EXTRACTOS PROTEICOS CON AMPLIO ESPECTRO DE ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA Y CEPAS DEL GÉNERO BIFIDOBACTERIUM QUE LOS PRODUCEN.

SECTOR DE LA TÉCNICA

Esta patente pertenece al sector de Ia técnica de Ia Industria Alimentaria y Farmacéutica. Más concretamente, esta invención se enmarca dentro del campo de Ia alimentación funcional (probióticos) y de las tecnologías de conservación de alimentos por métodos biológicos, a través del uso de microorganismos con actividad antimicrobiana y de sus metabolitos. La patente incluye seis cepas del género Bifidobacterium, de origen intestinal humano, los metabolitos proteicos con actividad anti bacteriana de amplio espectro que producen, y su uso frente a bacterias patógenas gastrointestinales y bacterias patógenas y alterantes de alimentos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Los probióticos constituyen uno de los subgrupos de alimentos funcionales más destacados por su versatilidad funcional y gran aceptación por los consumidores, Io que ha despertando un creciente interés comercial, tanto en Ia industria farmacéutica como en Ia alimentaria.

Un probiótico es un suplemento dietético constituido por microorganismos viables que, administrado en cantidades adecuadas, es capaz de modificar Ia microflora de un compartimento del huésped, ejerciendo así un efecto beneficioso sobre Ia salud de éste (Schrezenmeir, et al., 2001. Probiotics, prebiotics, and symbiotics-approaching a definition. Am. J. Clin. Nutr. 73: 361 S- 364S). Los principales probióticos son las bacterias integrantes de los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium, comensales del tracto gastrointestinal y tradicionalmente utilizadas en diversas fermentaciones alimentarias. Las cepas del género Bifidobacterium son particularmente importantes ya que colonizan selectivamente el tracto intestinal de los recién nacidos, representando hasta el 91% de su flora, y en adultos entre el 3 y el 7% (Harmsen, eí al. 2000. Analysis of intestinal flora development in breast-feed and formula-feed infants by using

molecular identification and detection methods. J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 30: 61-67; Biavati, et al. 2001. The family Bifidobacteriaceae. In: Dworkin, et al. (eds.), The Prokaryotes. pp. 1-70. Springer, Nueva York). Los microorganismos del género Bifidobacterium se incluyen habitualmente dentro del grupo de bacterias lácticas, definido fisiológicamente por su capacidad para producir ácido láctico como uno de los principales metabolitos resultantes de Ia fermentación de carbohidratos. No obstante, su ADN posee un contenido en G + C más alto (55-64%) por Io que filogenéticamente se incluyen dentro de Ia clase Actinobactería (O ^' Riordan, et al. 1997. Determination of genetic diversity within the genus Bifidobacterium and estimation of chromosomal size. FEMS Microbiol. Lett. 156: 259-264).

Los probióticos se han comercializado en una gran variedad de formas: (i) alimentos fermentados convencionales a los que se les adicionan probióticos y que se consumen principalmente con fines nutritivos (leche, quesos, etc.); (ii) las leches cultivadas y fermentadas, utilizadas básicamente como vehículos de bacterias probióticas (leche acidófila, leche bifidus, etc.), y (iii) los suplementos dietéticos o preparaciones farmacéuticas liofilizadas. En Ia actualidad, las bifidobacterias se consumen mayoritariamente incorporadas a alimentos y, principalmente, a derivados lácteos; aunque se está ampliando el número de productos (zumos, papillas, productos cárnicos, cereales, mayonesas, etc.) que constituyen un posible vehículo para su aporte.

Entre los efectos beneficiosos que se atribuyen a los probióticos se incluyen Ia mejora de Ia intolerancia a Ia lactosa; Ia prevención y tratamiento de infecciones gastrointestinales y urogenitales, el restablecimiento del ecosistema intestinal tras los tratamientos con antibióticos y quimioterapia, Ia prevención del cáncer coleorrectal y Ia estimulación del sistema inmune (Salminen, eí al. 1998. Functional food science and gastrointestinal physiology and function. Br J Nutr; 80: 147S-171S; Tannock, 1999. A fresh look at the intestinal microflora. In G.W. Tannock (ed.), Probiotics. A critical review, pp. 5-14. Horizon Scientific Press, Wymondham, Norfolk, England). Concretamente, se considera que el género Bifidobacterium es esencial en el mantenimiento del equilibrio del ecosistema intestinal y el desplazamiento de microorganismos potencialmente perjudiciales, por Io que se Ie atribuye una importante función protectora. Se

considera que cepas de este género ejercen efectos beneficiosos en el tratamiento de Ia diarrea del viajero, las infecciones por rotavirus y Ia diarrea asociada al uso de antibióticos (McNaught, eí al. 2001. Probiotics in clinical practice: a critical review of the evidence. Nutr. Res. 21 : 343-353). También se han descrito sus efectos antagónicos frente a patógenos de los géneros Listeria, Clostridium, Salmonella, Campylobacter, Shigella, Proteus, y Escheríchia (Gibson, eí al. 1994. Regulatory effects of bifidobacteria on the growth of other colonic bacteria. J. Appl. Bacteriol. 77: 412-420; Lee, eí al. 2003. Identification and screening for antimicrobial activity against Clostridium difficile of Bifidobacterium and Lactobacillus species isolated from healthy infant faeces. Int. J. Antimicrob. Agents 21 : 340-346; Touré et al. 2003. Production of antibacterial substances by bifidobacterial isolates from infant stool active against Listeria monocytogenes. J. Appl. Microbiol. 95: 1058-1069; Gagnon, eí al. 2004. In vitro inhibition of Escheríchia coli 0157:H7 by bifidobacterial strains of human origin. Int. J. Food Microbiol. 92: 69-78).

No obstante, no siempre existen evidencias claras sobre los efectos beneficiosos ejercidos por las cepas probióticas y por los productos cultivados con ellas y, en muchos casos, los resultados son contradictorios. En parte esto es debido a Ia aplicación de deficientes criterios de evaluación en el proceso de selección de nuevas cepas probióticas y a Ia falta de estudios científicos sobre sus mecanismos de acción.

Concretamente, el origen de las cepas probióticas, su resistencia a las condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico y su susceptibilidad a los antibióticos son criterios de selección claves para el desarrollo de nuevos probióticos previo a su introducción en el mercado.

Se considera que Ia función e implantación de los probióticos puede ser dependiente de Ia especie y se ha recomendado el uso de cepas de origen humano (Lee, eí al. 1995. The coming age of probiotics. Trends Food Sci.

Technol. 6: 241-245); pese a ello, actualmente el número de cepas de bifidobacterias de origen humano existente en el mercado es escaso.

Entre los factores que condicionan Ia supervivencia de las cepas probióticas durante el tránsito gastrointestinal, el pH ácido del estómago y Ia

elevada concentración de sales biliares en el intestino son las barreras fisiológicas más importantes. Durante Ia digestión, el tiempo medio de permanencia de los alimentos en el estómago es de 90 minutos a un pH próximo a 2,0 (HiII. 1990. Factors controlling the microflora of the health upper gastrointestinal tract. In HiII MJ. y Marsh, P. D. (eds), Human Microbial Ecology pp. 57-85. CRC Press, Boca Ratón, Florida; Berrada, eí al. 1991. Bifidobacteríum from fermented milk: survival during acid transit. J. Dairy Sci. 74:409-414). La concentración de bilis en el intestino oscila entre 1 ,5 y 2,0% en Ia primera hora de Ia digestión, disminuyendo posteriormente hasta el 0,3% (Sjovall, 1959. On the concentration of bile acids in the human intestine during absorption of bile acids and steroids 74. Acta Physiol. Scand. 46: 339-345). Por ello, las tolerancias al pH ácido y a altas concentraciones de sales biliares son dos de las propiedades deseables en un microorganismo probiótico. Además, para su incorporación a alimentos y utilización como suplementos, es aconsejable que estas cepas resistan otras condiciones de estrés a las que son sometidas durante los procesos industriales (congelación, secado, liofilización, salado, temperaturas de fermentación y de refrigeración, etc.). Hasta ahora el proceso de selección de las cepas probióticas no siempre ha asegurado su resistencia a los tratamientos tecnológicos y a su paso por el tracto gastrointestinal por Io que su viabilidad y estabilidad en los productos comercializados a menudo no cumple los criterios deseables para garantizar su efectividad (Fasoli, eí al. 2003. Bacterial composition of commercial probiotic products as evaluated by PCR-DGGE analysis. Int. J. Food Microbiol. 82: 59- 70; Temmerman, eí al. 2003. Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products. Int. J. Food Microbiol. 81 : 1-10; Temmerman, eí al. 2003. Culture-independent analysis of probiotic products by denaturing gradient gel electrophoresis. Appl. Environ. Microbiol. 69: 220-226).

El conocimiento de Ia susceptibilidad de las cepas probióticas a los antibióticos es también esencial, tanto para asegurar Ia ausencia de elementos de resistencia transferibles, como para establecer Ia compatibilidad de los probióticos con antibióticos para su uso en terapias combinadas y en diarreas debidas a tratamientos con antibióticos.

Por otro lado, los mecanismos de acción de los probióticos frente a patógenos gastrointestinales se desconocen, en gran medida, Io que dificulta Ia definición de Ia especificidad de su acción frente a patologías concretas. Entre los posibles mecanismos, se pueden citar: Ia competición por nutrientes y sitios de adhesión, Ia degradación de toxinas, Ia estimulación del sistema inmune y Ia síntesis de compuestos antimicrobianos (Fooks, eí al. 1999. Prebiotics, probiotics and human gut microecology. Int. Dairy J. I 9: 53-61).

Los compuestos antimicrobianos producidos por las bacterias lácticas se dividen en dos grandes grupos: (i) los compuestos de bajo peso molecular (menores de 1000 Da) que incluyen los ácidos orgánicos y que poseen un amplio espectro de acción y (ii) los proteínas antimicrobianas o bacteriocinas (mayores de 1000 Da) cuyo espectro de acción se restringe a microorganismos próximamente relacionados y otras bacterias Gram-positivas. En los últimos años, en Lactobacillus spp. también se ha detectado Ia producción de otros compuestos de naturaleza proteica, denominados "bacteriocin-like compounds", que no encajan con los criterios que definen las bacteriocinas y que tienen un espectro de acción más amplio (Bruno, eí al. 2002. Inhibition of pathogenic and putrefactive microorganisms by Bifidobacteríum sp. Milchwissenschaft 57: 617-621 ). La capacidad de las bacterias lácticas para competir e inhibir el desarrollo de otros microorganismos se debe fundamentalmente a Ia producción de ácidos orgánicos, principalmente láctico y acético; aunque, en las últimas décadas, se ha demostrado que Ia producción de bacteriocinas también desempeña una función importante (Niku-Paavola, eí al. 1999. New types of antimicrobial compounds produced by Lactobacillus plantarum. J. Appl. Microbiol. 86: 29-35). Esto ha permitido el uso de cepas de bacterias lácticas como cultivos protectores y sus metabolitos como conservantes en un gran número de fermentaciones alimentarias. La producción de bacteriocinas se ha estudiado en cepas de diversos géneros del grupo de bacterias lácticas y, muy especialmente, en Lactobacillus, Pediococcus y Enterococcus por su diversidad en especies y hábitats y sus aplicaciones industriales (Riley eí al. 2002. Bacteriocins: Evolution, Ecology, and Application. Ann. Rev. Microbiol. 56: 117- 137). Concretamente, las cepas del género Lactobacillus se consideran las

principales productoras de bacteriocinas y, en el caso de cepas probióticas, se suponen implicadas en Ia colonización del tracto intestinal y en el desplazamiento de patógenos (Majhenic, eí al. 2004. DNA analysis of the genes encoding acidocin LF221A and acidocin LF221 B, two bacteriocins produced by Lactobacillus gassen LF221. Appl. Microbiol. Biotechnol. 63: 705- 714). Por el contrario, los efectos inhibitorios de las bifidobacterias frente a Ia flora competitiva se han atribuido básicamente a Ia producción de ácidos orgánicos y sideróforos (Bruno, eí al. 2002. Inhibition of pathogenic and putrefactive microorganisms by Bifidobacteríum sp. Milchwissenschaft 57: 617-62; Asahara, et al. 2001. Increased resistance of minee to Salmonella entérica serovar Thyphimurium infection by synbiotic administration of Bifidobacteria and transgalactosylated oligosaccharides. J. Appl. Microbiol. 91 : 985-996; O ^' Sullivan, eí al. 2001. Isolated bifidobacteria that produce siderophores which inhibit growth of Lactococcus lactis. US Patent Number 884894; Levchenko, eí al. 2001. Strain bifidobacterium breve 79-88 used for preparing curative- prophylactic fermented-milk, nonfermented-milk food-stuffs, biologically active supplements and bacterial preparations. Número de patente: RU2176270; Neeser, eí al. 2001. New bifidobacteria preventing diarrhea caused by pathogenic bacteria. International Patent Number WO 01/11015 A1 ) y no existen evidencias claras de su capacidad para sintetizar compuestos antimicrobianos de naturaleza proteica y de amplio espectro. Tan sólo se ha demostrado que algunas bifidobacterias aisladas de heces de niños producen péptidos antimicrobianos activos frente a Listeria monocytogenes y sólo se ha purificado una bacteriocina (Bifidocina B) de B. bifídum NCFB 1454, que posee un espectro de inhibición restringido a bacterias Gram-positivas (Yildirim, eí al. 1998. Characterization and antimicrobial spectrum of Bifidocin B, a bacteriocin produced by Bifidobacterium bifídum NCFB 1454. J. Food Prot. 61 : 47-51 ; Yildirim, eí al. 1999. Purification, amino acid sequence and mode of action of Bifidocin B produced by Bifidobacterium bifídum NCFB 1454. J. Appl. Microbiol. 86: 45-54. Touré, eí al. 2003. Production of antibacterial substances by bifidobacterial isolates from infant stool active against Listeria monocytogenes. J. Appl. Microbiol. 95: 1058-1069).

La presente invención aporta un grupo de cepas del género Bifídobacterium de origen humano y, por consiguiente, amplía el escaso número de cepas de bifidobacterias de dicho origen (cuyo uso ha sido recomendado) existente en el mercado de los probióticos. Estas bacterias son productoras de metabolitos proteicos con actividad antibacteriana de amplio espectro (activos frente a Gram-positivas y Gram-negativas). Otra ventaja de Ia presente invención es Ia resistencia a las condiciones de estrés grastrointestinal y tecnológico. Otra ventaja añadida es el perfil de sensibilidad a antibióticos que garantiza su seguridad.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Descripción breve

En Ia presente invención han sido seleccionadas seis cepas del género Bifídobacterium: Bifídobacterium BIR-0304, Bifídobacterium BIR-0307, Bifídobacterium B I R-0312 , Bifídobacterium B I R-0324 , Bifídobacterium B I R-0326 y Bifídobacterium BIR-0349.

Las cepas han sido aisladas a partir de heces de individuos sanos (adultos y niños), y son productoras de compuestos de naturaleza proteica con características similares a las bacteriocinas pero con un espectro de acción más amplio que comprende bacterias, tanto Gram-positivas, como Gram- negativas. Este espectro de inhibición tan amplio no es una característica común a todas las bifidobacterias humanas de origen fecal ya que sólo seis del total de aislados presentan esta propiedad.

Estas cepas son altamente resistentes al pH ácido. La selección y aislamiento de las cepas mediante incubación previa de las muestras fecales en un medio ácido ha permitido Ia selección directa de aislados resistentes al pH propio de los jugos gástricos, que constituye Ia principal barrera biológica que puede limitar Ia supervivencia de los probióticos a su paso por el tracto gastrointestinal y durante los procesos de fermentación de alimentos y su período de almacenamiento.

Las cepas del género Bifídobacterium seleccionadas son también resistentes a altas concentraciones de sales biliares y cloruro sódico y a altas temperaturas, el método de aislamiento selectivo utilizado mediante pre-

incubación de las muestras fecales a pH ácido, permitió Ia selección directa de cepas resistentes al pH ácido y pudo favorecer el desarrollo de otras resistencias cruzadas, obteniéndose cepas tolerantes a las condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico. Por Io tanto, estas cepas cuentan con mayores posibilidades de sobrevivir y ser funcionales que las cepas probióticas actualmente comercializadas.

Las cepas seleccionadas del género Bifidobacterium presentan un perfil de resistencia-sensibilidad a antibióticos común a este género que garantiza su seguridad. La realización de pruebas sistemáticas de sensibilidad a antibióticos es esencial como criterio de selección de nuevos probióticos y cultivos protectores para su uso en alimentación a fin de garantizar Ia ausencia de resistencias a antibióticos transmisibles.

La presente invención proporciona además compuestos antibacterianos derivados del metabolismo de las bifidobacterias, en forma de extractos. Estos compuestos antibacterianos derivados del metabolismo de las bifidobacterias constituyen un objeto adicional de Ia presente invención y son reivindicados en Ia presente invención.

Los metabolitos son secretados al medio de cultivo durante el crecimiento de las bifidobacterias y los extractos que los contienen se obtienen a partir de los sobrenadantes libres de células de estos cultivos mediante liofilización, centrifugación, precipitación, extracción o filtración. El espectro de actividad incluye a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas responsables de alteraciones en alimentos y potencialmente patógenas pertenecientes a los géneros (Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacterium, Brochothrix, Listeria, Clostridium, Staphylococcus Escheríchia, Salmonella, Aeromonas, Vibrio, Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter, etc.). Los compuestos responsables de Ia actividad antibacteriana secretados a los medios de cultivo por las seis bifidobacterias y presentes en los extractos neutralizados ensayados son sustancias de naturaleza proteica y poseen características bioquímicas similares a las de las bacteriocinas de bacterias lácticas, pero no cumplen los criterios de su definición ya que poseen un espectro de inhibición excepcionalmente amplio incluyendo, no sólo a bacterias

Gram-positivas, sino también a un amplio número de bacterias Gram- negativas.

Los compuestos antibacterianos derivados del metabolismo de estas bacterias, así como el uso de estos compuestos como agentes antibacterianos frente a patógenos gastrointestinales o frente a bacterias patógenas y alterantes de alimentos, están también reivindicados en Ia presente invención.

El procedimiento de obtención de los extractos que contienen los compuestos arriba mencionados también se reivindica en Ia presente invención. Puesto que las cepas seleccionadas del género Bifídobacterium sintetizaron compuestos con actividad antibacteriana de amplio espectro, frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, en las condiciones a las que están expuestas en el tracto intestinal, pueden actuar como probióticos con función protectora a este nivel y ser utilizados con fines médicos. El uso de las cepas de Ia presente invención como probióticos es otro objeto de Ia presente invención.

Las bifidobacterias seleccionadas crecen y se mantienen viables en diversos alimentos y bebidas constituyendo, por tanto, vehículos idóneos para su aporte. Por ejemplo, en las leches fermentadas y no fermentadas se comprobó su capacidad para secretar compuestos antimicrobianos al medio de cultivo durante su crecimiento. Las cepas del género Bifídobacterium seleccionadas, así como sus metabolitos adicionados en forma de extractos, actúan como inhibidores del desarrollo de bacterias Gram-positivas y Gram- negativas en alimentos y bebidas. Es decir, actúan como cultivos bioprotectores en alimentos como Ia leche. El uso de estas cepas y de sus extractos como agentes bioprotectores de alimentos constituye otro objeto de Ia presente invención.

Puesto que pueden fermentar y coagular Ia leche, podrían ser utilizadas para Ia elaboración de leches fermentadas y otros derivados lácteos. Este uso también ha sido reivindicado en Ia presente invención.

Descripción detallada

Un objeto de Ia presente invención Io constituye una cepa bacteriana aislada útil como producto probiótico, en adelante cepa bacteriana aislada de Ia presente invención, caracterizada porque es una cepa aislada de heces de humanos sanos perteneciente al género Bifidobacterium, porque produce compuestos antibacterianos de naturaleza peptídica con características similares a las bacteriocinas de amplio espectro de acción que comprende bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, y porque es resistente a condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico, pertenecientes al siguiente grupo: a condiciones del jugo gástrico, altas concentraciones de sales biliares y cloruro sódico y altas temperaturas .

Hay que destacar que esta cepa ha sido aislada a partir de heces de individuos sanos (adultos y niños), y es productora de compuestos de naturaleza proteica con características similares a las bacteriocinas pero con un espectro de acción más amplio que comprende bacterias, tanto Gram- positivas, como Gram-negativas. Este espectro de inhibición tan amplio no es una característica común a todas las bifidobacterias humanas de origen fecal ya que sólo seis del total de aislados presentan esta propiedad.

Debido a que experiencias previas demostraron que mediante aislamientos convencionales tan sólo un 40% de las cepas de bifidobacterias de origen fecal eran resistentes a pH ácido, se utilizó un procedimiento de aislamiento más selectivo que permitiera mejorar este porcentaje y aislar directamente sólo las cepas ácido-resistentes. Tras pre-incubación de las muestras fecales a pH ácido durante 16 h, 60 aislados fueron asignados al género Bifidobacterium. De acuerdo con los resultados del análisis por RAPDs, 24 del total de aislados fueron cepas distintas. La identificación a nivel de especie de las cepas de mayor interés por su amplio espectro de actividad antibacteriana se realizó utilizando PCRs específicas de especie. La cepas del género Bifidobacterium BIR-0304, BIR-0307, BIR-0312 y BIR-0349 se asignaron a Ia especie B. longum inf antis; Ia cepa BIR-0324 a Ia especie B. catenulatum y Ia cepa BIR- 0326 a B. bifidum.

Por tanto, las cepas del género Bifidobacterium seleccionadas son altamente resistentes al pH ácido. El procedimiento de selección de las cepas,

mediante incubación previa de las muestras fecales en un medio ácido, permite Ia selección directa de aislados resistentes al pH propio de los jugos gástricos, que constituye Ia principal barrera biológica que puede limitar Ia supervivencia de los probióticos a su paso por el tracto gastrointestinal y durante los procesos de fermentación de alimentos y su período de almacenamiento (Ejemplo 1 ). Todas las cepas fueron resistentes a las condiciones propias de los jugos gástricos manteniendo su viabilidad en torno a 10 ⁶ -10 ⁸ UFC/ml tras incubación prolongada.

Además, Las cepas del género Bifídobacterium seleccionadas son resistentes a altas concentraciones de sales biliares y cloruro sódico. Todas las cepas estudiadas mostraron capacidad para crecer a concentraciones de bilis de entre 1 y 5% (Figura 1A) y de NaCI de entre 2 y 10% (Figura 1B). Además, estas cepas presentan muy buena capacidad de crecimiento a temperaturas superiores a Ia óptima (hasta 60 ⁰ C) incluyendo las habitualmente utilizadas en los procesos de elaboración de leches fermentadas (Por ejemplo 42-45 ⁰ C). Por tanto, el método de aislamiento selectivo utilizado mediante pre-incubación de las muestras fecales a pH ácido, permitió Ia selección directa de cepas resistentes al pH ácido y pudo favorecer el desarrollo de otras resistencias cruzadas, obteniéndose cepas tolerantes a las condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológico (altas concentraciones de cloruro sódico, altas temperaturas incluidas en los procesos tecnológicos de elaboración de diversos alimentos como los productos lácteos y procesos de liofilización). Globalmente, Ia invención proporciona cepas resistentes y estables en las condiciones propias del tracto gastrointestinal y de los procesos tecnológicos con mayores posibilidades de sobrevivir y ser funcionales que las cepas probióticas actualmente comercializadas (Ejemplo 1 ).

Así, un objeto particular de Ia presente invención Io constituye una cepa del género Bifídobacterium perteneciente, a título ilustrativo y sin que limite el alcance de Ia presente invención, al siguiente grupo: Bifídobacterium BIR-0304 (CECT 7039), Bifídobacterium BIR-0307 (CECT 7040), Bifídobacterium BIR- 0312 (CECT 7041 ), Bifídobacterium BIR-0324 (CECT 7042), Bifídobacterium BIR-0326 (CECT 7043) y Bifídobacterium BIR-0349 (CECT 7044).

La determinación de Ia sensibilidad a antibióticos es un criterio esencial para Ia selección de nuevos probióticos y, en general, de cepas bacterianas que vayan a ser utilizadas para alimentación (humana y animal) a fin de garantizar su uso seguro y, en el caso de probióticos, su compatibilidad con Ia administración de antibióticos en terapias combinadas y en el tratamiento de trastornos originados por el consumo de éstos. Las cepas seleccionadas del género Bifídobacterium presentan un perfil de resistencia-sensibilidad a antibióticos común a este género que garantiza su seguridad. Las cepas estudiadas fueron resistentes al metronidazol, gentamicina, ácido nalidíxico, trimethoprim, kanamicina, vancomicina y polimixina. Las resistencias intrínsecas a ciertos antibióticos que presentan las cepas de Ia presente invención, como el metronidazol y Ia vancomicina, son útiles para terapias combinadas que incluyan estos probióticos y antibióticos, por ejemplo en el tratamiento de las infecciones por Helicobacter pylorí y Clostrídium difficile. Sólo Ia cepa Bifídobacterium BIR -0349 fue sensible a Ia gentamicina y Ia cepa Bifídobacterium BIR-0324 al trimethoprim. Sin embargo, todas fueron sensibles a Ia rifampicina, amoxicilina, penicilina G, cloranfenicol, eritromicina, tetraciclina y claritromicina. (Ejemplo 1 ).

Otro objeto de Ia presente invención Io constituyen compuestos antibacterianos, en forma de extracto, derivados del metabolismo de las bifidobacterias de Ia presente invención. Los metabolitos son secretados al medio de cultivo durante el crecimiento de las mencionadas bifidobacterias y los extractos que los contienen se obtienen a partir de los sobrenadantes libres de células de estos cultivos por ejemplo mediante liofilización. El procedimiento de obtención de los extractos también se reivindica en Ia presente invención. Este procedimiento de obtención es el siguiente: (i) inoculación de un medio de cultivo al 1% (entre el 0.01 y el 50%) con cada bifidobacteria e incubación del mismo, (ii) recuperación del sobrenadante del cultivo por centrifugación al final de Ia fase exponencial del crecimiento (o bien durante Ia fase exponencial o estacionaria de crecimiento) (iii) concentración del sobrenadante por liofilización (o bien por precipitación con sulfato amónico o solventes orgánicos y posterior diálisis o evaporación, por extracción con solventes orgánicos o por filtración) y (iv) suspensión del liófilo en un volumen de tampón que represente

el 10% (entre el 90 y el 0.5% ) del volumen inicial del medio de cultivo y neutralización o no del extracto obtenido y esterilización por filtración. La actividad antimicrobiana se detecta en los extractos, neutralizados (en los que se elimina el efecto de los ácidos orgánicos) y sin neutralizar (en los que el efecto de los ácidos orgánicos se suma al de compuestos de otra naturaleza; ver Ejemplo 2 y 3). El espectro de actividad incluye a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas responsables de alteraciones en alimentos y potencialmente patógenas pertenecientes a los géneros Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc, Carnobacteríum, Brochothrix, Listería, Clostridium, Staphylococcus, Escherichia, Salmonella, Aeromonas, Vibrio, Helicobacter, Campylobacter, Arcobacter, etc.

La actividad antimicrobiana de estos compuestos fue determinada por Ia técnica de Ia doble capa y Ia de difusión en agar frente a dos microorganismos indicadores Gram-positivos, L. innocua y L. lactis, esto permitió Ia selección de ocho cepas del género Bifidobacterium de entre las 24 aisladas de heces. Posteriormente, el estudio se orientó hacia Ia detección de Ia actividad anti bacteriana debida exclusivamente a Ia secreción de compuestos de naturaleza proteica, por Io que se utilizó sólo Ia técnica de difusión en agar y extractos neutralizados, y se amplió el número de microorganismos indicadores, incluyendo bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Se seleccionaron, finalmente, las seis cepas que mostraron el espectro de inhibición más amplio (ver Tabla I). Entre ellas, Ia cepa Bifidobacterium BIR- 0312 fue Ia que inhibió un número mayor de microoganismos indicadores. Los perfiles de inhibición de las cepas Bifidobacterium BIR -0304, BIR-0307, BIR- 0312, BIR-0324 y BIR-0326 fueron similares mientras que Ia cepa BIR-0349 mostró un espectro más restringido. La mayoría de las bacterias potencialmente patógenas Gram-positivas (Clostridium difficile, L. monocytogenes y Staphylococcus aureus) y Gram-negativas (Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori, Campylobacter coli y Arcobacter butzleri) fueron inhibidas por, al menos, cuatro de las bifidobacterias seleccionadas.

Los compuestos responsables de Ia actividad antibacteriana secretados a los medios de cultivo por las seis bifidobacterias y presentes en los extractos neutralizados ensayados son sustancias de naturaleza proteica cuya

producción o liberación al medio es máxima al final de Ia fase de crecimiento exponencial y fase estacionaria, cuando se utiliza como medio de cultivo caldo MRS, conteniendo cisteína y agentes como el Tween (0,1-10,0%). La naturaleza proteica se confirma por Ia destrucción de su actividad tras su tratamiento con todas las proteinasas ensayadas. Tan sólo Ia incubación con proteinasa K incrementó el efecto inhibidor sobre Helicobacter pylori, debido a que Ia propia proteinasa actuaba como inhibidor del crecimiento de este microorganismo y, dependiendo de Ia concentración, de forma sinérgica junto a otros compuestos de los extractos de las bifidobacterias. Los compuestos responsables de Ia inhibición son termoestables manteniendo su actividad tras su incubación a 8O ⁰ C durante al menos 3 min y a 100 ⁰ C durante al menos 1 min. También son estables y activos en un amplío intervalo de pH (2-11 ) (Ejemplo 2). Por tanto, su actividad es compatible con las condiciones propias del tracto gastrointestinal y con las de un amplio número de procesos tecnológicos (fermentación y maduración de productos lácteos, cárnicos, etc.).

La masa molecular aparente de los compuestos antibacterianos es menor de 100 kDa, determinada por ultrafiltración (Ejemplo 2).

Por tanto, los compuestos responsables de Ia actividad anti bacteriana poseen características bioquímicas similares a las de las bacteriocinas de bacterias lácticas, pero no cumplen los criterios de su definición ya que poseen un espectro de inhibición excepcionalmente amplio incluyendo, no sólo a bacterias Gram-positivas, sino también a un amplio número de bacterias Gram- negativas. Así, Ia actividad antimicrobiana de los extractos frente a bacterias Gram-positivas (por ejemplo Listeria innocua) y Gram-negativas (por ejemplo Salmonella typhimurium y Helicobacter pylori) se destruye tras su tratamiento con diversas proteasas (tripsina, proteasa A, pepsina y catepsina B), pero no con amilasas y lipasas (Ejemplo 2). El hecho de que el espectro de inhibición se amplíe a patógenos Gram-negativos es una característica inusual en las bacteriocinas convencionales de bacterias Gram-positivas y confiere a Ia cepa aislada de Ia presente invención y a sus metabolitos grandes ventajas como probióticos y bioprotectores frente a microorganismos que no estén próximamente relacionados.

Los compuestos antibacterianos de naturaleza proteica producidos por las cepas seleccionadas del género Bifídobacterium son capaces de inhibir cepas de Helicobacter pylori (multi) -resistentes a antibióticos habitualmente utilizados para su tratamiento (por ejemplo metronidazol y claritromicina), pudiendo constituir una terapia alternativa a dicho tratamiento farmacéutico.

Las cepas seleccionadas del género Bifídobacterium de Ia presente invención sintetizaron compuestos con actividad antibacteriana de amplio espectro, frente a bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, en las condiciones a las que están expuestas en el tracto intestinal, presencia de sales biliares y pancreatina, por Io que pueden actuar como probióticos con función protectora a este nivel y ser utilizados con fines médicos. Dicha actividad antibacteriana fue debida a compuestos secretados al medio de cultivo y, en gran parte, a compuestos de naturaleza proteica ya que los halos de inhibición debidos al efecto de los extractos neutralizados fueron sólo ligeramente inferiores (entre 1 y 3 mm) a los de los extractos sin neutralizar (ver Figura 3-B, pocilios A y B) (Ejemplo 3).

Se determinó el posible uso de leche y medios basados en leche como sustrato para el crecimiento de las bifidobacterias y vehículos para su aporte en forma de células viables. En leche, todas las bifidobacterias seleccionadas e inoculadas al 1% fueron capaces de crecer, alcanzando niveles de 10 ⁶ -10 ⁹ UFC/ml, tras períodos de incubación de entre 24 y 48 h. El pH de Ia leche se redujo de valores iniciales de 6,4 a valores entre 4,0 y 5,2 y se observó cierto grado de coagulación, especialmente importante en las muestras inoculadas con Ia cepa Bifídobacterium BIR-0324 y su aroma fue el típico del yogur. En L- EL-G, todas las bifidobacterias seleccionadas fueron capaces de crecer, y el aumento en el número de viables fue ligeramente superior (entre 1 y 0,5 unidades logarítmicas) al obtenido en L. El grado de acidificación alcanzado también fue mayor, obteniéndose valores finales de pH entre 3,0 y 4,6. Se observó también un mayor grado de coagulación y, este fue especialmente importante, en las muestras inoculadas con las cepas Bifídobacterium BIR - 0312, BIR-0324 y BIR-0326 y su aroma fue el típico de leches fermentadas azucaradas.

Las bifidobacterias seleccionadas fueron capaces de sintetizar compuestos con actividad antibacteriana frente a microorganismos Gram- positivos y Gram-negativos en leche y medios basados en leche, como se demuestra por Ia técnica de Ia doble capa. Se obtuvieron halos de inhibición de 3 a 12 mm, excepto en el caso de Ia cepa Bifidobacterium BIR-0349 (ver Figura 3-A). La capacidad para secretar compuestos antimicrobianos al medio de cultivo durante su crecimiento en estos medios se verificó mediante el análisis de Ia actividad de sus extractos. Concretamente, en Ia Figura 3-B se observa el efecto inhibidor de los extractos neutralizados y sin neutralizar de Ia cepa Bifidobacterium BIR-0324 crecida en L-EL-G frente a S. typhimuríum, detectándose halos muy similares, sólo 3 mm mayor en el extracto no neutralizado. Estos resultados confirman, por tanto, que dicha actividad es debida a compuestos de naturaleza proteica y que son secretados in situ durante su crecimiento en medios basados en leche. Por Io tanto, las cepas del género Bifidobacterium de Ia presente invención seleccionadas crecen y se mantienen viables en diversos alimentos constituyendo vehículos idóneos para su aporte. Las leches fermentadas y no fermentadas, constituyen ejemplos de alimentos que sirven de soporte para el mantenimiento de su viabilidad (Ejemplo 4); además, se encuentran entre los productos más adecuados para Ia administración de cepas probióticas, debido a que Ia leche y sus derivados son integrantes habituales de Ia dieta en países desarrollados, tienen alto valor nutritivo, son fáciles de digerir y gozan de gran aceptación en los diversos grupos de población.

Las cepas del género Bifidobacterium seleccionadas pueden fermentar Ia leche y coagular sus proteínas; por tanto, pueden ser utilizadas para Ia elaboración de leches fermentadas, leches bífidus y otros derivados lácteos como por ejemplo, el yogur (Ejemplo 4).

Las cepas del género Bifidobacterium de Ia presente invención seleccionadas, así como sus metabolitos adicionados en forma de extractos, actúan como inhibidores del desarrollo de bacterias Gram-positivas y Gram- negativas en alimentos y bebidas. Las bifidobacterias seleccionadas actuaron como cultivos bioprotectores en leche, reduciendo Ia viabilidad de Salmonella en, al menos, dos unidades logarítmicas y de Listeria en, al menos, seis (ver

Tabla II). Los efectos protectores consecuencia directa de los metabolitos secretados por las bifidobacterias, se confirmaron por adición exclusiva a Ia leche contaminada de sus extractos. La adición de extractos no neutralizados, en los que se sumarían los efectos de los ácidos orgánicos y los de compuestos de naturaleza proteica, produjeron una reducción de los niveles de Listeria a valores inferiores a 100 UFC/ml y Ia adición de extractos neutralizados, con los que se evaluaría inicialmente el efecto de compuestos de naturaleza proteica, provocó reducciones de Ia bacteria contaminante de, al menos, dos unidades logarítmicas. Por tanto, los compuestos de naturaleza proteica en forma de extractos así como los cultivos de las cepas del género Bifidobacterium que los producen pueden actuar, en alimentos como Ia leche, como bioprotectores o conservantes naturales inhibiendo el desarrollo de microorganismos contaminantes (Ejemplo 5).

Por Io tanto, otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia cepa bacteriana aislada en Ia presente invención en Ia elaboración de un alimento o bebida probiótica, y que de una forma concreta cumpla funciones profilácticas o terapéuticas frente a patógenos gastro-intestinales. De forma preferente dicho uso de Ia cepa bacteriana en Ia elaboración de un alimento probiótico consiste en Ia elaboración de una leche fermentada, una leche bífidus y otros derivados lácteos.

Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia cepa bacteriana aislada en Ia presente invención como fermento o cultivo iniciador y cultivo bioprotector de alimentos o bebidas frente a bacterias de alteración y de interés sanitario y de forma preferente en alimentos como leches fermentadas una leche bífidus y otros derivados lácteos.

Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de Ia cepa bacteriana aislada en Ia presente invención como cultivo bioprotector de alimentos o bebidas fre nte a bacterias alterantes de alimentos y de interés sanitario. Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de los extractos proteicos de Ia presente invención como compuestos terapéuticos frente a patógenos gastrointestinales u otro tipo de bacteria patógena, preferentemente

el patógeno gastrointestinal es una cepa de Ia especie Helicobacter pylorí multi- resistente.

Otro objeto de Ia presente invención Io constituye el uso de los extractos proteicos de Ia presente invención como conservantes biológicos frente a bacterias alterantes y de interés sanitario en alimentos o bebidas y de forma preferente en una leche fermentada, una leche bífidus y otros derivados lácteos.

Un cultivo de Bifidobacterium BIR-0304 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7039.

Otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0307 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT ), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7040.

Otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0312 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7041.

Otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0324 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7042. Otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0326 ha sido depositado en Ia

Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7043.

Por último, otro cultivo de Bifidobacterium BIR-0349 ha sido depositado en Ia Colección Española de Cultivos Tipo (CECT), con sede en Burjasot (Valencia), el día 21 de Diciembre de 2004, correspondiéndole el número de depósito CECT 7044.

DESCRIPCIONES DE LAS FIGURAS

Figura 1.- Representación de Ia tolerancia de las cepas del género Bifidobacterium a condiciones de estrés intestinales y tecnológicas. Se muestra un ejemplo de Ia capacidad de crecimiento de una de las cepas seleccionadas (Bifidobacterium BIR-0314) en presencia de altas concentraciones de bilis (Ox- gall; Fig. 1A) y sal (NaCI; Fig. 1 B), en caldo MRS-C, a 37 ⁰ C. El crecimiento se monitorizó mediante medidas de absorbancia a 655 nm en un espectrofotómetro de placas de multipocillo. Figura 2.- Representación del efecto inhibidor de las cepas del género Bifidobacterium frente a Helicobacter pylorí mediante Ia técnica de difusión en agar. Las flechas señalan los halos de inhibición causados por los compuestos anti bacterianos presentes en los extractos obtenidos a partir de los cultivos de las bifidobacterias seleccionadas. El control negativo (C) muestra Ia ausencia de inhibición del extracto obtenido a partir del medio de cultivo que no fue fermentado por las bifidobacterias.

Figura 3.- A. Representación del efecto inhibidor de las cepas del género Bifidobacterium crecidas en distintos medios de cultivo sobre Salmonella typhimurium por Ia técnica de Ia doble capa. Los medios utilizados para crecer las bifidobacterias fueron: MRSC-OX-P, MRSC con un 0,5 % de sales biliares (Ox-gall) y 0,1 g/l de pancreatina; L, leche; L-EL-G, leche con un 0,5% de extracto de levadura y un 1% de glucosa; PCL, Píate Count leche. El efecto inhibidor se determinó midiendo los halos de inhibición y está expresado en milímetros (mm)\ B. Representación del efecto inhibidor de los extractos de las cepas del género Bifidobacterium crecidas en distintos medios de cultivo sobre Salmonella typhimurium por Ia técnica de difusión en agar. A= MRSC-OX-P, neutralizado; B= MRSC-OX-P, sin neutralizar; C=MRSC, sin neutralizar; D=MRSC, neutralizado; E=MRSC sin inocular, control negativo; F= L-EL-G sin neutralizar; G= L-EL-G neutralizado; H= L-EL-G sin inocular, control negativo.

EJEMPLOS DE REALIZACIÓN DE LA INVENCIÓN

EJEMPLO 1 . PROCEDIMIENTO DE AISLAMIENTO SELECTIVO DE CEPAS DEL GÉNERO BIFIDOBACTERIUM RESISTENTES A DIVERSAS CONDICIONES DE ESTRÉS Y CARACTERIZACIÓN DE LOS AISLADOS. Aislamiento selectivo e identificación de los aislados.

Se procedió al aislamiento de cepas del género Bifidobacterium a partir de heces de individuos sanos (adultos de entre 25-35 años de edad y niños de entre 6 y 12 meses) que no hubieran ingerido alimentos que contuvieran bifidobacterias durante al menos el mes anterior al análisis y que no hubieran sido sometidos a tratamientos con antibióticos durante los últimos seis meses. Las muestras se mantuvieron a 4 ^o C y se analizaron sin que transcurrieran más de dos horas desde su recogida. Dos gramos de cada una de ellas se diluyeron en tampón fosfato 10 mM conteniendo una concentración de NaCI 130 mM (PBS) y se homogeneizaron en un stomacher Lab-Blender 400 (Seward Medical, Londres, UK), durante 3 min. A fin de aislar directamente sólo cepas resistentes a las condiciones acidas de los jugos gástricos, de cada uno de los homogeneizados se tomaron muestras de 1 mi y se inocularon en caldo MRS (de Man Rogosa and Sharpe; Scharlau, Barcelona) conteniendo un 0.05% de cisteína (Sigma, St. Louis, MO; MRS-C), ajustado a pH 2 con HCI. Estas muestras se incubaron a 37 ⁰ C durante 16 h en condiciones de anaerobiosis (AnaeroGen, Oxoid, UK). Posteriormente, se hicieron diluciones decimales y alícuotas de 100 μl se sembraron en placas de agar de dos medios selectivos para el aislamiento de bifidobacterias: BSM (Fluka, Buchs, Suiza) y BFM (Nebra y Balnch, 1999). Después de tres días de incubación, se seleccionaron entre 8 y 10 colonias características de las diluciones más altas de cada medio y se analizó su morfología bajo tinción de Gram.

La identidad de los aislados se confirmo mediante PCR específica de género, de acuerdo con Ia metodología descrita por Kaufman et al. (1997. Identification and quantification of Bifidobacterium species isolated from food with genus-specific 16S rRNA-targeted probes by colony hybridization and PCR. Appl. Environ. Microbiol. 63: 1268-1273). Se utilizaron cebadores (LM26 y LM3) que amplifican un fragmento de 1.35 kb del gen del ARN ribosómico 16S. La diferenciación de los aislados a nivel de cepa se realizó por Ia técnica de

RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA)-PCR, utilizando el cebador Bif y Ia metodología descrita por Tynkynen et al. (1999. Comparison of ribotyping, randomly amplified polymorphic DNA analysis, and pulsed-field gel electrophoresis in typing of Lactobacillus rhamnosus and L. casei strains. Appl. Environ. Microbiol. 65: 3908-3914). De los 60 aislados, 24 fueron cepas distintas. La identificación a nivel de especie de las cepas de mayor interés por su amplio espectro de actividad antibacteriana (ver ejemplo 2) se realizó mediante el uso de PCRs múltiples y simples utilizando cebadores específicos de especie basados en secuencias del gen del ARN ribosómico 16S (Matsuki eí al. 2003. Genus- and species-specific PCR primers for the detection and identification of Bifidobacteria Curr. Issues Intest. Microbiol. 4: 61-69).

La cepas del género Bifidobacterium BIR-0304, BIR-0307, BIR-0312 y BIR- 0349 se asignaron a Ia especie B. longum infantis; Ia cepa BIR-0324 a Ia especie B. catenulatum y Ia cepa BIR-0326 a B. bifidum.

Resistencia a condiciones de estrés gastrointestinal y tecnológicas

La resistencia de las bifidobacterias aisladas a las condiciones acidas de los jugos gástricos, que constituyen Ia primera barrera biológica que limita Ia viabilidad de los probióticos tras su ingestión, se confirmó para cada una de las cepas recuperadas. Para ello, se prepararon suspensiones de células (10 ⁸ células/ml) de cada cepa en PBS, conteniendo 3 g/l de pepsina (Sigma, St. Louis, MO) y ajustada a pH 2 con HCI y se incubaron a 37 ⁰ C durante un total de 120 min. A distintos tiempos (0, 90 y 120 min), incluyendo el tiempo medio de vaciado gástrico (90 min), se tomaron alícuotas para determinar Ia viabilidad mediante recuentos en placas de agar MRS-C. Posteriormente, se estudió Ia tolerancia de las cepas resistentes al pH ácido a otras condiciones de estrés, como Ia bilis, el NaCI y las altas temperaturas. Para conocer Ia tolerancia de las cepas objeto de estudio a Ia bilis, se evaluó su capacidad para crecer en MRS- C, al que se adicionaron diversas concentraciones (0,5-1 ,5 %) de Ox-gall (Sigma, St. Louis, MO). Alícuotas de 200 μl de cada medio, inoculadas al 1% con cultivos de 24 h, se cargaron en placas multipocillo y se incubaron a 37 ⁰ C. El crecimiento se monitorizó mediante medidas de absorbancia a 655 nm en un espectrofotómetro 550 Microplate Reader (Bio-Rad, Hercules, CA). Del mismo

modo, se determinó Ia tolerancia de las cepas a altas concentraciones de NaCI (3-10%) y a altas temperaturas (42-60 ⁰ C).

Sensibilidad a antibióticos La sensibilidad de las cepas objeto de estudio se determinó mediante el uso de discos de antibióticos (Oxoid, Basingstoke, UK) y el método de difusión en agar y, en el caso del metronidazol y Ia claritromicina mediante el uso de E- test (AB Biodisk, Solna, Suecia). 100 μl de un cultivo de 24 h se inocularon en 9 mi de MRS-C conteniendo un 0.7% de agar fundido y se vertió sobre una capa de agar sólido. Una vez solidificada Ia capa superior, se colocaron los discos o tiras de antibiótico en su superficie y, tras incubar a 37 ⁰ C durante 24 h, se midieron los halos de inhibición.

EJEMPLO 2. PROCEDIMIENTO DE SELECCIÓN DE BIFIDOBACTERIAS CAPACES DE PRODUCIR PROTEÍNAS ANTIBACTERIANAS DE AMPLIO ESPECTRO Y DE EXTRACTOS CON DICHA ACTIVIDAD.

Detección de actividad antibacteriana en cultivos y extractos obtenidos a partir de ellos y análisis del espectro de inhibición.

La actividad antibacteriana de las cepas del género Bifidobacterium aisladas selectivamente por el procedimiento descrito en el Ejemplo 1 , se determinó mediante dos métodos: (i) por Ia técnica de Ia doble capa y (ii) por Ia técnica de difusión en agar.

La actividad antibacteriana de cada cepa se evaluó globalmente mediante Ia técnica de Ia doble capa utilizando como microorganismos indicadores dos bacterias Gram-positivas (Listeria innocua y Lactococcus lactis). Las bifidobacterias potencialmente activas se sembraron en placas de MRS-C en líneas de unos 2 cm y se incubaron en condiciones óptimas durante 16 h y su desarrollo posterior se inhibió con cloroformo. El microorganismo indicador se inoculó a una concentración de 10 ⁴ -10 ⁵ CFU/ml en 10 mi de agar semisólido adecuado, se vertió sobre Ia capa de agar del microorganismo protector y se incubó en condiciones óptimas para el primero. Listeria innocua se cultivó en Brain Herat (BH) y L. lactis en M17 y ambos se incubaron en

aerobiosis a 3O ⁰ C. Tras 24 h se midieron los posibles halos de inhibición alrededor de las líneas del cultivo protector.

A fin de evaluar Ia actividad antibacteriana debida a Ia secreción de compuestos de naturaleza proteica se utilizó Ia técnica de difusión en agar. 10 mi de caldo MRS-C se inocularon al 1% con un cultivo de 24 h de cada bifidobacteria y se incubaron durante 16 h a 37 ⁰ C. Los sobrenadantes se obtuvieron por centrifugación (12.000 g, 15 min, 4 ⁰ C) y se concentraron por liofilización. Los liófilos se resuspendieron en 1 mi de tampón fosfato 50 mM a pH 6.5, se neutralizaron con NaOH hasta alcanzar un pH de 6,5 para eliminar los efectos de los ácido orgánicos generados por fermentación, y se esterilizaron por filtración. Estas muestras constituyeron los extractos crudos en los que se determinó Ia posible actividad de proteínas antibacterianas producidas por las bifidobacterias. El microorganismo indicador se inoculó a una concentración de 10 ⁴ -10 ⁵ células/ml en 10 mi de agar semisólido adecuado y se vertió sobre una capa sólida de agar del mismo medio. Tras solidificar, se perforaron pocilios de 5 mm, a los que se añadieron 40 μl del extracto libre de células y neutralizado de cada bifidobacteria. Se dejó difundir 1 h a 4 ⁰ C y, posteriormente, se incubó en las condiciones óptimas para cada microorganismo indicador. Como microorganismos indicadores, inicialmente, se utilizaron dos bacterias Gram-positivas (Listeria innocua y Lactococcus lactis) y, posteriormente, se amplio el espectro incluyendo un amplio número de bacterias alterantes y patógenos Gram-positivos y Gram-negativos. Entre estos se estudiaron los siguientes indicadores: (i) cepas alterantes de los géneros Lactobacillus y Leuconostoc que se cultivaron en MRS, y del género Carnobacterium que se cultivaron en agar APT y se incubaron a 3O ⁰ C y en microaerofilia; (ii) cepas alterantes del género Brochothrix que se cultivaron en agar STAA y se incubaron a 3O ⁰ C y en aerobiosis; (iii) cepas del género Enterococcus que se cultivaron en BH y se incubaron a 37 ⁰ C, en aerobiosis; (iv) cepas del género Clostridium que se cultivaron en RCM a 37 ⁰ C, en anaerobiosis; (v) cepas del género Listeria y Enterobacter que se cultivaron en BH e incubaron a 30 ⁰ C, en aerobiosis; (vi) cepas de los géneros Staphylococcus, Escherichia, Salmonella y Vibrio, que se cultivaron en BH y se incubaron a 37 ⁰ C, en aerobiosis; (vii) cepas del género Aeromonas que se

cultivaron en BH y se incubaron a 2O ⁰ C, en aerobiosis; (viii) cepas de los géneros Helicobacter y Campylobacter, que se cultivaron en agar sangre de caballo (ASC) y de oveja (ASO), respectivamente, y se incubaron a 37 ⁰ C en microaerofilia; y (ix) cepas del género Arcobacter que se cultivaron en agar ASO y se incubaron a 3O ⁰ C, en aerobiosis. También se incluyó como indicador una cepa del mismo género y de Ia especie B. bifidum, que se cultivó en agar TPY y se incubó a 37 ⁰ C, en anaerobiosis. Todos los medios de cultivo fueron de Oxoid (Basingstoke, UK) excepto el agar MRS y STAA que fue de Scharlau (Barcelona, España).

Tabla I.- Representación del espectro de inhibición de las cepas del género Bifidobacterium seleccionadas mediante Ia técnica de difusión en agar.

Espectro de inhibición (mm)* de las cepas Bifidobacterium

Bacteria

BIR-0304 BIR-0307 BIR-0312 BIR-0324

Indicadora BIR-0326 BIR-0349

Lactobacillus fermentum 9,2 - 9,1 - 11 ,1 14,4

Lactococcus lactis 10,1 9,2 14,3 10,1 10,5 19,2

Leuconostoc spp. - - - - - 10.3

Enterococcus faecium - - - - - -

Carnobacterium 10,1 - 9,0 9,2 - - piscícola

Bifidobacterium bifídum - - 9,0 - - -

Brochothrix 16,3 15,1 14,3 12,1 - - thermosphacta

Listeria innocua 17,1 18,2 16,6 15,5 10,3 10,1

Listeria monocytogenes 15,3 - 11 ,2 10,3 11 ,2 -

Clostridium difficile 9,3 13,3 12,3 9,2 10,0 -

Staphylococcus aureus 10,2 9,1 15,2 - 19,4 -

Escherichia coli 13,5 18,0 14,0 15,2 15,3 10,4

E. coli O157:H7 - - - - - 10,2

Salmonella typhimurium 14,0 15,2 12,0 14,2 9,0 -

Enterobacter aerogenes - - - - - 9,2

Aeromonas salmonicida - - 9,0 - 9,0 10,0

Vibrio parahaemolyticus - - - - 9,3 9,0

Helicobacter pylori 10,0 9,1 9,3 12,3 9,0 -

Campylobacter coli 9,1 9,2 13,2 10,1 15,3 -

Arcobacter butzleri 13,3 9,0 10,2 11 ,5 12,4 -

*, El efecto inhibidor de los extractos, libres de células y neutralizados, obtenidos a partir de los cultivos de las bifidobacterias seleccionadas frente a bacterias Gram -positivas y Gram- negativas se determinó mediante medidas de los halos de inhibición y está expresado en milímetros (mm)*. El signo (-) indica ausencia de inhibición.

Posteriormente, el estudio se orientó hacia Ia detección de Ia actividad anti bacteriana debida exclusivamente a Ia secreción de compuestos de naturaleza proteica, por Io que se utilizó sólo Ia técnica de difusión en agar y extractos neutralizados, y se amplió el número de microorganismos indicadores, incluyendo bacterias tanto Gram-positivas como Gram-negativas. Se seleccionaron, finalmente, las seis cepas que mostraron el espectro de inhibición más amplio (ver Tabla I). Entre ellas, Ia cepa Bifídobacterium BIR- 0312 fue Ia que inhibió un número mayor de microoganismos indicadores. Los perfiles de inhibición de las cepas Bifídobacterium BIR -0304, BIR-0307, BIR- 0312, BIR-0324 y BIR-0326 fueron similares mientras que Ia cepa BIR-0349 mostró un espectro más restringido. La mayoría de las bacterias potencialmente patógenas Gram-positivas (Clostridium difficile, L. monocytogenes y Staphylococcus aureus) y Gram-negativas (Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori, Campylobacter coliy Arcobacter butzleri) fueron inhibidas por, al menos, cuatro de las bifidobacterias seleccionadas.

Caracterización de los compuestos responsables de Ia actividad antibacteriana La caracterización de los compuestos responsables de Ia actividad anti bacteriana de los extractos neutralizados, obtenidos por el procedimiento descrito en el apartado anterior, se realizó mediante los siguientes ensayos:

(i) Sensibilidad a diversos enzimas proteolíticos (tripsina, proteinasa K, proteasa A, pepsina y catepsina B) lipolíticos (lipasa A) y amilolíticos (α-amilasa) suministrados por Sigma (St. Louis, MO). Los extractos se incubaron en presencia de 2 mg/ml de cada enzima y fueron incubados en condiciones óptimas de actuación para cada una de ellas, durante 2 h. Tras cada tratamiento se determinó Ia actividad residual utilizando como control los extractos no incubados con ningún enzima.

(ii) Estabilidad a Ia temperatura y pH. Los extractos se incubaron a distintas temperaturas (80 y 100 ⁰ C) durante 10-30 min y a distintos pH (3-10), durante 1 h. Tras cada tratamiento se determinó Ia actividad residual utilizando controles no tratados.

(iii) Masa molecular aparente. Se determinó mediante el uso de sistemas de filtración-centrifugación (Millipore, Bedford, Mass) con membranas de límites de exclusión entre 3 y 100 kDa. Los extractos se fraccionaron de forma progresiva con filtros de distinto límite de exclusión y se determinó en que fracciones (retenido y filtrado) se concentraba Ia actividad.

Como microorganismos indicadores se utilizaron bacterias Gram-positivas (L. innocua y L. lactis) y Gram-negativas (H. pylorí).

EJEMPLO 3. PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS ANTIBACTERIANOS DE NATURALEZA PROTEICA EN CONDICIONES INTESTINALES.

La capacidad de las cepas seleccionadas del género Bifidobacterium para producir compuestos antibacterianos en las condiciones propias del tracto intestinal se determinó por Ia técnica de Ia doble capa y Ia de difusión en agar. En el primer caso las cepas seleccionadas se inocularon en líneas en agar MRS-C conteniendo 0.5 % de bilis (Ox-gall, sigma, St. Louis, MO) y 0,1 g/l de pancreatina (Sigma, St. Louis, MO), y se incubaron a 37 ⁰ C, durante 16 h. Sobre estas placas de agar se vertieron los cultivos del microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella typhimurium) y se incubaron durante 24 h a temperatura óptima para el indicador. En el segundo ensayo, se estudió el efecto inhibidor de los extractos obtenidos a partir de cultivos de las seis bifidobacterias crecidas en caldo MRS-C, conteniendo 0.5 % de bilis y 0,1 g/l de pancreatina. Alícuotas (40 μl) de estos extractos se adicionaron a los pocilios perforados en placas de agar semisólido en las que estaba inoculado el microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella typhimuríum), se dejaron difundir a 4 ⁰ C, durante 1 h y, posteriormente, se incubaron en condiciones óptimas para cada indicador durante 24 h. Tras el período de incubación se midieron los halos de inhibición alrededor de las líneas o los pocilios.

EJEMPLO 4. CAPACIDAD PARA CRECER, FERMENTAR Y COAGULAR LA LECHE Y PARA PRODUCIR COMPUESTOS ANTIBACTERIANOS DE NATURALEZA PROTEICA EN ESTE MEDIO.

La capacidad de las bifidobacterias para crecer, fermentar y coagular Ia leche se determinó inoculando al 1% cultivos de 24 h de cada una de ellas en leche desnatada al 10% (L) y leche desnatada al 10 %, conteniendo un 0.5% de extracto de levadura y un 1% de glucosa (L-EL-G). Los cultivos se incubaron a 37 ⁰ C y a distintos tiempos se determinó Ia viabilidad de las bifidobacterias mediante recuentos en placas de agar MRS-C, el pH, Ia consistencia y el aroma de las leches cultivadas.

La capacidad de las cepas seleccionadas para producir compuestos anti bacterianos In situ en los medios basados en leche (L, L-EL-G y PCL) se determinó por Ia técnica de Ia doble capa y por Ia de difusión en agar. En el primer caso, las cepas seleccionadas se inocularon en líneas en los medios basados en leche descritos y se incubaron a 37 °c, durante 16 h. Sobre estas placas de agar se vertieron los cultivos del microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella typhimurium) y se incubaron, durante 24 h, a temperatura óptima para el indicador. En el segundo ensayo, se estudió el efecto inhibidor de los extractos obtenidos a partir de cultivos de las bifidobacterias en L y L-EL- L tras su incubación durante 16 h a 37 ⁰ C, en anaerobiosis. Alícuotas (40 μl) de los extractos, neutralizados y sin neutralizar, se adicionaron a los pocilios perforados en placas de agar semisólido en las que estaba inoculado el microorganismo indicador (Listeria innocua y Salmonella typhimurium), se dejaron difundir a 4 ⁰ C, durante 1 h y, posteriormente, se incubaron en condiciones óptimas para cada indicador durante 24 h. Tras el período de incubación se midieron los halos de inhibición alrededor de las líneas de siembra y de los pocilios, en cada caso.

EJEMPLO 5. FUNCIÓN BIOPROTECTORA DE LAS CEPAS DEL GÉNERO Bifidobacterium Y DE SUS EXTRACTOS EN LECHE.

Se utilizó leche descremada al 10% como modelo de un alimento en el que las cepas seleccionadas podrían desempeñar una función bioprotectora frente a bacterias alterantes y patógenas. La leche, previamente esterilizada,

se inoculó con las bifidobacterias bioprotectoras, de modo que alcanzaran niveles de 10 ⁷ UFC/ml, y se contaminaron con cultivos de Listeria innocua y Salmonella typhimurium, de modo que alcanzaran niveles finales de 10 ⁴ -10 ⁵ UFC/ml, y se incubaron a 37 ⁰ C, durante 48 h. Paralelamente, se analizaron controles en los que sólo se inoculó Ia bacteria contaminante. A distintos tiempos se tomaron alícuotas y se evaluó comparativamente Ia viabilidad de los microorganismos contaminantes en presencia o ausencia de Ia bifidobacteria bioprotectora. Los recuentos de Listeria se hicieron en agar Palcam (Merck, Darmstadt, Alemania) y los de Salmonella en agar Hektoen (Scharlau, Barcelona, España) incubando en aerobiosis a 30 y 37 ⁰ C, respectivamente, durante 48 h.

A fin de estudiar el efecto bioprotector de los compuestos antimicrobianos secretados al medio por las bifidobacterias y adicionados, en forma de extractos a Ia leche, previamente inoculada con el microorganismo contaminante (Listeria innocua; 10 ⁵ UFC/ml), se Ie añadieron 0.2 volúmenes del extracto obtenido en MRS-C, neutralizado y sin neutralizar. Se incubó a 37 ⁰ C durante 48 h. Paralelamente, se analizaron controles en los que se inoculó Ia bacteria contaminante y un volumen equivalente de medio no fermentado. Como en el caso anterior se evaluó Ia viabilidad del microorganismo contaminante a distintos tiempos mediante recuentos en placa.

Las cepas del género Bifidobacterium de Ia presente invención seleccionadas, así como sus metabolitos adicionados en forma de extractos, actúan como inhibidores del desarrollo de bacterias Gram-positivas y Gram- negativas en alimentos. Las bifidobacterias seleccionadas actuaron como cultivos bioprotectores en leche, reduciendo Ia viabilidad de Salmonella en, al menos, dos unidades logarítmicas y de Listeria en, al menos, seis (ver Tabla II). Los efectos protectores consecuencia directa de los metabolitos secretados por las bifidobacterias, se confirmaron por adición exclusiva a Ia leche contaminada de sus extractos. La adición de extractos no neutralizados, en los que se sumaría los efectos de los ácidos orgánicos y los de compuestos de naturaleza proteica, produjeron una reducción de los niveles de Listeria a valores inferiores a 100 UFC/ml y Ia adición de extractos neutralizados, con los que se evaluaría inicialmente el efecto de compuestos de naturaleza proteica, provocó

reducciones de Ia bacteria contaminante de, al menos, dos unidades logarítmicas. Por tanto, los compuestos de naturaleza proteica en forma de extractos así como los cultivos de las cepas del género Bifidobacterium que los producen pueden actuar, en alimentos como Ia leche, como bioprotectores inhibiendo el desarrollo de microorganismos contaminantes (Ejemplo 5).

Tabla II.- Representación del efecto inhibidor de las bifidobacterias seleccionadas sobre Listeria innocua y Salmonella typhimurium en co- cultivos en leche y por adición directa de los extractos, obtenidos a partir de los sobrenadantes de los cultivos de las bifidobacterias, a cultivos simples de cada uno de los microorganismos en leche.

Inoculo en leche Viabilidad del microorganismo contaminante (UFC/ml)

Tiempo de Incubación (h) O h 48 h

L.innocua 1 ,3x10 ⁵ 5,5 x10 ⁷

L.innocua+Bifidobacterium BIR-0326 1 ,3x10 ⁵ <10 ²

L.innocua+ medio no inoculado 6,0x10 ⁵ 4,4 x10 ⁸

L.innocua+ extracto neutralizado de

6,0x10 ⁵ 2,0x10 ⁶ Bifidobacterium BIR-0326 L.innocua+ extracto sin neutralizar de 6,0x10 ⁵ <10 ² Bifidobacterium BIR-0326

S. typhimurium 4,5x10 ⁴ 1 ,5x10 ⁵

S. typhimurium + Bifidobacterium BIR-

4,5x10 ⁴ <10 ² 0324