COMBINACIóN FARMACéUTICA PARA EL TRATAMIENTO Y/O QUIMIO SENSIBILIZACIóN DE TUMORES REFRACTARIOS A DROGAS

ANTICANCERíGENAS

Campo de Ia técnica:

La presente invención se encuadra dentro del campo de Ia oncología molecular y experimental, en particular con Ia descripción de una combinación farmacéutica dirigida al tratamiento y/o quimiosensibilización de tumores refractarios a los citostáticos convencionales.

Estado de Ia técnica anterior

En las últimas tres décadas el empleo de drogas químicas como citostáticos para el tratamiento del cáncer constituye una de las opciones de tratamiento de primera línea para algunos tumores sólidos y de origen hematopoiético. Entre las drogas químicas más comúnmente usadas en Ia terapia del cáncer se encuentran los platinos, taxanos, alcaloides de Ia vinca, doxorubicina, 5-fluorouracilo y ciclofosfamida entre otros, (Jackman A. L., Kaye S., Workman P. (2004) The combination of cytotoxic and molecularly targeted therapies-can it be done? Drug Discovery Today 1:445-454). Sin embargo, los resultados clínicos demuestran un bajo índice terapéutico para este tipo de droga en el tratamiento del cáncer y esto viene dado por un beneficio terapéutico marginal sumado a un marcado perfil de toxicidad en los pacientes (Schrader C ₁ et al. M. (2005) Symptoms and signs o fan acute myocardial ischemia caused by chemotherapy with paditaxel (taxol) in a patient with metastatic ovarían carcinoma. Eur J Med Res 10:498-501). Por ejemplo, muchos autores coinciden en que el cisplatino constituye Ia primera línea de tratamiento para el cáncer del pulmón y sin embargo Ia eficacia mostrada es sólo modesta y se traduce solamente en mejoría de los síntomas clínicos de Ia enfermedad e incremento de Ia supervivencia en 6 semanas (Grillo R., Oxman A., Julián J. (1993) Chemotherapy for advanced non-small cell luna cáncer. J Clin Oncol 11 :1866-1871 ; Bouquet PJ. , Chauvin F., et al (1993) Polychemotherapy in advanced non-small cell lung cáncer: a meta-analysis. Lancet 342:19-21). Por estas razones, las nuevas estrategias que se prevén en el futuro para lograr un tratamiento eficaz para el cáncer consisten en combinaciones farmacéuticas basadas en los citostáticos convencionales como los mencionados antes y nuevas

drogas dirigidas contra blancos moleculares involucrados en Ia transformación maligna. En Ia oncología moderna, existen varias drogas que clasifican en el término de drogas dirigidas contra blancos moleculares como son el Gleevec o Imatinib el cual incide sobre Ia kinasa AbI que juega un papel esencial en Leucemia Mieloide Crónica (Giles J. F., Cortes J. E., Kantarjian H. M. (2005) Targeting the Kínase Activity of the BCR-ABL Fusión Protein in Patients with Chronic Myeloid Leukemia. Current Mol Med 5:615-623), Iressa que es un compuesto dirigido contra Ia kinasa asociada al receptor para el Factor de Crecimiento Epidérmico (Onn A., Herbst R.S. (2005) Molecular targeted therapy for lung cáncer. Lancet 366:1507-1508) y el Velcade o Vortezomib, que bloquea Ia degradación proteica celular mediante su interacción con Ia maquinaria del prσteasome (Spano J. P., et al. (2005) Proteasome inhibition: a new approach for the treatment of malignancies. BuII Cáncer 92:E61-66), entre otros. Sobre Ia base de que los mecanismos de los citostáticos convencionales redundan en sus efectos antimitóticos inespecíficos, Ia alternativa de bloqueo directo de blancos moleculares mediante las nuevas drogas dirigidas, brinda a las combinaciones farmacéuticas una gran perspectiva para Ia obtención de sinergia de efecto antitumoral en el tratamiento del cáncer.

Por otro lado, el fenómeno de resistencia a los citostáticos convencionales por parte de las células tumorales es reconocido como Ia causa primaria del fracaso del tratamiento del cáncer con agentes quimioterapéuticos. A pesar de que Ia resistencia clínica en el cáncer puede estar influenciada por una inadecuada concentración de droga en el sitio tumoral, otros factores como los de origen celular juegan un papel preponderante en Ia quimioresistencia de muchos tumores. La resistencia de los tumores a los citostáticos es un fenómeno multifactorial que involucra múltiples mecanismos independientes e interrelacionados, entre los cuales se encuentran los mecanismos de destoxificación intracelular, cambios en Ia respuesta celular, tolerancia al estrés, y defecto en las rutas de señalización de apoptosis (Luqmani A. (2005) Mechanisms of drug resistance in cáncer chemotherapy. Med Prínc. Pract 14:35-48). Entre las proteínas fundamentales que median en el mecanismo de destoxificacion intracelular vinculado a Ia resistencia a citostático se encuentran la Glicoproteina-P y Ia Glutation S-transferasa (Saeki T., Tsuruo T., Sato W., Nishikawsa K. (2005) Drug resistance in chemotherapy for breast cáncer. Cáncer Chemother Pharmacol 56:84-89) (Hará T., et al. (2004) Gluthathione S-transferase P1 has protective effects on cell viability against

camptothecin. Cáncer Letters 203:199-207). Existen otras proteínas involucradas en los mecanismos de resistencia citados anteriormente y entre las cuales se encuentran las tubulinas de tipo beta localizadas en el citoesqueleto y cuyos niveles de abundancia se correlacionan directamente con la resistencia del tumor a los taxanos como es el Paclitaxel (Orr G.A., et al. (2003) Mechanisms of Taxol resistance related to microtubules. Oncogene 22:7280-7295). En cambio durante Ia resistencia al cisplatino se han observado otras proteínas como mediadoras de este fenómeno como son Ia T-plastina (Hisano T., et al. (1996) Increased expression of T-plastin gene in cisplatin-resistant human cáncer cells: identification by mRNA differential display. FEBS Letters 397:101-107), Ia Proteína de Respuesta Térmica (HSP70) y (HSP90) (Jaattela M. (1999) Escaping cell death:survival proteins in cáncer. Exp Cell Res 248:30-43) y el Factor de Trascripción YB1 (Fujita T., et al. (2005) Increased nuclear localization of transcription factor Y-box binding protein accompanied by up-regulation of P-glycoprotein in breast cáncer tpretreated with paclitaxel. Clin Cáncer Res 11:8837-8844). Adicionalmente, en el fenómeno de resistencia de tumores a los citostaticos se Ie ha atribuido un papel esencial a Ia ruta de Glicólisis y síntesis de piruvato Ia cual se ha encontrado exacerbada en células tumorales quimiorefractarias (Boros L.G., et al. (2004) Use of metabolic pathway flux information in targeted cáncer drug design. Drug Disc. Today 1 :435-443). Reportes de diferentes grupos en el mundo indican otra serie de proteínas vinculadas con Ia inhibición de apoptosis e incremento de Ia supervivencia de las células tumorales y las cuales en principio contribuyen en el fenómeno de Ia quimioresistencia de tumores. Tal es el ejemplo de Ia Nucleofosmina Ia cual juega un papel esencial en Ia promoción del ciclo celular, inhibición de apoptosis y constituye un marcador de mal pronóstico en cáncer (Ye K. (2005) Nucleophosmin/B23, a multifunctional protein that can regúlate apoptosis. Cáncer BIoI Ther 4:918-923), y Ia enzima CK2 que juega un papel determinante en el incremento de Ia supervivencia y resistencia de células tumorales a Ia apoptosis (Tawfic S., Yu S., Wang H., Faust R., Davis A., Ahmed K. (2001) Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histol. Histopathol. 16:573-582). Hallazgos de diferentes grupos en el mundo han confirmado Ia existencia de niveles elevados de CK2 en diversos tumores sólidos de origen epitelial en ordenes entre 3 y 7 veces respecto al tejido normal (Tawfic S., Yu S., et al. (2001) Protein kinase CK2 signal in neoplasia. Histol Histopatol. 16:573-582; Faust R. A., Gapany M., et al (1996) Elevated protein kinase

CK2 activity ¡n chromatin of head and neck tumors: association with malignant transformation. Cáncer Letters 101 :31-35), además de que Ia actividad de fosforilación por esta enzima es un evento celular importante en Ia transformación maligna y constituye un marcador de progresión del tumor (Seldin D.C., Leder P. (1995) Casein Kinase llα transgene-induced murine lymphoma: relation to theileroiosis ¡n cattle. Science 267:894-897). Así mismo, de connotada implicación para el proceso de desarrollo del cáncer han sido los hallazgos que demuestran que Ia fosforilación mediada por CK2 constituye una señal fuerte para Ia protección frente al fenómeno de apoptosis, razón por Ia cual se considera esta enzima como un mediador antiapoptótico en Ia fisiología celular (Ahmed K., Gerber D.A., Cochet C. (2002) Joining the cell survival squad: an emerging role for protein kinase CK2. Trends CeII Biol, 12:226-229; Torres J., Rodríguez J., et al (2003) Phosphorylation- regulated cleavage of the tumor suppressor PTEN by caspase-3: implications for the control of protein stability and PTEN-protein interactions. J Biol Chem, 278:30652- 60).

Sobre Ia base de los hallazgos anteriormente descritos se confirma que Ia fosforilación mediada por CK2 es un evento bioquímico que constituye un blanco potencial para Ia intervención terapéutica del cáncer y que inhibidores de tal evento, pueden constituir candidatos con perspectivas para el tratamiento de esta entidad. Hasta el momento diferentes grupos en el mundo han desarrollado estrategias para inhibir Ia fosforilación mediada por CK2 con el uso de dos acercamientos experimentales: a) La inhibición directa de Ia enzima o b) El bloqueo del sitio de fosforilación dentro del dominio acídico descrito para los sustratos de CK2 (patente WO 03/054002 y el trabajo de Perea S. E., et al. (2004) Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide impairing the phosphorylation by the protein kinase CK2. Cáncer Res. 64:7127-7129). En ambos procedimientos, los autores han demostrado el concepto de que Ia inhibición del evento de fosforilación mediado por esta kinasa conlleva a Ia inducción de apoptosis de células tumorales Io cual constituyen resultados de validación experimental de CK2 como blanco de interés en el desarrollo de fármacos para el tratamiento del cáncer.

Teniendo en cuenta los avances de Ia biología molecular y Ia proteómica comparativa se han logrado esclarecer en parte algunos de los mecanismos moleculares involucrados tanto en Ia transformación maligna como en el fenómeno

de resistencia a los citostáticos. Por este motivo, los diseños de los regímenes terapéuticos actuales para el tratamiento del cáncer deben estar dirigidos a combinaciones de medicamentos Io suficientemente efectiva y que reduzcan al máximo Ia toxicidad y Ia posibilidad del fracaso terapéutico producto del desarrollo de quimioresistencia.

Por Io tanto, un problema importante en Ia actualidad en relación con Ia terapia del cáncer es conseguir incrementar el índice terapéutico de los citostáticos mediante Ia reducción de Ia dosis efectiva y de los efectos tóxicos inherentes a este tipo de medicamentos, y por otro lado vencer Ia resistencia de los tumores a los citostáticos convencionales.

Explicación de Ia invención.

Esta invención resuelve el problema antes mencionado al proporcionar una combinación farmacéutica que incluye un inhibidor de Ia fosforilación de Ck2 como es el péptido P15 y un citostático farmacéuticamente aceptable para Ia terapia del cáncer.

En el contexto de esta invención, el término "citostático farmacéuticamente aceptable" incluye todos aquellos compuestos químicos usados en Ia quimioterapia del cáncer tanto para tumores sólidos como de origen hematopoiético. Los citostáticos preferidos son los platinos (ejemplo cisplatino y carboplatino), taxanos (ejemplo paclitaxel y docetaxel), alcaloides de Ia Vinca (ejemplo vincristina y vinblastina), 5-fluorouracilo, doxorubicina, ciclofosfamida, etoposide, mitomicina C, imatinib, iressa y el velcade (vortezomib) mezclados con excipientes o vehículos farmacéuticamente aceptables. El término inhibidor de Ia fosforilación de CK2 incluye también cualquier compuesto químico o peptídico que bloquee tanto a Ia enzima como a sus sustratos. Dependiendo de las circunstancias, a determinar en cada caso mediante los usuales ensayos farmacológicos y clínicos, los ingredientes activos de Ia combinación pueden administrarse simultáneamente, separadamente o secuencialmente. La administración de Ia combinación es posible por vía parenteral, tópica y oral.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al tratamiento y/o quimiosensibilización de tumores refractarios en un mamífero, especialmente el ser humano, que comprende Ia administración de cualquiera de las combinaciones farmacéuticas antes mencionadas. También es parte de Ia presente invención el uso

de los ingredientes de Ia combinación farmacéutica para Ia preparación de un medicamento para el tratamiento de Ia quimioresistencia de tumores y para Ia potenciación del efecto antitumoral de los citostáticos mencionados. El ejemplo 1 (Tabla 1) ilustra que las combinaciones de Ia presente invención producen un sinergismo de efecto antineoplásico in vitro. Así, Ia combinación simultanea de dosis sub-óptimas del péptido P15 con cisplatino, paclitaxel, doxorubicina, vincristina, etoposide, mitomicin C, 5-fluouracilo, imatinib, o iressa, logra reducir Ia dosis eficaz para cada uno de los citostáticos mencionados entre uno y dos órdenes de magnitud. Se entiende por dosis eficaz Ia dosis que produce el 50% del efecto deseado, en ensayos de proliferación celular in vitro se conoce también como Concentración Inhibitoria 50 (CI50). Consecuentemente, se entiende por dosis sub-óptimas las inferiores a Ia CI50. El ejemplo 2 ilustra Ia potenciación del efecto antitumoral in vivo de Ia combinación farmacéutica del péptido P15 y cisplatino (Figura 1A), ciclofosfamina (Figura 1B) y mitomicin C (Figura 1C). La combinación farmacéutica logra producir un efecto de regresión completa de Ia masa tumoral en un modelo animal relevante de cáncer como es el heterotransplante de tumor humano en ratones desnudos. Sin embargo, Ia administración de los ingredientes de Ia combinación farmacéutica como modalidad de monoterapia solo produce un efecto discreto de retardo en el crecimiento tumoral al compararlo con el grupo que recibió tratamiento con placebo.

De igual forma, Ia administración secuencial de los ingredientes de esta combinación farmacéutica permite observar un efecto quimiosensibilizante del péptido P15 sobre tumores tanto en modelos in vitro como in vivo. Se entiende por efecto quimiosensibilizante a Ia reducción de Ia dosis de citostático necesaria para producir el 50% del efecto antitumoral luego de un pretratamiento del tumor con el péptido P15. El ejemplo 3 (Tabla 2) ilustra el efecto quimiosensibilizante del péptido P15 sobre células tumorales donde se logra reducir Ia dosis eficaz de los citostáticos entre uno y dos órdenes de magnitud después de un pretratamiento de las células con el péptido P15. Similarmente, los resultados de Ia tabla 3 demuestran que Ia combinación farmacéutica administrada de manera secuencial tiene un efecto quimiosensibilizante in vitro sobre células originalmente resistentes a citostáticos. En esta invención se entiende por resistencia a citostáticos cuando el valor de Ia CI50 del producto en cuestión sobrepasa el valor de 1000 μM.

Consecuentemente, el pretratamiento con el ingrediente P15 in vivo, produce igualmente un efecto quimiosensibilizante sobre tumores inicialmente resistentes a los citostáticos (ejemplo 4) (Figura 2A, 2B ₁ 2C).

El péptido P15 (secuencia aminoacídica: CWMSPRHLGTC) uno de los ingredientes de Ia combinación farmacéutica de Ia presente invención ha sido previamente reportado como un inhibidor de Ia fosforilación de Ia enzima CK2 (Perea S.E., et al. (2004) Antitumor effect of a novel proapoptotic peptide impairing the phosphorylatiσn by the protein kinase CK2. Cáncer Res. 64:7127-7129). Sin embargo, Ia tabla 4 ilustra el efecto regulador inesperado de dicho péptido sobre un grupo de proteínas en células tumorales, las cuales confirman y explican tanto Ia potenciación del efecto antitumoral de Ia combinación farmacéutica como el efecto quimiosensibilizante del ingrediente P15. Por ejemplo, las proteínas reguladas por el ingrediente P15 juegan un papel esencial en el control de Ia proliferación de células tumorales y Ia inducción de apoptosis y estos mecanismos son independientes a los empleados por el resto de los ingredientes de Ia combinación farmacéutica como los citostáticos preferidos en Ia invención.

De igual forma, otras de las proteínas reguladas por el ingrediente P15 han sido involucradas previamente en los mecanismos de resistencia molecular de células tumorales al tratamiento con los citostáticos preferidos en esta invención. Estos hallazgos inesperados constituyen Ia confirmación a nivel molecular del efecto quimiosensilizante de Ia combinación farmacéutica cuando los ingredientes son administrados de manera secuencial.

Para el propósito de Ia presente invención, resulta crucial que las concentraciones eficaces de citostáticos en Ia combinación farmacéutica se reducen entre uno y dos órdenes de magnitud comparada con las observadas para los citostáticos solos. Esto significa que existe una sinergia entre el inhibidor de Ia fosforilación de Ia CK2 y los citostáticos preferidos para Ia combinación farmacéutica. Desde el punto de vista práctico, esta sinergia también significa que, Ia toxicidad del medicamento basado en una combinación P15 + citostáticos es menor que Ia toxicidad de un medicamento basado en citostáticos solamente.

De igual forma, para los propósitos de Ia invención, el efecto quimiosensibilizante que se manifiesta mediante Ia administración secuencial de los ingredientes representa una importante ventaja de esta combinación farmacéutica ya que permite

vencer la resistencia frecuentemente observada en tumores sólidos y de origen hematopoiético a los citostaticos preferidos en Ia presente invención.

Breve descripción de las Figuras: Figura 1 : Potenciación del efecto antitumoral de Ia combinación farmacéutica en un modelo animal de cáncer: (A) representa los resultados del sinergismo del cisplatino + P15, (B) representa los resultados del sinergismo de ciclofosfamida + P15, (C) representa los resultados del sinergismo ¡n vivo de mitomicin C + P15.

Figura 2: Efecto quimiosensibilizante del péptido P15 in vivo: (A) representa el efecto quimiosensibilizante al cisplatino, (B) al paclitaxel y (C) a Ia doxorubicina.

Exposición detallada de modos de realización / Ejemplos Métodos generales: Cultivos celulares: Las células H-125 provienen de un Carcinoma del pulmón Humano de Células No Pequeñas y las células SW948 son provenientes de un carcinoma de colon humano. Ambas líneas celulares fueron mantenidas en medio de cultivo RPMI 1640 (Gibco) suplementado con 10% de Suero Fetal Bovino y gentamicina a 50 μg/ml. Las condiciones de incubación fueron a 37 ⁰ C y 5% de CO ₂ . Determinación de viabilidad celular: Para este propósito se adicionaron 20 μl de una solución de sal de Tetrazolium (MTS) (Promega) a cada placa de 96 pocilios que contienen las células sembradas. Después de 2 horas a 37 ⁰ C, se realizó Ia lectura de Ia absorbencia a 492 nm. Finalmente, se calcularon los valores de Concentración Inhibitoria 50 (CI50) a partir de las respectivas curvas de dosis- respuesta usando un programa denominado "CurveExpert" apropiado para dicho análisis.

Modelo animal de cáncer: El modelo empleado en esta invención se basó en el implante de tumores de origen humano en ratones desnudos (Nu/Nu, BaIBC). Para estos propósitos, se inocularon subcutáneamente 5x10 ⁶ células H-125 resuspendidas en solución salina. Una vez prendido el tumor con aproximadamente 30 mm ³ de volumen se procedió a las diferentes variantes de tratamiento descritas posteriormente en los respectivos ejemplos de Ia invención. Para Ia evaluación del

efecto antitumoral se realizaron mediciones del volumen tumoral en cada animal, el cual fue calculado mediante Ia formula: V = ancho ² x largo/2. Análisis del perfil proteico en extractos nucleares: lnicialmente las células H-125 fueron tratadas o no con el ingrediente P15 de Ia combinación farmacéutica de Ia invención. El tratamiento se realizó durante 40 minutos en las condiciones de incubación referidas anteriormente. Seguidamente, se lavó Ia monocapa celular y se desprendieron las células con un barredor para ese propósito. Después de dos lavados en solución salina en frío, el sedimento celular final se resuspendió en 1OmM tris-HCI pH 7.5, 0.25M sucrosa, 1mM EGTA + cocktail de inhibidores de proteasas y se procedió a Ia obtención de Ia fracción proteica nuclear como fue previamente descrito (González L. J., et al (2003) Identification of nuclear proteins of small cell lung cáncer cell line H82: An improved protocol for the analysis of silver stained proteins. Electrophoresis 24:237-252). Para el análisis de las proteínas reguladas por el ingrediente P15, el extracto nuclear fue alternativamente resuelto en geles bidimensionales usando un rango de pH entre 4-7 y/o mediante cromatografía a través de Nano-HPLC y posterior Espectrometría de Masas. La presente invención se explica a través de los siguientes ejemplos de realización:

Ejemplo 1: Efecto sinérgico de Ia combinación del péptido P15 + citostáticos convencionales.

Se evaluó el sinergismo de efecto antineoplásico del ingrediente P15 combinado con un grupo de citostáticos por separado en las siguientes condiciones experimentales. Para este propósito, se cultivaron las células H-125 en placas de 96 pocilios en presencia del péptido P15 en un rango de concentraciones entre 10-50 μM. Simultáneamente, se adicionaron los citostáticos referidos en Ia invención en un rango de concentraciones que abarcó desde 1 hasta 2000 nM y la incubación se prolongó durante 72 horas. Al cabo de este tiempo, se procedió al revelado de Ia viabilidad celular mediante Ia adición de 20 μl de una solución de Tetrazolium (MTS) que se reduce en las mitocondrias de células vivas produciendo un cambio de color. Finalmente, Ia absorbancia a 492 se midió en cada caso y se construyeron las respectivas curvas dosis-respuesta. Los valores de concentración de droga eficaz de los citostáticos se refiere a Ia dosis que produce un 50% (CI50) del efecto antineoplásico y se calculó en cada caso a partir de las curvas dosis-respuesta y

usando el programa de computación adecuado para tal propósito (CurveExpert). Como se puede observar en Ia Tabla 1 , los valores de dosis antineoplásica eficaz o CI50 para cada citostático se reducen entre uno y dos órdenes de magnitud cuando estos se combinan de manera simultánea con el ingrediente P15 a 10 y 50 μM. Los resultados de estos ensayos demuestran una potenciación del efecto antineoplásico de Ia combinación farmacéutica compuesta por el péptido P15 y los citostáticos preferidos en esta invención.

Tabla 1. Sinergismo de efecto antineoplásico de Ia combinación farmacéutica administrada de manera simultanea.

Ejemplo 2: Potenciación del efecto antitumoral de Ia combinación farmacéutica en un modelo animal de cáncer.

Para este propósito, se inocularon 5x10 ⁶ de células H-125 por vía subcutánea en Ia región dorsal de ratones desnudos (BaIBc) de 6-8 semanas de edad. Al cabo de los 10 días cuando los tumores eran palpables (alrededor de 30 mm ³ ), se procedió a Ia administración de Ia combinación farmacéutica de Ia invención. La administración de los ingredientes de Ia combinación se realizó mediante Ia administración intraperitoneal del péptido P15 disuelto en solución salina a razón de 0.5 mg/kg/día durante 5 días y simultáneamente Ia inoculación intraperitoneal de 1 mg/kg/día de citostáticos como el cisplatino (Figura 1A), ciclofosfamida (Figura 1B) y Mitomicin C

(Figura 1C) en Ia misma frecuencia de tratamiento. Los citostaticos fueron también disueltos en solución salina. Finalmente, se midieron los volúmenes de masa tumoral en función del tiempo para evaluar el efecto antineoplásico in vivo. Los resultados mostrados en las Figuras 1A, 1 B y 1C indican que Ia combinación farmacéutica de Ia invención produce una potenciación del efecto antitumoral que se traduce en una regresión completa de Ia masa tumoral cuando ambos ingredientes son administrados de manera simultanea. Por el contrario, cuando los ingredientes son administrados como modalidad de monoterapia, sólo se observa un efecto antitumoral discreto respecto al grupo tratado con el placebo. De esta manera se demuestra que Ia interacción sinérgica entre los ingredientes de Ia combinación farmacéutica de Ia invención se manifiesta además in vivo según los resultados de un modelo preclínico relevante y predictivo para cáncer.

Ejemplo 3: Efecto quimiosensibilizante del péptido P15 in vitro. En estos ensayos se evaluó el papel quimiosensibilzante de Ia combinación farmacéutica de Ia invención cuando los ingredientes de Ia misma son administrados de manera secuencial. Para este propósito, las células H-125 se sembraron a razón de 2000 células por pocilios en placas de 96 pocilios y al cabo de 24 horas se añadió el péptido P15 a una concentración de 20 μM. Seguidamente, al cabo de las 16 horas de incubación con el ingrediente P15 se desechó el contenido de cada pocilio y se realizaron dos lavados de las células con solución salina. Finalmente, se adicionaron a los pocilios diferentes citostaticos en un rango de dosis entre 1 y 2000 nM y Ia incubación se prolongó durante 72 horas mas. Al finalizar los ensayos, Ia viabilidad celular se reveló como se indicó previamente en el ejemplo 1 , e igualmente se calcularon los valores de CI50 para los citostaticos. Los resultados de Ia tabla 2 demostraron que el pre-tratamiento de estas células tumorales con el ingrediente P15 es capaz de incrementar Ia sensibilidad de dichas células frente a los citostaticos preferidos en Ia invención. Adicionalmente, se evaluó el efecto del pre-tratamiento con el ingrediente P15 de células SW948 las cuales son originalmente resistentes al efecto de los citostáticos. Los resultados demostraron que el péptido P15 igualmente sensibiliza a células tumorales que originalmente son resistentes al grupo de citostáticos referidos en Ia invención (Tabla 3).

Estos resultados demuestran que al administrar el ingrediente P15 de forma secuencial respecto a los citostáticos preferidos de Ia invención, se obtiene un efecto de sensibilización de las células tumorales al efecto antineoplásico de dichos citostáticos.

Tabla 2. Efecto quimiosensibilizante in vitro de Ia combinación farmacéutica administrada de manera secuencial

Tabla 3. Efecto quimiosensibilizante de Ia combinación farmacéutica administrada de manera secuencial sobre células originalmente quimioresistentes.

El efecto quimiosensibilizante del ingrediente P15 es además corroborado por el perfil proteico que este péptido regula en las células tumorales ensayadas. Para este propósito se analizaron los extractos nucleares provenientes de células H-125 tratadas o no con el péptido P15 durante solo 40 minutos mediante cromatografía de Nano HPLC y posterior Espectrometría de Masas. Los resultados de Ia tabla 4 ilustran un conjunto de proteínas que son reguladas en presencia del ingrediente P15 y que por su naturaleza funcional confirman y justifican al nivel molecular el

papel quimiosensibiltante de este péptido en Ia combinación farmacéutica de Ia invención.

Tabla 4. Perfil proteico regulado por el ingrediente P15

Ejemplo 4: Efecto quimiosensibilizante del péptido P15 in vivo.

Para este propósito, se inocularon 5x10 ⁶ de células SW948 por vía subcutánea en Ia región dorsal de ratones desnudos (BaIBc) de 6-8 semanas de edad. Al cabo de los 10 días cuando los tumores eran palpables (alrededor de 30 mm ³ ), se procedió a Ia administración de Ia combinación farmacéutica de Ia invención de manera secuencial. Primero se administró el ingrediente P15 a razón de 0.5 mg/kg/día durante 5 días, por vía intraperitoneal y seguidamente se administró el cisplatino (Figura 2A), el Paclitaxel (Figura 2B) y Ia doxorubicina (Figura 2C) a dosis de 5 mg/kg/dia durante otros 5 días. Los resultados demuestran que el pre-tratamiento in

vivo con el ingrediente P15 del tumor quimiorefractario es capaz de revertir tal fenómeno de resistencia incrementándose así Ia capacidad de respuesta del tumor hacia los citostaticos evaluados. Estos hallazgos constituyen Ia demostración de Ia capacidad de Ia combinación farmacéutica de Ia invención de revertir Ia resistencia de tumores inicialmente quimiorefractarios cuando esta se administra de manera secuencial.