajoutés. Les boîtes sont fermées hermétiquement, entourées d'un papier d'aluminium et placées en armoire climatique à 20°C et à l'obscurité pendant 4 jours. Après le traitement, les semences sont rincées rapidement à l'eau déminéralisée puis pesées. Enfin, elles sont mises à sécher à température ambiante pendant 24 heures. Les tests de germination réalisés sur les semences de tomate témoins et prégermées par l'imbibition en présence de PEG ont montré d'une part que les semences ont toutes une bonne capacité germinative (98% de germination à 6 jours) et d'autre part que les semences prégermées avec le PEG ont germé plus rapidement (au bout de 67 heures : 85%) que les semences témoins (1, 7% au bout de 67 h) (Fig. 1).

En conclusion, ce procédé de prégermination des semences de tomate a mis en évidence la présence d'une protéine de 23 kDa environ soluble dans l'eau, caractéristique des semences prégermées ; cet événement est concomitant d'une augmentation nette de la vigueur germinative, effet biologique de la prégermination.

2. PURIFICATION DES PROTEINES ET OBTENTION D'ANTICORPS SPECIFIQUES 2.1 Purification de la protéine de 23 kDa et obtention d'anticorps spécifiques La préparation d'un extrait protéique soluble dans l'eau est réalisée à partir de 20 g de semences de tomate prégermées comme précédemment décrit. L'extrait protéique obtenu est ensuite résolu sur gel de polyacrylamide 15% en conditions dénaturantes, selon la technique de Laemli (1970), avec appareillage d'électrophorèse Bio-Rad Protean (Bio-Rad). L'extrait est déposé dans un puits unique du gel en positionnant de part et d'autre du dépôt des marqueurs de poids moléculaire précolorés (Bio-Rad). La migration est effectuée à 50 mA pendant 5 heures. La bande de gel contenant la protéine d'intért, repérée à l'aide des marqueurs moléculaires, est découpée ; la protéine est ensuite électro-éluée du gel à l'aide d'un tampon Tris 50 mM, glycine 384 mM, SDS 0, 1% pendant 4 heures à 10 mA. Après analyse SDS-

PAGE sur gel 15% de la pureté de la protéine, les phases de résolution sur gel de polyacrylamide et d'électro-élution sont réitérées jusqu'à l'obtention d'une quantité suffisante de la protéine cible pure.

Des anticorps de cobaye anti-protéine de tomate de 23 kDa environ ont été obtenus selon un protocole standard (Roitt et al., 1985), à partir de 600 ig de cette protéine de tomate.

Après trois injections successives et récupération du sérum, des tests ELISA (qualité et détermination du titre) ainsi qu'un test immunoblot (spécificité vis-à-vis de la protéine de tomate) ont été réalisés. Le sérum pré-immun sert de contrôle. La détermination du titre anticorps utilise un test ELISA, dans lequel la protéine de 23 kDa environ de tomate est déposée en quantité constante de l'ordre de 10 ng dans chaque cupule de la plaque de microtitration ; la première incubation est réalisée en présence de sérum immun à une dilution initiale de 1/50 puis à des dilutions successives en cascade au l/2 à partir de cette solution initiale ; viennent ensuite la deuxième incubation en présence de l'anticorps de chèvre anti- immunoglobuline de cobaye couplé à la peroxydase et la révélation de l'antigène en présence des substrats de la peroxydase [1. 8 mM d'acide 2, 2'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonique) (ABTS ; Aldrich), et 3x10-3% (v/v) d'H202 (Sigma) dans un tampon citrate- phosphate 0, 1 M, pH 4, 0]. Le sérum pré-immun (témoin) ne reconnaît pas la protéine d'intért et le titre anticorps correspond à une dilution du sérum de 1/10000°.

L'analyse Western blot est effectuée après transfert des protéines contenues dans le gel SDS-PAGE sur une membrane de nitrocellulose (Gelman Sciences), par élecrotransfert semi- sec à 300 mA pendant deux heures. Les membranes sont rincées deux fois pendant 5 minutes dans du tampon TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7, 5), puis incubées pendant 1 heure à 25°C dans du TBS contenant 1% (v/v) de la « Blocking Solution » (Boehringer Mannheim).

Après incubation pendant 1 heure avec les anticorps dirigés contre la protéine de tomate de 23 kDa environ (dilution 1 : 100000 dans du TBS contenant 0. 5% de Blocking Solution), les membranes sont rincées deux fois pendant 10 minutes dans du TBS contenant 0. 1% de Tween 20 et deux fois pendant 10 minutes dans du TBS contenant 0. 5% de « Blocking Solution », puis incubées pendant 30 minutes avec les anticorps secondaires conjugués à la peroxydase de raifort [anticorps anti-immunoglobulines de cobaye faits dans la chèvre (Sigma) ; dilution 1 : 5000 dans du TBS contenant 0. 5% de « Blocking Solution »]. Après quatre lavages comme décrit ci-dessus, les membranes sont incubées avec le kit « BM chemiluminescence » de

Boehringer Mannheim selon les instructions du fabricant, ce qui permet la révélation de l'antigène.

L'analyse des résultats (Fig. 2B) a bien montré la spécificité de l'anticorps pour sa protéine cible, présente en plus forte quantité dans les semences prégermées que dans les semences témoins.

2.2 Purification de la protéine de 37 kDa et obtention d'anticorps spécifiques Le protocole mis en oeuvre dans le paragraphe 2. 1 ci-dessus pour la purification de la protéine de tomate de 23 kDa environ a été utilisé pour purifier celle de 37 kDa environ.

La protéine isolée de 37 kDa environ a été utilisée pour fabriquer chez un lapin des anticorps polyclonaux spécifiques. Les anticorps de lapin anti-protéine de tomate de 37 kDa environ ont été obtenus selon un protocole standard (Roitt et al., 1985). Ces nouveaux anticorps ont un titre d'environ 1/5000.

3. DEVELOPPEMENT D'UN TEST ELISA 3.1 Développement d'un test ELISA avec les anticorps dirigés contre la protéine de 23 kDa environ Le but recherché est de mesurer et comparer le niveau de la protéine dans les semences témoins et les semences prégermées en utilisant un test immunoenzymatique de type ELISA.

A cet effet, l'extrait protéique obtenu dans l'eau de chaque lot de semences est dilué de la façon suivante : l'extrait le plus concentré correspond à un nombre de semences donné (0,029 semence) dilué dans 250 Fil de PBS (tampon phosphate de sodium 10 mM, NaCl 150 mM). Ensuite, 10 dilutions successives au demi sont préparées à partir de l'extrait le plus concentré, et 100 zip de chacune sont transférés dans des plaques de microtitration ELISA 96 puits (plaques ELISA Microlon Greiner). Les puits de la 12ème colonne contiennent uniquement du PBS (témoin). Les étapes de l'immunomarquage sont les suivantes : 5 lavages en PBS, 0, 05% Tween 20 (Sigma) ; incubation 20 minutes à 35°C avec la solution d'anticorps primaire diluée au 1/10000° dans du PBS ; 5 lavages en PBS Tween 0, 05% ; incubation 20 minutes à 35°C avec la solution d'anticorps secondaires (anticorps de chèvre anti- immunoglobulines de cobaye couplés à la peroxydase, Sigma) diluée au 1/5000° ; 5 lavages en PBS Tween 0, 05%. La microplaque est révélée par l'addition d'une solution contenant les substrats de la peroxydase susmentionnés. La reconnaissance spécifique antigène-anticorps

primaires se traduit par l'apparition d'une coloration verte (métabolisation de l'ABTS par la peroxydase en présence d'H202) dont l'intensité est proportionnelle à la quantité d'antigène dans l'extrait. Les valeurs d'absorbance sont mesurées à 405 nm (A405) avec un lecteur de microplaques (EL340 ; Bio-Tek Instruments) et analysées sur ordinateur Macintosh LC III.

Les valeurs d'absorbance mesurées pour les extraits protéiques solubles des semences prégermées sont très supérieures à celles des semences témoins (Fig. 3A), ce qui confirme bien les résultats obtenus avec l'analyse des protéines sur gel de polyacrylamide (Fig. 2B).

Le test ELISA mis en place a donc permis de distinguer les semences témoins des semences prégermées de tomate, lorsque les extractions sont réalisées dans de l'eau distillée.

D'autres mesures ont été effectuées sur des lots de semences de tomate supplémentaires, afin de valider le test et la quantification des résultats a montré que, dans tous les cas, les valeurs d'absorbance mesurée à 405 nm pour les semences prégermées sont supérieures à celles mesurées pour les semences témoins (Fig. 3B). Enfin, le test ELISA a été utilisé pour suivre, en fonction de la durée du traitement de prégermination, l'accumulation de la protéine de 23 kDa environ dans les extraits de protéines solubles. Les résultats de la Figure 4 montrent bien que cette accumulation est étroitement corrélée avec l'augmentation de la vigueur germinative des semences.

3.2 Développement d'un test ELISA avec les anticorps dirigés contre la protéine de 37 kDa environ Utilisés dans des tests ELISA tels que décrits ci-dessus, les anticorps dirigés contre la protéine de 37 kDa environ donnent les mmes résultats que ceux obtenus en utilisant les anticorps dirigés contre le fragment de 23 kDa environ issu de la forme mature de la sous- unité A de la globuline 11 S de tomate. En particulier, ils révèlent tous deux la solubilisation dans l'eau de la protéine de 23 kDa au cours des traitements de prégermination de semences de tomates tels que décrits dans la figure 1. Ces résultats indiquent l'existence d'épitopes communs entre les protéines de 23 kDa environ et les protéines de 37 kDa environ.

4. IDENTIFICATION DE LA PROTEINE DE 23 kDa ENVIRON La protéine de 23 kDa environ est purifiée à partir d'un extrait de semences de tomate prégermées (protéines solubles dans l'eau) par électrophorèse SDS-PAGE, ainsi qu'indiqué

ci-dessus. La protéine est révélée par coloration au noir amido. La portion de gel contenant la protéine est découpée et la protéine est extraite en présence d'un tampon contenant du Tris- HC1 50 mM (pH 8, 6) et du Tween 20 à 0. 01%. La protéine est digérée par ajout de 0, 2 llg de trypsine coupant après les résidus de lysine et d'arginine. Le mélange de peptides obtenus est séparé par chromatographie HPLC sur colonne de DEAE C18 de 2. 1 mm de diamètre. Le gradient de séparation est un gradient d'acétonitrile (2-45%) dans de l'acide trifluoroacétique (TFA) 0. 1%. Les peptides présentant un profil d'élution symétrique (critère de pureté) sont sélectionnés arbitrairement et analysés par séquençage des acides aminés selon la dégradation d'Edman (Edman, 1956) au moyen d'un séquenceur PE Applied Biosystem piloté par un ordinateur MacIntosh. La recherche d'homologies de séquence est effectuée sur Internet par criblage de banques de données de séquences protéiques avec les programmes FASTA et BLAST.

Les résultats obtenus sont les suivants. Trois peptides internes, nommés peptides 1, 2 et 3, ont respectivement pour séquence IQAEAGVTELWDK (peptide 1), QGDIIAFPAGAAH (peptide 2) et GFYGIMNSGCPETFQ (peptide 3). Le criblage de banques de données de séquences avec les programmes FASTA et BLAST indique que les peptides 1, 2 et 3 issus de la protéine de 23 kDa environ de semences de tomate prégermées sont homologues de motifs rencontrés chez les globulines 11 S de plusieurs espèces. Ces homologies sont rencontrées dans la partie correspondant au polypeptide acide (sous-unité A) des précurseurs des globulines 11 S. Ce résultat est donc différent de celui obtenu pour la prégermination des semences de betterave sucrière, puisque dans ce dernier cas seule la solubilisation de la sous- unité B de la globuline 11 S avait été mise en évidence (Job C. et al., 1997 ; WO 97/43418).

D'ailleurs, les anticorps dirigés contre la sous-unité B de la globuline 11 S de betterave sucrière ne montrent aucune réactivité croisée avec les extraits de protéines solubles de semences de tomates, qu'elles soient témoins ou prégermées (Fig. 5). Des contrôles sont effectués en parallèle avec les extraits de protéines solubles de semences témoins et prégermées de semences de betterave sucrière, obtenus tel que décrit précédemment (Job C. et a/., 1997 ; WO 97/43418). L'analyse des résultats (Fig. 5) a bien montré l'efficacité des anticorps anti-sous-unité B de la globuline 11 S pour différencier les semences témoins et prégermées de betterave sucrière et leur inadéquation pour caractériser la prégermination des semences de tomate.

En conclusion, la protéine de 23 kDa environ isolée de semences de tomate prégermées correspond à la sous-unité A de la globuline 11 S de tomate. Seules les semences prégermées montrent cette sous-unité dans la fraction des protéines solubles, extraites dans l'eau. Par contre, les tests ELISA réalisés sur les protéines totales (c'est-à-dire extraites en présence de SDS) ont montré que cette sous-unité était présente en égale quantité dans les semences de tomate témoins et prégermées (Fig. 6). La réalisation de tests ELISA simultanés sur les protéines solubles et totales de semences de tomate permet d'estimer que, dans les conditions de prégermination utilisées dans ce travail (osmoconditionnement en présence de PEG-1, 0 MPa pendant 4 jours à 20°C), environ 25 à 30% de la totalité de la sous-unité A de la globuline 11 S de tomate est solubilisée pendant la prégermination.

5. IDENTIFICATION DE LA PROTEINE DE 37 kDa ENVIRON L'identité de la protéine de 37 kDa environ a été mise en évidence par séquençage des acides aminés (dégradation d'Edman) selon le protocole décrit au paragraphe 4 ci-dessus pour identifier la protéine de 23 kDa environ.

Les cinq séquences peptidiques suivantes ont été obtenues : IQAEAGVTELWDK (peptide 1 précédemment défini), IESEGGYTEVWD (peptide 4), GLISVINPGCAE (peptide 5), RFESEAGVVEFWDATQ (peptide 6) et QGDIIAFPAGAAH (peptide 2 tel que défini précédemment).

La comparaison de ces séquences peptidiques avec celles contenues dans les banques de données (programme BLAST au « National Center for Biotechnology Information ») a permis d'attribuer sans aucune ambiguïté toutes ces séquences à la sous-unité A de la globuline 11 S de diverses espèces végétales. Cette recherche indique en outre que les séquences des sous-unités A de ces différentes espèces végétales sont proches mais différentes de celles obtenues pour la tomate : les cinq séquences susnommées issues de la protéine de tomate de 37 kDa environ sont donc originales. Par ailleurs, ces banques de données ne renferment aucune autre séquence protéique ou nucléique de la sous unité A de la globuline 11 S de tomate.

L'examen des homologies données par le programme BLAST indique que la première séquence obtenue (IQAEAGVTELWDK) (peptide 1) est localisée approximativement entre les acides aminés 38 à 78 de la sous-unité A des espèces répertoriées (l'acide aminé n° 1 est

en position N-terminale, la séquence étant lue vers l'extrémité C-terminale de la protéine qui comprend environ 370 résidus d'après la masse moléculaire établie expérimentalement, et qui est voisine de 37 kDa). La localisation entre les acides aminés 38 à 78 signifie que, parmi toutes les sous-unités A répertoriées dans les banques de données, la séquence (IQAEAGVTELWDK) peut tre située dans les différentes régions situées depuis la position (38 à 51) d'une sous-unité A d'une espèce donnée, jusqu'à la position (65 à 78) de la sous- unité A d'une autre espèce donnée. Ces différentes positions sont attribuables au fait que les sous-unités A de différentes espèces sont homologues, mais n'ont pas exactement la mme longueur.

La deuxième séquence (IESEGGYTEVWD) (peptide 4) est localisée approximativement entre les acides aminés 44 à 70 de la sous unité A des espèces répertoriées.

La troisième séquence (GLISVINPGCAE) (peptide 5) est localisée approximativement entre les acides aminés 95 à 120 de la sous unité A des espèces répertoriées.

La quatrième séquence (RFESEAGWEFWDATQ) (peptide 6) est localisée approximativement entre les acides aminés 48 à 73 de la sous unité A des espèces répertoriées.

La cinquième séquence (QGDIIAFPAGAAH) (peptide 2) est localisée approximativement entre les acides aminés 155 à 175 de la sous unité A des espèces répertoriées.

Ces données démontrent donc bien que la protéine isolée de tomate, de masse moléculaire de 37 kDa environ, et contenant les cinq séquences peptidiques susnommées, correspond bien à la sous unité A de la globuline 11 S de tomate. Enfin, il convient de noter que parmi les cinq séquences, deux séquences, à savoir IQAEAGVTELWDK (peptide 1) et QGDIIAFPAGAAH, sont identiques à deux des séquences peptidiques contenues dans la protéine susnommée de tomate de 23 kDa environ. Cette dernière protéine correspond donc à un fragment (de 23 kDa environ) de la sous unité A mature (de masse moléculaire 37 kDa environ) de tomate. Les données de séquence indiquent de plus que ce fragment de 23 kDa recouvre la partie N-terminale de la sous unité mature, s'étalant au moins jusqu'aux acides aminés approximativement en positions 155 à 175 des sous unités A des espèces répertoriées.

Le peptide 3, de séquence GFYGIMNSGCPETFQ, précédemment obtenu lors de l'identification de la protéine de 23 kDa environ, est probablement présent dans la protéine de

37 kDa environ : cependant, ce peptide n'a pour l'instant pas été analysé par séquençage.

Les expériences décrites ci-dessus ont donc permis d'isoler la protéine de 37 kDa environ, qui correspond à la forme mature de la sous unité A de la globuline 11 S de tomate, et qui est la forme précurseur de la protéine de 23 kDa environ.

6. DETECTION DE LA SOUS-UNITE A DE SEMENCES DE PIMENTS DANS LA FRACTION DES PROTEINES SOLUBLES DANS L'EAU Les anticorps anti-sous-unité A de tomate tels que précédemment définis, dirigés respectivement contre la protéine de 37 kDa environ et contre le fragment de 23 kDa environ, ont été utilisés dans le cas de semences de piments témoins et prégermées, tels que décrits à la figure 1.

Les résultats obtenus montrent que : -les anticorps anti-protéine de tomate de 37 kDa environ et de 23 kDa environ reconnaissent la sous-unité A de la globuline 11 S de piment, -le niveau de sous-unité A soluble dans l'eau est différent dans les semences témoins et dans les semences prégermées.

Les anticorps anti-sous-unité A de tomate, dirigés respectivement contre la protéine de 37 kDa environ et contre le fragment de 23 kDa environ, sont donc utilisables dans le suivi des traitements de prégermination appliqués aux semences de piments.

REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Bewley JD et Black M (1994) Seeds. Physiology of development and germination.

Second edition. Plenum Press, New York Bino, R. J., De Vries, J. N., Kraak, H. L. et Van Pijlen, J. G. (1992) Flow cytometric détermination of nuclear replication stages in tomato seeds during priming and germination.

Annals of Botany 69, 231-236.

Bradford, M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantification of microgram quantities of protein using the principle of protein dye binding. Analytical Biochemistry 72, 248-254.

Bradford, KJ. (1986) Manipulation of seed water relations via osmotic priming to improve germination under stress conditions. HortScience 21, 1105-1112.

Bray, C. M. (1995) Biochemical processes during the osmopriming of seeds. pp. 767- 789 in : Kigel, J. ; Galili, G. (Eds) Seed development and germination. Marcel Dekker, Inc., New York.

Chareyre, S., Kersulec, A., Job, D. et Job, C. (1998) The use of an ELISA to quantitate the extent of 11 S globulin mobilization in untreated and primed sugar beet seed lots. Comptes-Rendus de l'Académie des Sciences, Paris 321, 705-711.

Davison, P. A. et Bray, C. M. (1991) Protein synthesis during osmopriming of leek (Allium porrum L.) seeds. Seed Science Research 1, 29-35.

De Castro, R., Zheng, X., Bergervoet, J. H. W., De Vos, C. H. R. et Bino, R. J. (1995) , 6-Tubulin accumulation and DNA replication in imbibing tomato seeds. Plant Physiology 109,499-504.

Dell'Aquila, A. et Bewley, J. D. (1989) Protein synthesis in the axes of polyethylene glycol-treated-pea seeds and during subsequent germination. Journal of Experimental Botany 40,1001-1007.

Duval, M., Job, C., Alban, C., Douce, R. et Job, D. (1994) Developmental patterns of free and protein-bound biotin during maturation and germination of seeds of Pisum sativum.

Characterization of a novel seed-specific biotinylated protein. Biochemical Journal 299, 141- 150.

Duval, M., Job, C., DeRose, R., Douce, M. et Job, D. (1994) Brevet EP 0658625A2 protéines biotinylées de semences.

Edman, P. (1956) A protein sequanator. European Journal of Biochemistry 1, 80-81.

Fujikura, Y. et Karssen, C. M. (1992) Effects of controlled deterioration and osmopriming on protein synthesis of cauliflower seeds during early germination. Seed Science Research 2, 23-31.

Heydecker, W. (1978)"Primed"seeds for better crop establishment ? Span 21, 12-14.

Heydecker, W., Higgins, J. et Gulliver, R. L. (1973) Accelerated germination by osmotic seed treatment. Nature 246, 42-44.

Job, C., Kersulec, A., Ravasio, L., Chareyre, S., Pépin, R. et Job, D. (1997) The solubilization of the basic subunit of sugarbeet seed 11-S globulin during priming and early germination. Seed Science Research 7, 225-243.

Job, D., Kersulec, A. et Job, C. (1997) WO 97/43418.

Karssen, C. M., Haigh, A., Van der Toorn, P. et Weges, R. (1989) Physiological mechanisms involved in seed priming. pp 269-280 in Taylorson, R. B. (Ed) Recent avances in the development and germination of seeds. New York, Plenum Press.

Kermode, A. R. (1997) Approaches to elucidate the basis of desiccation-tolerance in seeds. Seed Science Research 7, 75-95.

Laemli, U. K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

Michel, B. E. et Kaufmann, M. R. (1973) The osmotic potential of polyethylene glycol 6000. Plant Physiology 51, 914-916.

Ôzbingol, N., Corbineau, F. et Côme, D. (1998) Responses of tomato seeds to osmoconditioning as related to temperature and oxygen. Seed Science Research 8, 377-384.

Roitt, I., Brostoff, J. et Male, E. (1985) Immunologie fondamentale et appliquée.

Médecine et sciences internationales ; Paris.

Rowse, H. R. (1996) Drum priming-a non-osmotic method of priming seeds. Seed Science and Technology 24, 281-294.

Shewry, P. R., Napier, J. A. et Tatham, A. S. (1995) Seed storage proteins : structures and biosynthesis. Plant Cell 7, 945-956.

Still, D. W., Dahal, P. et Bradford, K. J. (1997) A single-seed assay for endo-ß mannanase activity from tomato endosperm and radicle tissues. Plant Physiology 113, 13-20.

Tarquis, A. M. et Bradford, K. J. (1992) Prehydration and priming treatments that advance germination also increase the rate of deterioration of lettuce seeds. Journal of

Experimental Botany 43, 307-317.

Taylor, A. G., Allen, P. S., Bennett, M. A., Bradford, K. J., Burris, J. S. et Misra, M. K. (1998) Seed enhancements. Seed Science Research 8, 245-256.

Toorop, P. E., van Aelst, A. C. et Hilhorst, H. W. M. (1998) Endosperm cap weakening and endo-p-mannanase activity during priming of tomato (Lycopersicon esculentum cv.

Moneymaker) seeds are initiated upon crossing a threshold water potential. Seed Science Research 8, 483-491.